CN106543281A - 一种苯二氮卓人工抗原的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以氯氮卓与丁二酸酐为原料通过化学修饰，接臂，反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备苯二氮卓的人工抗原即苯二氮卓-牛血清蛋白。所制备的苯二氮卓人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯二氮卓抗体，可用于各种苯二氮卓类免疫分析法的研究，为苯二氮卓的检测提供更加方便快速准确的途径。

Description

一种苯二氮卓人工抗原的制备方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种苯二氮卓人工抗原的制备方法。

背景技术

苯二氮卓类药(benzodiazepines)是一类作用于中枢苯二氮卓类类受体，具有镇静、抗焦虑、肌肉松弛、抗惊厥作用的药物。本类药物毒性比巴比妥类小，不良反应，加大剂量也不产生麻醉。苯二氮卓通过抑制中脑网状结构对皮层的激醒而利睡眠，抑制边缘系统神经元活动，减弱其对网状结构的激活而利睡眠。同时，对边缘系统的特殊作用能有效减轻情绪活动，对焦虑症失眠效果佳。使用安全、起效快、耐受性良好的特点。目前，仍是使用最广泛的催眠药，苯二氮卓类(benzodiazepines)多为1，4-苯并二氮卓的衍生物,包括地西泮(diazepam，安定)、氟西泮(flurazepam,氟安定)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、奥沙西泮(oxazepam)和三唑仑(triazolam)等。其结构式为：

苯二氮卓长期应用引起身体和精神依赖性具有生理依赖性。因此苯二氮卓要合理利用。

目前，对苯二氮卓的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC),气相色谱(GC)，薄层色谱(TLC)，质朴(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的苯二氮卓人工抗原的制备方法,制备的苯二氮卓人工抗原可用于免疫制备具有特异性的苯二氮卓抗体,进一步用于检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，所制备的苯二氮卓人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯二氮卓抗体，可用于各种苯二氮卓类免疫分析法的研究，为苯二氮卓类的检测提供更加方便快速准确的途径。

一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备人工半抗原：

(a)将氯氮卓溶于无水吡啶，加入乙酸酐，室温静置反应14小时以上；减压浓缩，加入乙醚：石油醚＝1：1溶剂，冰水浴结晶，移除溶液，固体用二氯甲烷溶解后减压浓缩。重复以上操作至TLC检测显示只有1个点，蒸干后称重，得产物Ⅰ；TLC层析液：正庚烷：三氯甲烷：乙酸：乙醇95％＝5:5:1:0.3(v/v)。

(b)产物Ⅰ按比例加入1，4-二氧六环溶解后，加入1N盐酸，室温静置14小时以上，反应比例：产物Ⅰ：1，4-二氧六环：1N盐酸＝85.4g：1250ml：250ml；用1N氢氧化钠调反应液pH＝8～9，用乙醚萃取，收集有机相用pH＝9～10的氢氧化钠水溶液萃取，得到的水相用乙酸调pH＝7后，用二氯甲烷萃取，收集有机相减压浓缩，加入少量石油醚，使固体析出，蒸干得产物Ⅱ。

(c)产物Ⅱ溶于乙酸酐中，反应比例：产物Ⅱ：乙酸酐＝1g：10ml，94℃下反应20～23分钟，冷却结晶过夜。移除溶液，固体用乙酸酐洗涤。加入95％乙醇，减压蒸干，得产物Ⅲ。

(d)产物Ⅲ加入95％乙醇和4N氢氧化钠，反应比例：产物Ⅲ：95％乙醇：4N氢氧化钠＝3.4g：80ml：6ml，得乳白色悬浊物，加入与95％乙醇体积相同的纯化水溶解，用乙酸调至酸性，析出沉淀后，过滤，滤渣放入40℃烘箱中干燥过夜，得产物Ⅳ。

(e)称取200mg产物Ⅳ，溶于5ml无水吡啶中，加入250mg丁二酸酐，95～105℃反应16小时以上。反应结束后，将溶剂减压蒸干，用38％的碳酸钾溶解，用乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH＝5，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，再用饱和氯化钠萃取，有机相减压蒸干，得苯二氮卓半抗原。

(2)制备苯二氮卓人工抗原：

(f)将苯二氮卓半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：苯二氮卓半抗原：N,N-二甲基甲酰胺：N-羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺＝200mg：10ml：200mg：288mg，室温搅拌反应16小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；

(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；

(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；

(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；

(g)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：苯二氮卓-牛血清蛋白。

由于苯二氮卓的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成苯二氮卓抗原后，才能刺激机体产生相应的苯二氮卓抗体。本发明在制备苯二氮卓人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在苯二氮卓半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的苯二氮卓人工抗原保持了苯二氮卓的结构特异性，有利于相应苯二氮卓抗体的产生。

本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以氯氮卓为原料通过化学修饰，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备苯二氮卓的人工抗原即苯二氮卓-牛血清蛋白。其反应方程式如下：

本发明制备得到的苯二氮卓人工抗原可通过以下方法进行鉴定：

偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Protein standard(BSA)分别配制成浓度为0.2，0.4，0.6，,0.8,1.0,1.2,1.6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，混匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。空白液为reagent A 250ul加reagent B 2.0ml。以OD值为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，摇匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得苯二氮卓抗原的蛋白浓度为2.32mg/ml。

附图说明

图1是苯二氮卓人工抗原制备前后的紫外扫描图。

具体实施方式

苯二氮卓人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以氯氮卓为原料通过化学修饰，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备苯二氮卓的人工抗原即苯二氮卓-牛血清蛋白。

实施例1

(1)人工半抗原的制备：

(a)将氯氮卓5g溶于60ml无水吡啶，加入30ml乙酸酐，室温静置反应18小时；减压浓缩，加入乙醚：石油醚＝1：1溶剂30ml，冰水浴结晶，移除溶液，固体用20ml二氯甲烷溶解后减压浓缩。重复以上操作至TLC检测显示只有1个点，蒸干后称重，得4.05g产物Ⅰ；TLC层析液：正庚烷：三氯甲烷：乙酸：乙醇95％＝5:5:1:0.3(v/v)。

(b)产物Ⅰ加入1，4-二氧六环59.3ml溶解后，加入1N盐酸11.8ml，室温静置17小时；用1N氢氧化钠调反应液pH＝9，用3×50ml乙醚萃取，分别收集水相和有机相，有机相用3×30ml的pH＝9～10的氢氧化钠水溶液萃取，合并水相，得到的水相用乙酸调pH＝7后，用3×30ml二氯甲烷萃取，收集有机相减压浓缩，加入10ml石油醚，使固体析出，蒸干得2.84g产物Ⅱ。

(c)产物Ⅱ溶于28.4ml乙酸酐中，94℃下反应22分钟，冷却结晶过夜。移除溶液，固体用2ml乙酸酐洗涤。加入3×10ml的95％乙醇，减压蒸干，得1.77g产物Ⅲ。

(d)产物Ⅲ加入95％乙醇41.6ml和4N氢氧化钠3.12ml，得乳白色悬浊物，加入与41.6ml的纯化水溶解，用乙酸调至酸性，析出沉淀后，过滤，滤渣放入40℃烘箱中干燥过夜，得1.02g产物Ⅳ。

(e)称取200mg产物Ⅳ，溶于5ml无水吡啶中，加入250mg丁二酸酐，95～105℃反应18小时。反应结束后，将溶剂减压蒸干，用38％的碳酸钾15ml溶解，用15ml乙酸乙酯萃取，水相再用3×10ml的乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH＝5，用3×15ml乙酸乙酯萃取，收集有机相，用2×25ml饱和氯化钠萃取，收集有机相，减压蒸干，得苯二氮卓半抗原296mg。

(2)制备苯二氮卓人工抗原：

(f)将苯二氮卓半抗原溶于14.8ml N,N-二甲基甲酰胺，加入N-羟基琥珀酰亚胺296mg、环己基碳酰二亚胺426mg，室温搅拌反应20小时，反应结束后离心取上清液记为A液；

(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4；

(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；

(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；

(g)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：苯二氮卓-牛血清蛋白。图1是苯二氮卓人工抗原制备前后的紫外扫描图。

(3)苯二氮卓人工抗原的鉴定：

偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Protein standard(BSA)分别配制成浓度为0.2，0.4，0.6，,0.8,1.0,1.2,1.6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，混匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。空白液为reagent A 250ul加reagent B 2.0ml。以OD值为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，摇匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得苯二氮卓抗原的蛋白浓度为2.32mg/ml。

Claims (1)

1.一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备人工半抗原：

(a)将氯氮卓溶于无水吡啶，加入乙酸酐，室温静置反应14小时以上；减压浓缩，加入乙醚：石油醚＝1：1溶剂，冰水浴结晶，移除溶液，固体用二氯甲烷溶解后减压浓缩；重复以上操作至TLC检测显示只有1个点，蒸干后称重，得产物Ⅰ；TLC层析液：正庚烷：三氯甲烷：乙酸：乙醇95％＝5:5:1:0.3(v/v)；

(b)产物Ⅰ按比例加入1，4-二氧六环溶解后，加入1N盐酸，室温静置14小时以上，反应比例：产物Ⅰ：1，4-二氧六环：1N盐酸＝85.4g：1250ml：250ml；用1N氢氧化钠调反应液pH＝8～9，用乙醚萃取，收集有机相用pH＝9～10的氢氧化钠水溶液萃取，得到的水相用乙酸调pH＝7后，用二氯甲烷萃取，收集有机相减压浓缩，加入少量石油醚，使固体析出，蒸干得产物Ⅱ；

(c)产物Ⅱ溶于乙酸酐中，反应比例：产物Ⅱ：乙酸酐＝1g：10ml，94℃下反应20～23分钟，冷却结晶过夜；移除溶液，固体用乙酸酐洗涤；加入95％乙醇，减压蒸干，得产物Ⅲ；

(d)产物Ⅲ加入95％乙醇和4N氢氧化钠，反应比例：产物Ⅲ：95％乙醇：4N氢氧化钠＝3.4g：80ml：6ml，得乳白色悬浊物，加入与95％乙醇体积相同的纯化水溶解，用乙酸调至酸性，析出沉淀后，过滤，滤渣放入40℃烘箱中干燥过夜，得产物Ⅳ；

(e)称取200mg产物Ⅳ，溶于5ml无水吡啶中，加入250mg丁二酸酐，95～105℃反应16小时以上；反应结束后，将溶剂减压蒸干，用38％的碳酸钾溶解，用乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH＝5，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，再用饱和氯化钠萃取，有机相减压蒸干，得苯二氮卓半抗原；

(2)制备苯二氮卓人工抗原：

(f)将苯二氮卓半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：苯二氮卓半抗原：N,N-二甲基甲酰胺：N-羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺＝200mg：10ml：200mg：288mg，室温搅拌反应16小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；

(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；

(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；

(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；

(g)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：苯二氮卓-牛血清蛋白。