CN106544352A

CN106544352A - 一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌

Info

Publication number: CN106544352A
Application number: CN201610924817.7A
Authority: CN
Inventors: 姜延龙; 王春凤; 刘晶
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2016-10-30
Filing date: 2016-10-30
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8‑ FnBPA，构建可锚定表达在植物乳杆菌表面的两种侵入型重组融合蛋白，一种是诱导型的乳酸菌NC8‑pSIP409‑FnBPA，一种是组成型的乳酸菌NC8‑pLc23‑FnBPA。通过侵袭细胞试验证明侵入型的NC8‑pSIP409‑FnBPA和NC8‑pLc23‑FnBPA对猪肠上皮细胞IPEC‑J2的侵袭能力有一定的作用。其能够作为DNA疫苗的载体，更好的递送DNA，进一步提高DNA疫苗的免疫效果，并对DNA疫苗传递载体的选择具有潜在价值。

Description

一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌。

背景技术

乳酸菌属于食品级的细菌，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种常见的乳酸菌，并在工业乳酸发酵以及医疗保健等领域有着较为广泛的应用。该菌种革兰氏染色呈阳性，培养条件为厌氧或兼性厌氧，可在pH值4.5～9.5的培养基中生长，最适生长温度为30～35℃，能耐受10℃左右的低温环境，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，它们常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白运载系统，能够在体内和体外传递质粒。其本身可作为DNA疫苗载体，但是没有侵入能力，因此递送DNA的能力不强；而一些弱致病菌如减毒沙门氏菌由于其可侵入到细胞中，可以更好的递送DNA。因此可模拟病原菌的侵入过程，以构建侵入型重组乳酸菌，使其具有更好的递送能力。

pSIP409质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备pUC（pGEM）（来源于大肠杆菌（Escherichia coli））和256rep（来源于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达（Medina, et al., 2011）。pSIP系列质粒载体所表达的外源蛋白基本分泌于细胞质内（Cortes-Perez, et al,. 2007）,虽然乳酸杆菌的细胞壁较薄，但它仍然是胞内蛋白在胞外发挥作用的最大阻碍。另外，一些外源蛋白自身携带的毒性物质会给菌株造成严重的代谢负担，这极大影响蛋白作用的发挥。因此，需要构建具有锚定表达功能的侵入型重组乳酸菌以解决外源蛋白胞外转运的问题。

表达外源侵入蛋白的乳酸菌能高效递送DNA疫苗，FnBPA为来源于金黄色葡萄球菌（G+）的外源侵入性蛋白，金黄色葡萄球菌是一种具有侵入宿主细胞能力的病原菌，其细菌表面表达的纤连蛋白结合蛋白A（FnBPA）对其侵入能力至关重要，在乳酸乳球菌中表达外源FnBPA后将使乳球菌本身获得侵入细胞的能力。

发明内容

本发明的目的是为了更好的递送DNA、提高DNA疫苗的免疫效果，而提供一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8- FnBPA及应用。

一种重组质粒pSIP409-FnBPA，它是在pSIP409插入了FnBPA，所述的FnBPA它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

一种重组质粒pLc23-FnBPA，它是以pSIP409为模板，用引物：

409’-F: ataAAGCTTCAAATTACAGCACGTGTTG

409’-R: tgcGGTACCGTCGACCCCGGTCTCCATTC

扩增，获得pSIP409’； pSIP409’与pOri23-FnBPA连接，所述的pOri23-FnBPA的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8- FnBPA，它是转染了上述的一种重组质粒pSIP409-FnBPA的乳酸菌NC8。

一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA，它是转染了上述的一种重组质粒pLc23-FnBPA。

一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8- FnBPA侵入猪肠上皮细胞的用途。

一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA侵入猪肠上皮细胞的用途。

本发明提供了一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8- FnBPA，构建可锚定表达在植物乳杆菌表面的两种侵入型重组融合蛋白，一种是诱导型的乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA，具有诱导型启动子Spp，只有在SppIP诱导时，蛋白才得以表达；一种是组成型的乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA，表达载体上缺少Spp序列，不需SppIP，蛋白直接就可表达。通过侵袭细胞试验证明侵入型的NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA对猪肠上皮细胞IPEC-J2的侵袭能力有一定的作用。本发明的最终目的是使其能够作为DNA疫苗的载体，更好的递送DNA，进一步提高DNA疫苗的免疫效果，并对DNA疫苗传递载体的选择具有潜在价值。

附图说明

图1：基因FnBPA-D的PCR扩增结果（Marker从上到下为：2000、1000、750、500、250、100 bp。）；

图2：重组质粒pET28a- FnBPA-D采用EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定结果（M：DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp）；

图3: SDS-PAGE检测结果（1:对照; 2:pET28a-FnBPA-D纯化后的蛋白; 3:pET28a-FnBPA-D纯化前的蛋白；M：低分子量蛋白标准，从上到下分子量依次为：170、130、100、70、55、40、35、25、15、10KD）；（图片中条带位置大于14KD）

图4：基因FnBPA的PCR扩增结果（Marker从上到下为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100 bp）；

图5：基因pOri23-FnBPA的PCR扩增结果（Marker从上到下为：5000、3000、2000、1500、1000、750 、500、250、100 bp）；

图6：载体pSIP409’的PCR扩增结果（Marker从上到下为：5000、3000、2000、1500、1000、750 、500、250、100 bp）；

图7：载体pSIP409用NcoⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定结果（M1: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 、9416 、6557 、4361 、2322 、2027 、564、125 bp；M2：2000、1000、750、500、250、100bp）；

图8：载体 pSIP409的酶切回收结果（M: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 、9416 、6557 、4361 、2322 、2027 、564、125bp）；

图9：重组质粒pSIP409-FnBPA采用NcoⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定结果（M1: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 、9416 、6557 、4361 、2322 、2027 、564、125bp；M2：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp）；

图10：重组质粒pLc23-FnBPA采用KpnⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定结果（M：DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp）；

图11：NC8-pSIP409-FnBPA采用NcoⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定结果（M1: DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：23320 、9416 、6557 、4361 、2322 、2027 、564、125bp。M2：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp）；

图12：NC8-pLc23-FnBPA采用KpnⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定结果（M：DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp）；

图13：pSIP409-FnBPA和pLc23-FnBPA 在植物乳杆菌NC8中表达的Western-blot检测结果（1:NC8-pSIP-409空载体对照；2:NC8-pSIP409-FnBPA；3:NC8-pLc23-FnBPA；M：低分子量蛋白标准，从上到下分子量依次为：170、130、100、70KD）；

图14：侵入细胞前后活菌数柱形图。

具体实施方式

实施例1 anti-FnBPA抗体的制备

１.主要实验材料及分子生物学试剂

⑴菌株及质粒载体

pet28a载体片段的回收产物（酶切位点EcoRⅠ/HindⅢ）以及pUC57-pOri23-FnBPA的菌种和质粒由吉林农业大学动物微生态实验室保存。

⑵主要材料及试剂

普通质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自OMEGA公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，DL2000 marker、DL5000 marker、λ-HindⅢ marker，4×Protein SDS PAGE LoadingBuffer由宝生物（Takara）公司提供；大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；卡那霉素购自鼎国公司；低分子量蛋白质标准PageRuler Prestained ProteinLadder购自Thermo公司;其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

⑶培养基

大肠杆菌用LB培养基。

２.目的基因FnBPA-D的PCR扩增

⑴引物的设计与合成

FA-D-F- EcoR I: ataGAATTCGGCCAGAATTCAGGCAAC

FA-D-R- HindⅢ: tgcAAGCTTAATAGTCTGTTGGCCCTC

⑵目的基因FnBPA-D的PCR扩增与克隆

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

c. PCR电泳结果，如图1所示，分子量大小为372bp。

d. PCR产物的回收与纯化

采用DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收

e.将胶回收产物分别进行双酶切

酶切体系如下：

37℃酶切过夜

f .使用DNA纯化回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化。

３.酶切后的目的基因FnBPA-D与表达载体pET28a连接

a.连接体系如下：

连接仪上16℃连接过夜，次日转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴6min，加入600μl的LB液体培养基中，放于摇床中，37℃，220rpm，1h，取出100μl菌液加入LB固体培养基（LB中卡那霉素的终浓度是50μg/ml）中。37℃温箱培养过夜，待其长出菌落，挑取单克隆于5ml LB液体培养基（卡那霉素的终浓度是50μg/ml）中，放于摇床中，37℃，180rpm，过夜培养。采用OMEGA质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取重组质粒。

b.对重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃水浴锅中酶切2h，将酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果，如图2所示。FnBPA-D其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

４.目的蛋白FnBPA-D的诱导表达、纯化及其SDS-PAGE的检测

⑴目的蛋白的诱导表达

将pET28a-FnBPA-D的重组菌取出1ml加入到50ml LB液体培养基中，加入相应的卡那霉素，放于摇床中，37℃，180rpm，待其OD值到达0.4时，加入IPTG诱导物（终浓度500μg/ml）放于摇床中诱导过夜。

⑵ 蛋白样的处理

使用50ml的离心管，装20ml的对应菌液，4000rpm离心20分钟，弃去上清，将沉淀放于冰上，在其中加入1ml的结合液（含溶菌酶）混匀后吸入到1.5ml EP管中，加入25μl的PMSF，再加入1μl的benzonase混匀，冰上放置30分钟后，4℃ 14000g离心10分钟，其中上清取出150μl加入50 μl的4×Protein SDS PAGE Loading Buffer留用，沉淀用450μl ddH2O悬起后加入150μl 4×Protein SDS PAGE Loading Buffer备用。

⑶目的蛋白的纯化

①将Ni-Agarose介质充分混匀，加入200μl（50％介质浓度）介质和保存液混合物到预放了一片筛板的层析柱中。

②用1ml去离子水洗柱，共三次。

③用1ml去新配结合液洗柱，共三次。

结合液配方(10ml)

④将上清上样，通过重力使裂解液自然流出。

⑤用1ml结合液洗柱，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照。）

⑥用一步式洗脱法。用500μl新配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含His标记蛋白）。洗脱液配方（以1ml体积和最佳浓度是500mM为例）：

⑦分别用500μl结合液，1ml去离子水和500μl自备20%乙醇洗柱一次，最后堵住层析柱下端漏口，加500μl 20%乙醇将介质淹没，4℃保存备用。

⑧将洗脱液洗下的蛋白样品取出150μl加入50μL 4×SDS buffer混匀，100℃煮沸十分钟，12000rpm离心2分钟，取上清进行SDS-PAGE。

⑷SDS-PAGE检测

①12%分离胶(3ml):分别取30%丙烯酰胺溶液1.20ml、双蒸水0.99ml、1.5mol/L Tris-Cl (pH8.8) 0.75ml、10% SDS 溶液 30μl、10%过硫酸铵 30μl、TEMED 3μl,混匀后灌入垂直板。

②5%浓缩胶(2ml):分别取双蒸水1.35ml、30%丙烯酰胺溶液0.335ml、l.0mol/LTris-Cl (pH6.7) 0.25ml、10%SDS 溶液 20μl、10%过硫酸铵 20μl、TEMED 2.5μl,混匀后，灌入垂直板(待浓缩胶凝固约30min)并插入梳子。

③待浓缩胶完全凝固(约20min),缓缓取下梳子,取上清,每孔上样15μl,恒压条件下开始电泳,浓缩胶时使用80v，分离胶时使用160v，待溴酚蓝迁移至凝胶底部时，结束电泳。

④取出凝胶至于考马斯亮兰染色液中，放于脱色摇床中进行染色45分钟。

⑤染色结束后使用脱色液进行脱色，频繁更换脱色液，脱色过夜，然后进行上机检测。

⑸SDS-PAGE检测结果，如图3所示，蛋白大小为14KD。

５.使用BCA试剂盒对目的蛋白FnBPA-D的浓度进行检测

⑴蛋白标准品的制备

a.取1.2ml蛋白标准配制液加到1管蛋白标准（30mg BSA）中，充分溶解后配置25mg/ml的蛋白标准溶液。

b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度0.5mg/ml。如20μl 25mg/ml蛋白标准，加980μl稀释液即可配成。

⑵ BCA工作液的配制

按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

⑶蛋白浓度检测

a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准孔中，加标准稀释液补足到20μl，相当于浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

b. 加2μl的样品加到96孔板的样品孔中，加18μl的标准品稀释液补足20μl。

c.各孔加200μl BCA工作液，37℃放置20min。

d.用酶标仪测定A562的吸光度。

⑷根据标准曲线和使用的样品体积计算出FnBPA-D的蛋白浓度0.6mg/ml

６.纯化后的蛋白对新西兰兔进行免疫以制备高免血清

具体免疫方案如下：

三免之后一周，进行心脏采血，4℃，5000rpm，离心10分钟，抽取血清，即为anti-FnBPA抗体，将血清分装，-80℃储存备用。

实施例2侵入型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA的构建

１.主要实验材料及分子生物学试剂

⑴菌株及质粒载体

大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒载体 pSIP-409和 LB.plantarumNC8由 Senior RsearehScientist Norwegian Food Researehlnstitute 的 Dr.Lars Axelsson 赠送，植物乳杆菌NC8感受态由吉林农业大学动物微生态实验室制备并保存。

⑵主要材料及试剂

红霉素为Amresco公司分装；电转杯由Bio-Rad公司提供；聚偏二氟乙烯膜 (PVDF膜)购自Whatman公司; 辣根酶标记的山羊抗兔lgG购自鼎国公司;低分子量蛋白质标准购自上海生工生物工程有限公司;其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

⑶培养基

乳酸菌专用MRS培养基，大肠杆菌用LB培养基。

２.目的基因FnBPA、pOri23-FnBPA以及载体pSIP409’的PCR扩增

⑴引物的设计与合成

FnBPA的上下游引物：

FA-F- NcoⅠ: ataCCATGGAAGTTAAAAACAACTTGCG

FA-R- HindⅢ: tgcAAGCTTTTAAGCCTTATGGTTTTTC

pOri23-FA的上下游引物：

pOri23-FA-F- KpnⅠ: ataGGTACCGAAAAGCCCTGACAACCC

pOri23-FA-R- HindⅢ: tgcAAGCTTTTAAGCCTTATGGTTTTTC

pSIP409’(无诱导型启动子)的上下游引物：

409’-F- HindⅢ: ataAAGCTTCAAATTACAGCACGTGTTG

409’-R- KpnⅠ: tgcGGTACCGTCGACCCCGGTCTCCATTC

⑵目的基因FnBPA、pOri23-FnBPA以及载体pSIP409’的PCR扩增与克隆

①FnBPA：

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

b. PCR电泳，结果如图4所示，分子量大小为3069bp。FnBPA其碱基序列SEQ ID NO.2所示。

②pOri23-FnBPA

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

c. PCR电泳结果，如图5所示，分子量大小为3283bp。pOri23-FnBPA其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

③pSIP409’：

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

c. PCR电泳结果，如图6所示，分子量大小为2886bp。

d. PCR产物的回收与纯化

采用DNA凝胶回收试剂盒对三个PCR产物进行胶回收

e.将胶回收产物分别进行双酶切

酶切体系如下：

37℃酶切过夜

f .使用DNA纯化回收试剂盒对酶切产物e进行回收纯化。

３.酶切后的目的基因FnBPA和pOri23-FnBPA分别与表达载体pSIP409 、pSIP409’连接

⑴pSIP409载体的双酶切

a. 酶切体系如下：

37℃水浴锅中酶切2h

b. 对双酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切后的电泳图，如图7所示。

c.采用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，如图8所示。

⑵构建pSIP409-FnBPA和pLc23-FnBPA重组质粒

a. FnBPA基因与pSIP409连接、pOri23-FnBPA与pSIP409’的连接,连接体系如下：

连接仪上16℃连接过夜，次日转化到E.coli TOP10化学感受态细胞，铺LB/Em(20μg/ml)平板，37℃培养过夜至单克隆形成。每个平板上随机挑取2个克隆，分别加入5ml LB液体培养液，放入摇床中，37℃，180rpm 10-12h，采用OMEGA质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取重组质粒。将pOri23-FnBPA与pSIP409’连接后的重组质粒命名为“pLc23-FnBPA”。

b.对重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃水浴锅中酶切2h，将酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果，如图9、10所示：

4．将pSIP409-FnBPA 和pLc23-FnBPA重组质粒电转化到植物乳杆菌NC8中

⑴植物乳杆菌NC8的电转化

①分别取 5μl 重组质粒pSIP409-FnBPA 和pLc23-FnBPA依次加入两管冰浴的 100μl植物乳杆菌NC8感受态中，轻缓混匀，移入提前预冷的 0.2 cm 间距的电击杯内，静置冰浴5min 后，放入电转化仪(2.5kV，6ms)中进行电击；

②电转化结束后，立即静置冰浴 5min，取电击杯内液体加入到 800μl 30℃预热的MRS培养液(含 0.5mol/L 蔗糖)中，30℃水浴 3h；

③将含 Em(20mg/ml)的 MRS 固体培养基上均匀涂布 100μl 上述菌液，37℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，约 18-24h。

⑵重组乳酸菌的提取及鉴定

向含 Em(20mg/mL)的 MRS 培养液中接种状态良好的乳酸菌单个菌落，37℃厌氧条件下过夜培养，以质粒小量提取试剂盒(革兰氏阳性菌)进行质粒提取。将所提pSIP409-FnBPA和pLc23-FnBPA质粒分别进行双酶切鉴定,酶切体系如下：

37℃水浴锅中酶切1h，对酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明：pSIP409-FnBPA和pLc23-FnBPA重组质粒成功电转到植物乳杆菌NC8中，如图11、12所示。

5．NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA重组乳酸菌的Western-blot 检测

⑴重组乳酸菌的蛋白样处理

采用反复冻融法（提取细胞壁成分）：

将-80℃冻存的NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA进行传代，将第二代的重组菌取出50μl加入到5ml的MRS液体培养基（2.5μl的Em）中，37℃温箱中厌氧培养至OD值为0.4，加入12.5μl的诱导肽SppIP诱导过夜。

取菌液2ml，4℃，5000rcf离心5min，弃上清，加入1ml的TES(8ml的TE buffer，10.6mg溶菌酶，2.7g蔗糖，32μl RNaseA)混匀，37℃水浴30min。2500rcf离心10min，沉淀用1mLPBS悬起，2500rcf离心5min，加入500μl的ddH2O悬起，放于-80℃冰箱中进行5次反复冻融，每次6min。4℃，21000g离心1h，沉淀中加入150μl的PBS和50μl的4×SDS 上样缓冲液，100℃煮沸10min使蛋白变性， 12000rpm离心1min，上清备用。

⑵SDS-PAGE的配置

①8%分离胶(5ml):分别取双蒸水2.3 ml、30%丙烯酰胺溶液1.3 ml、1.5M Tris-Cl(pH8.8)1.3 ml、10%SDS 溶液 50μl、10%过硫酸铵 50μl、TEMED 10μl,混匀后灌入垂直板。

②5%浓缩胶(2ml):分别取双蒸水1.4 ml、30%丙烯酰胺溶液0.33ml、1.0 M Tris-Cl (pH6.7) 0.25 ml、10%SDS 溶液 30μl、10%过硫酸铵 30μl、TEMED 10μl,混匀后,灌入垂直板(待浓缩胶凝固约30min)并插入梳子。

③待浓缩胶完全凝固(约20min),缓缓取下梳子,取上清,每孔上样15μl,恒压条件下开始电泳,浓缩胶时使用80v,分离胶时使用160v,待溴酚蓝迁移至凝胶底部时,结束电泳。

⑶转膜

SDS-PAGE凝胶电泳结束后,将凝胶取出,连同六张转印滤纸浸泡在转印缓冲液中30min，PVDF膜先用甲醇激活30s，再浸泡于转印缓冲液中。以凝胶面积大小为标准,将滤纸和PVDF膜剪裁整齐,然后在转印缓冲液中排放好,顺序依次为海绵，3层滤纸、PVDF膜、凝胶、3层滤纸，海绵，用玻璃棒擀走每层之间产生的气泡,排放好顺序后放入转印夹中,凝胶一侧与负极相连,PVDF膜一侧与正极相连,恒流200mA转印约1h。

⑷封闭

按照TAKARA商品目录配置封闭液，转印完毕后,将PVDF膜浸没于封闭液中,室温平缓摇动封闭1h。

⑸一抗孵育

将Anti-FnBPA抗体（兔源）使用TBST按1: 5000稀释,将PVDF膜至于稀释后的抗体中，4℃孵育过夜。然后TBST洗涤3次(每次10min)。

⑹二抗孵育

将洗后的PVDF膜置于HRP标记的山羊抗兔lgGA抗体 (使用TBST按1 : 1000稀释)中,37°C平缓摇动1h,TBST洗涤3次(每次15min)。

⑺ ECL显色

使用ECL显色试剂盒，将A液与B液按照1:1比例混匀，进行显色获取结果。

⑻ Western-blot检测结果

pSIP409-FnBPA和pLc23-FnBPA 在植物乳杆菌NC8中的表达，如图13所示：重组乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA分别在113KD和121KD处可见有一条明显的蛋白印迹带,而作为阴性对照的NC8-pSIP409经蛋白印迹分析后无印迹带。说明植物乳杆菌NC8内表达了FnBPA和pOri23-FnBPA蛋白,且两种蛋白均表达于细胞壁表面，都具有反应原性。

实施例3侵袭细胞试验

1. 主要实验材料及分子生物学试剂

⑴实验材料

猪肠上皮细胞IPEC-J2由中国农业科学院北京兽医研究所李奎教授馈赠。

⑵分子生物学试剂

0.25%胰蛋白酶、PBS磷酸盐缓冲液、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液(双抗)、DMEM-F12购自美国Gibco公司，庆大霉素、曲拉通X-100 (TritonX-100) 购自Sigma公司，25ml细胞培养瓶、24孔细胞培养板购自HyClone公司。

2. 对IPEC-J2细胞复苏与培养

⑴IPEC-J2细胞的复苏

①将液氮中的细胞取出一瓶，迅速置于37℃水浴锅中使其完全融化；

②将其加入到事先预热的DMEM-F12完全培养基中(含10%FBS，1%双抗)，4℃，1000rpm离心10min，弃上清；

③加入5ml的DMEM-F12完全培养基，将其小心悬起，4℃，1000rpm离心10min，弃上清；

④再次加入5ml的DMEM-F12完全培养基，悬起之后加到25ml的细胞培养瓶中，放于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；

⑤复苏培养24h后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以后1-2天使用显微镜观察一下细胞的形态，若细胞未铺满瓶底，培养基变色，则更换培养基，若铺满平底，培养基变色，则需对细胞进行传代

⑵IPEC-J2细胞的传代

①当细胞铺满细胞培养瓶时，弃掉培养基；

②加入5ml的PBS，轻轻摇晃，冲洗瓶底除去残留 PBS，以免影响胰酶的消化效果，重复两次；

③根据培养瓶瓶底面积加入适量 0.25%胰酶-EDTA，放入 37℃的 5%CO₂细胞培养箱中消化约 5min，在倒置显微镜下观察；

④待 80%细胞变小变圆，加入完全培养基终止消化，并轻轻吹打混匀；

⑤将混匀的细胞悬液移至灭菌的 15mL 带盖离心管中，4℃，1000rpm离心10min，除去细胞悬液中残留的胰酶-EDTA；

⑥ 小心弃上清，加入适量完全 DMEM-F12 培养基，轻轻吹打混匀，接种进入培养瓶中，并加入适量完全培养基，使培养瓶中液体达到约5mL；

⑦传代后的细胞放入 37℃的 5%CO₂细胞培养箱中，传代后 24h 更换培养基，除去未贴壁的细胞。

3. 侵袭细胞试验

⑴ 24孔细胞培养板中进行IPEC-J2细胞的培养

①将细胞培养瓶中的 IPEC-J2 细胞用胰酶-EDTA 进行消化，制成细胞悬液。用 DMEM-F12完全营养液调整细胞浓度为 2.0×10⁵

个/mL，在24 孔细胞培养板中每孔加入细胞数为 2.0×105个/mL 的细胞，在 37℃的5%CO₂培养箱中孵育至细胞长至单层；

②弃掉培养基，加入5ml的PBS，轻轻摇晃，冲洗瓶底除去残留 PBS，重复两次；

③每孔加入1ml的DMEM-F12培养基（含10%FBS，不含双抗），培养过夜，用于第二天的细胞侵袭试验。

⑵ 菌液的活化与诱导

将-80℃冻存的NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA进行传代，将第二代的重组菌取出50μl加入到5ml的MRS液体培养基（2.5μl的Em）中，37℃温箱中厌氧培养至OD值为0.4，加入12.5μl的诱导肽SppIP诱导过夜。用于第二天侵袭细胞试验。

⑶ 侵袭细胞试验

①使用分光光度计对诱导过夜的NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA进行OD600nm的测定，测定结果依次为2.35、2.31、2.31；

②每种菌液取出1ml，12000rpm离心1min，使用PBS洗两遍，最后用1ml的PBS悬起；

③将细胞培养箱中的细胞取出，NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA三组，每组各做三个复孔，每孔沿侧壁加入对应菌液100 μl（感染复数MOI约为103）；

④4℃，1000rcf离10min，将24孔板置于37℃的 5% CO2培养箱培养1h，使细菌充分进入细胞；

⑤弃掉培养基，每孔加入1ml PBS进行洗涤，洗三遍；

⑥每孔加入1ml的含有庆大霉素的DMEM-F12培养基（含10%FBS，不含双抗，，庆大霉素的终浓度500μg/ml），37℃的 5%CO2培养箱培养2h；

⑦弃掉培养基，每孔加入1ml PBS进行洗涤，洗三遍；

⑧每孔加入0.2%的曲拉通X-100 (TritonX-100) 300μl作用使细胞充分裂解，使用PBS进行倍比稀释： 101、102、103、104、105，每孔中各个梯度的菌液分别取100μl均匀涂布于含Em(20mg/ml)的 MRS 固体培养基上，37℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，进行菌落计数；

⑨三种原始菌液也使用PBS进行倍比稀释：101、102、103、104、105、106、107、108，每种菌液都选择106、107、108三个梯度，取100μl对应菌液均匀涂布于含 Em(20mg/ml)的 MRS固体培养基上，37℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，同样进行菌落计数；

⑩三种乳酸菌进入IPEC-J2细胞的侵袭能力使用侵袭率表示：

侵袭率=侵入细胞的活菌数÷原菌液的活菌数。

⑷ 侵袭细胞试验统计结果与分析

侵入细胞前后活菌数统计结果如下：

柱形图分析结果，如图14所示，可以看出： NC8-pSIP409-FnBPA组对IPEC-J2细胞的侵袭能力与空载体NC8-pSIP409组相比，升高极其显著（P＜0.0001）；NC8-pLc23-FnBPA组对IPEC-J2细胞的侵袭能力与空载体NC8-pSIP409组相比，差异不显著；NC8-pSIP409-FnBPA组对IPEC-J2细胞的侵袭能力与NC8-pLc23-FnBPA组相比，升高也极其显著（P＜0.0001）。

实施例4侵入型乳酸菌表达载体的功能检测

采用常规分子生物学中的基因克隆技术，将gfp基因（编码绿色荧光蛋白GFP）克隆入NC8-pSIP409-FnBPA载体中，采用实施例3所述的操作步骤进行细胞侵袭实验。侵袭后的细胞常规培养24h、48、72h，采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察，在IPEC-J2细胞中可见稳定的绿色荧光。表明所构建的侵入型乳酸菌表达载体能够携带外源基因侵入IPEC-J2细胞，并能稳定表达相应的蛋白，可作为肠道DNA疫苗的递送载体。

<110> 吉林农业大学

<120> KL-6-Fc融合蛋白及应用

<160> 1

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

ggccagaatt caggcaacca aagttttgag gaagacacgg aagaagataa accgaagtat 60

gaacaaggcg gtaacattgt tgatattgat ttcgattcag ttccacagat ccacggccag 120

aacaagggca atcagagttt cgaggaggat actgaaaagg acaagccaaa gtacgagcac 180

ggtggtaaca tcatcgacat cgattttgat agtgttccac acattcacgg cttcaataaa 240

cacactgaaa tcatcgaaga agacacgaac aaagacaagc caagttacca gttcggtggc 300

cataacagtg tcgacttcga ggaggacacg ttaccaaagg tcagtggtca gaacgagggc 360

caacagacta tt 372

<160> 1

<210> 2

<211> 3069

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

atggaagtta aaaacaactt gcgttatggc atccgtaaac acaagttggg tgctgcttca 60

gttttcttgg gtacgatgat tgttgttggt atgggtcagg acaaggaagc tgcagcttca 120

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gaaactcaga cgacggcaac gaacgttaac cacattgaag agactcagtc atataacgct 240

acggtcacgg agcaaccatc aaacgctacg caggttacta cggaagaagc accaaaggct 300

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aaggaagaag ctaagccgca ggttaaggag acgacgcaat cacaggataa cagtggcgat 420

cagcgtcagg ttgacttaac gccgaagaag gcaactcaga accaggttgc tgagacgcaa 480

gttgaggtcg cacaaccgcg gacggcttca gaaagtaagc cgcgtgttac gcggagtgct 540

gacgtcgctg aagctaagga ggcaagtaac gctaaggtcg aaacgggcac ggacgtcacg 600

agtaaagtta cggttgaaat tggctcaatt gaaggtcata acaatactaa taaggttgaa 660

ccgcacgcag gccaacgggc tgttttaaag tataaattaa agtttgaaaa tggtttgcac 720

cagggcgact atttcgactt cacgttaagt aataatgtca atacgcatgg tgtcagtacg 780

gcacggaagg ttccggaaat taaaaatggc agtgtcgtca tggcaactgg cgaagtcttg 840

gagggtggca agattcggta tacgttcacg aatgatattg aagacaaggt cgacgtcacg 900

gctgaattgg agatcaactt attcatcgac ccaaagacgg tccagacgaa tggcaaccaa 960

actattactt caacgttgaa cgaagaacaa acttcaaagg aattagatgt caaatataaa 1020

gatggcatcg gcaattatta tgctaattta aacggcagta ttgaaacttt taataaagca 1080

aataatcggt ttagtcatgt tgcattcatt aaaccgaata acggcaagac gacgagtgtt 1140

acggtcacgg gcacgttgat gaagggcagt aaccaaaacg gcaaccaacc gaaggttcgt 1200

atctttgaat atttaggtaa caatgaggac atcgcaaaat cagtttatgc taatactacg 1260

gatacgagta aatttaagga agttactagt aacatgagtg gcaatttaaa tttacaaaat 1320

aatggtagtt atagtttaaa tatcgagaat ttggacaaaa cgtatgtcgt tcactatgat 1380

ggcgaatact taaacggtac ggatgaggtc gacttccgga ctcagatggt cggtcatccg 1440

gagcaattat ataagtatta ttatgatcgt ggttatacgt tgacgtggga caacggttta 1500

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aagtttgaat ataaggaaga tactatcaaa gaaactttga cgggtcaata tgataagaat 1620

ttggtcacga cggtcgagga ggagtatgat tcaagtactt tagatattga ttaccatacg 1680

gctatcgatg gtggcggtgg ctacgttgat ggctatattg aaactatcga agagacggac 1740

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aatttgattg aattggttga cgagttgccg gaggaacacg gtcaggcaca aggtccggtc 2100

gaagaaatta cgaaaaataa tcatcatatt tcacatagtg gtttaggtac ggagaacggt 2160

cacggtaact acgacgttat tgaggaaatt gaagaaaaca gtcacgttga tatcaaatca 2220

gaattaggtt acgaaggtgg ccagaattca ggcaaccaaa gttttgagga agacacggaa 2280

gaagataaac cgaagtatga acaaggcggt aacattgttg atattgattt cgattcagtt 2340

ccacagatcc acggccagaa caagggcaat cagagtttcg aggaggatac tgaaaaggac 2400

aagccaaagt acgagcacgg tggtaacatc atcgacatcg attttgatag tgttccacac 2460

attcacggct tcaataaaca cactgaaatc atcgaagaag acacgaacaa agacaagcca 2520

agttaccagt tcggtggcca taacagtgtc gacttcgagg aggacacgtt accaaaggtc 2580

agtggtcaga acgagggcca acagactatt gaagaagata cgacgccacc gattgttcca 2640

ccaactccac cgacgccaga agttccaagt gaaccggaga cgccaacgcc accaacgcca 2700

gaggttccgt cagagccaga aacgccaacg ccgccgactc cagaggttcc aagtgagccg 2760

gaaactccaa cgccaccgac tccggaagtc ccagcagagc cgggtaagcc agttccgcca 2820

gcaaaggagg agccaaaaaa gccgagtaaa ccggttgagc agggtaaggt cgtcacgccg 2880

gtcattgaaa ttaatgaaaa agttaaagca gtcgcaccga cgaagaagcc acaaagtaag 2940

aagtcagagt taccggaaac tggcggcgaa gagagtacta acaagggtat gttatttggt 3000

ggtttgttta gtatcttagg cttagcatta ttacgtcgta ataagaaaaa ccataaggct 3060

taaaagctt 3069

<210> 3

<211> 3283

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

ctcgaggaaa agccctgaca accctcgttc ctaaaaagga ataagcgttt ggtcagtaaa 60

taatagaaat aaaaaatcag acctaagact gatgacaaaa agagcaaatt ttgataaaat 120

agtattagaa ttaaattaaa aagggaggcc aaatataatg aaaaatatga atgacaatga 180

tgttggatcc gcatttaaag ggagatatta taccatggaa gttaaaaaca acttgcgtta 240

tggcatccgt aaacacaagt tgggtgctgc ttcagttttc ttgggtacga tgattgttgt 300

tggtatgggt caggacaagg aagctgcagc ttcagagcag aaaacgacga cggtcgagga 360

gaacggtaat agtgcaacgg acaataaaac gagtgaaact cagacgacgg caacgaacgt 420

taaccacatt gaagagactc agtcatataa cgctacggtc acggagcaac catcaaacgc 480

tacgcaggtt actacggaag aagcaccaaa ggctgttcaa gctccacaaa cggctcagcc 540

ggcaaacatt gaaacggtca aagaggaagt cgtcaaggaa gaagctaagc cgcaggttaa 600

ggagacgacg caatcacagg ataacagtgg cgatcagcgt caggttgact taacgccgaa 660

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taacgctaag gtcgaaacgg gcacggacgt cacgagtaaa gttacggttg aaattggctc 840

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aacgccgccg actccagagg ttccaagtga gccggaaact ccaacgccac cgactccgga 3000

agtcccagca gagccgggta agccagttcc gccagcaaag gaggagccaa aaaagccgag 3060

taaaccggtt gagcagggta aggtcgtcac gccggtcatt gaaattaatg aaaaagttaa 3120

agcagtcgca ccgacgaaga agccacaaag taagaagtca gagttaccgg aaactggcgg 3180

cgaagagagt actaacaagg gtatgttatt tggtggtttg tttagtatct taggcttagc 3240

attattacgt cgtaataaga aaaaccataa ggcttaaaag ctt 3283

Claims

1.一种重组质粒pSIP409-FnBPA，它是在pSIP409插入了FnBPA，所述的FnBPA它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组质粒pLc23-FnBPA，它是以pSIP409为模板，用引物：

409’-F: ataAAGCTTCAAATTACAGCACGTGTTG

409’-R: tgcGGTACCGTCGACCCCGGTCTCCATTC

3.一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8- FnBPA，它是转染了权利要求1所述的一种重组质粒pSIP409-FnBPA的乳酸菌NC8。

4.一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA，它是权利要求2所述的转染了上述的一种重组质粒pSIP409-FnBPA的乳酸菌NC8。

5.根据权利要求3所述的一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8- FnBPA侵入猪肠上皮细胞的用途。

6.根据权利要求4所述的一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA侵入猪肠上皮细胞的用途。