CN106566881B - 利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山羊产羔数的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山羊产羔数的分子标记方法，该方法以山羊基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用对引物P1在PCR条件下进行扩增含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶(ADAMTS1)基因外显子2，采用DNA测序技术检测外显子2的单核苷酸的多态性(SNP)，测序结果发现引物P1扩增位点存在1个碱基的突变，然后对引物P1的扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与河南奶山羊和西农萨能奶山羊的产羔性状之间进行关联分析；结果表明：ADAMTS1基因外显子2由引物P1检测的SNP位点可用作山羊产羔数性状选择的分子标记。

Description

利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山 羊产羔数的分子标记方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山羊产羔数的分子标记方法。

背景技术

随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction)技术的问世和电泳技术的改进，各种分子遗传标记技术随之兴起，这些技术给家畜的遗传改良和新品种的培育提供了新的途径和方法。特别是分子标记技术与常规育种技术相结合，孕育出一种全新的选种方式，即标记辅助选择法(Marker assistantselection)。它可以克服传统选种过程中根据表型选择导致的环境偏差和抽样误差，提高家畜选种的准确性和高效性，加快优良品种的选育，进一步推动我国畜牧业的发展。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)以及颠换(嘌呤与嘧啶互换)所引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG(核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能，从而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶(ADAMTS1)基因是新近发现的可能影响排卵数的基因。ADAMTS1位于山羊1号染色体上，功能蛋白包括6个结构域：前金属蛋白酶(pro-metalloproteinase)、解聚素样(disintegrin-like)结构域、金属蛋白酶(metalloproteinase)、含TSP-I的血小板反应素同源域(thrombospondin homologousdomain containing TSP type I motifs)、C-末端TSP元件(COOH-terminal TSPsubmotifs)雨l间隔区(spacer region)。在研究敲除雌性小鼠的ADAMTS1中发现雌性生殖器官发生不同程度的畸形和繁殖能力下降，多数表现为子宫增厚呈卷曲状，子宫内形成大量的囊泡，生长卵泡和卵母细胞明显减少，不排卵的卵泡增多，且可以见大量的闭锁卵泡。Mittaz等在注射人绒毛膜促性腺激素(Human chorion icgonadotropin,HCG)后12h检查小鼠卵巢，发现ADAMTS1基因缺陷小鼠没有观察剑扩张的卵泡卵丘复合物，而野生型小鼠卵巢内大多数卵泡已经排出了卵母细胞，对即将排山的卵泡卵丘基质进行研究观察发现：与同窝野生型小鼠相比，ADAMTSl基因缺陷小鼠卵巢内形成了一些基质，但卵基质扩张的程度很小，在注射HCG后16h，野生型小鼠卵巢的卵泡中没有卯母细胞，而在ADAMTSl基因缺陷的小鼠仍然存在大量的卵泡；注射hCG 16h-24h后，从收集的卵母细胞可知，与野生型小鼠相比，在ADAMTSl基因缺陷小鼠的输卵管中卵母细胞的数量大量减少；当注射hCG 24h-48h后再检查ADAMTS1基因缺陷小鼠和野生型小鼠卵巢排卵后的黄体，发现在ADAMTSI基因缺陷小鼠的黄体中能够观察到被包围着的卵母细胞，在野生型小鼠正常的黄体中没有观察剑任何卵母细胞，这些结果表明ADAMTS1基因缺陷小鼠的卵巢功能缺陷主要是由于排卵能力受损，不能排出卵母细胞。Russell在野生型小鼠和基因敲除(PRKO)小鼠以及ADAMTS1表达正常但是有排卵障碍的缺陷的小鼠中比较多功能蛋白聚糖的加工处理，观察发现多功能蛋白聚糖的细胞外加工处理在PRKO小鼠人人降低，ADAMTS1在卵丘-卵母细胞复合体的扩张和排卵的过样能够特异性地积聚于卵丘-卵母细胞复合体的基质，多功能蛋白聚糖也选择性的定位于卵丘-卵母细胞复合体的基质内，多功能蛋白聚糖V1是ADAMTS1裂解的底物，此外PRKO小鼠注射PMSG/HCG 12h后没有检测到ADAMTS1的表达，这些研究表明ADAMTS1在排卵过科中的功能就是裂解卵丘-卵母细胞复合体基质多功能蛋白聚糖。这与Tortorella发现ADAMTS1能够降解聚集蛋白聚糖、硫酸软骨素糖蛋白和多功能蛋白聚糖相一致。Russell等还发现注射hCG12-16h后在卵丘-卵母细胞复合体的基质观察到大量的多功能蛋白聚糖的裂解，此时正是卵丘-卵母细胞复合体排入输卵管的时候，同时ADAMTSl继续在排出的卵丘细胞上表达。因此，ADAMTS1通过裂解多功能蛋白聚糖在排卵后能够快速破坏卵丘-卵母细胞复合体基质的结构完整性。ADAMTS1通过调节多功能蛋向聚糖和卵丘-卵母细胞复合体的基质来引导卵匠复合物更易于排山。蛋白聚糖具有抑制一些生长因子和促性腺激素的作用，因此ADAMTS1能够增加生长因子和促性腺激素的生物活性。总之，ADAMTS1的缺乏会导致雌性生殖能力降低，但并不影响雌性的发情周期和受精卵的着床。ADAMTS1基因缺陷的雌性小鼠的生育力低下是由于排卵障碍所引起的，致使释放出米的卵母细胞数目减少。因此ADAMTSI是排卵过群中不可或缺的重要的蛋白酶。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山羊产羔性状的分子标记方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山羊产羔性状的分子标记方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1在PCR条件下进行扩增，筛查山羊ADAMTS1基因外显子2的碱基突变；

所述的引物P1如下：

上游引物1F：5′-GTGAGCCTGGTGGTGGTA-3′；

下游引物1R：5'-AATCGCGGTGTCATAGTG-3'；

所述的PCR扩增的条件是：15μL的PCR反应体系：DNA模板50ng，7.5μl 2×TaqMasterMix，上下游引物(10μM)各0.3μl，加灭菌水至15μl。

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃30s，退火温度50℃，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

所述利用引物P1的PCR扩增反应程序如下：

95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2)采用DNA测序技术检测引物P1扩增的PCR扩增产物，然后对引物P1的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与河南奶山羊和西农萨能奶山羊的产羔性状之间进行关联分析，结果如下：

纯合型TT在2016bp位的碱基是T，杂合型TC在2016bp位的碱基是T\C，杂合型CC在2016bp位的碱基是C。

本发明以采取检测含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶(ADAMTS1)基因外显子2碱基突变多态性，并分析多态性与河南奶山羊和西农萨能奶山羊的产羔性状之间的关系；结果表明：ADAMTS1基因外显子2由引物P1检测的SNP位点可用作山羊产羔性状选择的分子标记。

与现有技术相比，具有以下技术效果：

明确了与山羊产羔性状相关的功能基因ADAMTS1基因外显子2的1个SNP，其中T→C的突变个能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

本发明的方法为ADAMTS1基因的SNP与山羊产羔性状关系的建立奠定了基础，以便用于山羊产羔性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

附图说明

图1是利用引物P1扩增ADAMTS1基因外显子2的DNA测序图。

以下通过对山羊样本采集及基因组DNA提取、检测和浓度分析、山羊ADAMTS1基因外显子2扩增产物的DNA测序分析实施例来进一步对本发明作详细说明。

具体实施方式

A、ADAMTS1基因外显子2的PCR扩增及其多态性的检测

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样5mL，加入0.2μL的ACD(柠檬酸2.4g，柠檬酸三钠6.6g，葡萄糖7.35g，定容至50mL，高压灭菌)抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本实施例采用2个山羊群体共计506个母羊血样，具体为：西农萨能羊血样263份；河南奶山羊血样243，采自河南省奶山羊养殖基地。

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌，调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用浓度为70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

(11)5℃保温10h左右。

(12)用苯酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)混合物和氯仿分别抽提一次，其中的苯酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)混合物和氯仿等体积。

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

(15)倒掉液体，用浓度为70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(μg/mL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从西农萨能奶山羊263个个体、浓度为50ng/μL的DNA的样品中取5μL混合构建成DNA池；按照同样的方法构建河南奶山羊的DNA池。

4、PCR扩增引物设计

根据NCBI上GenBank提供的山羊Kisspeptin基因的序列(登录号：GU142847.1)设计引物P1，在PCR条件下扩增内含子2筛查山羊Kisspeptin基因P1位点的突变。

引物P1如下：

上游引物1F：5′-GTGAGCCTGGTGGTGGTA-3′；

下游引物1R：5'-AATCGCGGTGTCATAGTG-3'；

5、PCR扩增山羊ADAMTS1基因外显子2

分别以2个山羊群体的DNA池为模版，以引物P1进行PCR扩增，反应条件及程序如下所示：

PCR扩增的条件是：15μL的PCR反应体系包括DNA模板50ng，7.5μl 2×TaqMasterMix，上下游引物(10μM)各0.3μl，加灭菌水至15μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃30s，退火温度50℃，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR反应程序如下：

利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

6、PCR产物测序

把以上以2个山羊群体DNA池为模板的PCR产物送上海生物工程有限公司进行双向测序，对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰是发生了单核苷酸突变；在西农萨能和河南奶山羊群体中，发现引物P1扩增位点存在1个碱基的突变，即2016bp处有一个T→C的突变。

B、2个山羊群体的SNP分型

在西农萨能奶山羊群体中，分别以263个山羊的单独DNA为模版，利用引物P1进行PCR扩增，PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序，检测不同个体的基因型，对西农萨能奶山羊群体进行SNP分型。用相同的方法对河南奶山羊群体进行SNP分型。

D、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；3个羊群体不同多态位点的基因型分布、等位基因频率的统计分析结果如表1所示。

E、群体平衡性检验

某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性检测采用皮尔逊χ²统计量，其公式为：

其中，m为某一遗传位点基因型应有个数；i为基因型序号；f_i代表第i个基因型的实际个体数量；n为样本数量；p_i代表第i个基因型的理论频率。

山羊ADAMTS1基因外显子2(利用引物P1)SNP的基因型分布、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡如表1所示。

表1：2个山羊品种的ADAMTS1基因外显子2的遗传结构分析

由表1可以看出，在P1位点，西农萨能和河南奶山羊群体属于中度多态性。河南奶山羊在P1位点均处于哈代温伯格不平衡状态。

F、山羊ADAMTS1基因外显子2效应的关联分析

生产数据：西农萨能奶山羊和河南奶山羊第1、2、3和4胎的产羔数。

关联分析样本：有完整产羔性状记录的河南奶山羊243头、西农萨能奶山羊263头。

关联分析模型：

利用SPSS(16.0)软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。

在数据处理中，根据影产羔性状的因素不同，考虑到场效应(Farm)、品种效应(Breed)、种公畜效应(S)、种公畜内母畜间效应(SD)、年龄(Age)、基因型效应(Genotype)及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：

y_ijkmnpq＝μ+Farm_i+Breed_j+S_p+SD_q+Age_k+Genotype_m+X_n+e_ijkmnpq

其中：y_ijkmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farm_i：场别效应；Breed_j：品种效应；S_p：种公畜效应；SD_q：种公畜内母畜间效应；Age_k：年龄效应；Genotype_m：标记基因型效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应,如：Farm×Breed，Farm×Age，Farm×Genotype，Breed×Age，Breed×Genotype，Age×Genotype，Breed×Age×Genogype等；e_ijkmnpq：随机误差；运用SPSS(16.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间产羔性状指标进行差异显著性检验。分析结果如表2所示：

表2：西农萨能奶山羊和河南奶山羊品种的ADAMTS1基因不同基因型与产羔数的关联分析

统计结果显示，采用引物P1扩增的山羊ADAMTS1基因外显子2与河南奶山羊及其西农萨能奶山羊的产羔性状显著相关，在2个品种的平均产羔数种，TT基因型山羊的平均产羔性状显著高于CC基因型山羊(P<0.05)；因此，用引物P1检测的SNP位点可用作山羊产羔性状选择的分子标记。

Claims (1)

1.一种利用含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶基因选择山羊产羔数的分子标记方法，其特征在于，所述的山羊为西农萨能奶山羊和河南奶山羊，包括下列步骤：

1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1在PCR条件下进行扩增，筛查山羊ADAMTS1基因外显子2的碱基突变；

所述的引物P1如下：

上游引物1F：5′-GTGAGCCTGGTGGTGGTA-3′；

下游引物1R：5'-AATCGCGGTGTCATAGTG-3'；

所述的PCR扩增的条件是：15μL的PCR反应体系：DNA模板50ng，7.5μl 2×TaqMasterMix，上下游引物各0.3μl，加灭菌水至15μl；

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃30s，退火温度50℃，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min；

所述的利用引物P1PCR扩增反应程序如下：

95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2)采用DNA测序技术检测引物P1扩增的PCR扩增产物，然后对引物P1的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与河南奶山羊和西农萨能奶山羊的产羔性状之间进行关联分析，结果如下：

纯合型TT在2016bp位的碱基是T，杂合型TC在2016bp位的碱基是T\C，纯合型CC在2016bp位的碱基是C，纯合型TT基因型山羊的平均产羔性状高于纯合型CC基因型山羊。

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