CN106540321B - 一种人工再生骨的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工再生骨的制备方法，特点是具体制备过程为：新鲜骨块脱细胞处理→制备凝胶→制备浓缩骨髓→制备人工再生骨；优点是通过本方法加工得到的人工再生骨可对人体或动物体上的大段骨缺损进行治疗，且安全可靠、骨融合率较高。

Description

一种人工再生骨的制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程仿生技术领域，尤其涉及一种人工再生骨的制备方法。
背景技术
创伤、肿瘤、慢性炎症等疾病都会造成人体骨缺损，对于较大的骨缺损在临床治疗时需要进行替代物植入，目前临床所用的植入物主要为自体骨，自体骨移植通常用于修复小面积的骨缺损，被业界认为是一种安全可靠、骨融合率较高的方法，但是术后供骨位置创伤、有限取骨量等弊端限制其在较大面积骨缺损方面的应用。因此，目前对于大段骨缺损超过30％的病患进行临床上治疗仍然是一大难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可对人体或动物体上的大段骨缺损进行治疗，且安全可靠、骨融合率较高的人工再生骨的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种人工再生骨的制备方法，其具体制备过程为：新鲜骨块脱细胞处理→制备凝胶→制备浓缩骨髓→制备人工再生骨，其中：
所述的新鲜骨块脱细胞处理的具体过程为：
(1)、从刚去世的尸体上取新鲜骨块，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液冲去新鲜骨块中的骨髓，再将新鲜骨块放入PBS溶液中浸泡将血污清洗干净；
(2)、将上述干净骨块放入体积浓度为75％的酒精中浸洗1～2次，每次浸洗时间为1～3min，然后用PBS溶液将骨块漂洗2～4次，再将骨块浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震荡，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的质量浓度为1～3％，骨块与曲拉通X-100/PBS混合溶液的体积比为1：1～3，每6～8小时换液一次，共换液2～4次，然后将骨块从曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗1～2次；
(3)、将骨块浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量为500～5000U/L，骨块与胰脂酶/PBS混合溶液的体积比为1：1～3，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的温度为30～40℃，对骨块处理10～20小时，然后将骨块从胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗1～2次，再将骨块浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均为1000～3000U/L，骨块与DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的体积比为1：1～3，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的温度为30～40℃，对骨块处理5～10小时，然后将骨块从DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后将骨块放入含有青霉素与链霉素的PBS溶液中震荡漂洗，其中：青霉素与链霉素在PBS溶液中的含量均为100～300U/L，每12小时换液一次，共换液两次，漂洗结束后将脱细胞的骨块取出置于PBS溶液中，并在4℃的温度下保存待用；
所述的制备凝胶的具体过程为：
(4)、将平均分子量为800000～1800000道尔顿的透明质酸溶于水，得到质量浓度为1～10％的透明质酸水溶液；
(5)、将植物多糖溶于水，得到质量浓度为1～20％的多糖水溶液；
(6)、将透明质酸水溶液和多糖水溶液按体积比为1～100：1的比例混合得到混合水溶液，再向混合水溶液中加入浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，使混合水溶液的pH值达到8～11，再向混合水溶液中加入交联剂，其中：混合水溶液与交联剂的质量比为5～20：1，形成均匀的粘稠液，在室温下放置2～5小时后得到凝胶；
(7)、将凝胶放入无菌水中浸泡一天，洗掉多余的交联剂，然后将凝胶放入体积浓度为75％的酒精中浸泡消毒2～3小时，再将凝胶浸入无菌水中5～10小时，换水2次，最后用PBS溶液浸泡凝胶2～3小时，取出后将凝胶在4℃的温度下保存待用；
所述的制备浓缩骨髓的具体过程为：从刚去世的尸体上抽取骨髓，置于肝素抗凝管内，并在1000～2000r/min的转速下离心10～20min，然后去除上层血浆，得到浓缩骨髓；
所述的制备人工再生骨的具体过程为：在无菌条件下，将脱细胞骨块加工成所需尺寸和形状的骨条，并将凝胶注入骨条网格内直至注满，再将浓缩骨髓多点注入凝胶-骨条内，以凝胶不溢出骨条为限，得到人工再生骨。
进一步地，所述的植物多糖为菟丝子多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、香菇多糖、巴戟天多糖或黄精多糖等。
所述的步骤(6)中所使用的交联剂为砜类化合物或环氧类化合物，如：乙烯基砜、二甲基亚砜、环氧氯丙烷、环氧丙烷。
与现有技术相比，本发明的优点是通过本方法加工得到的人工再生骨可对人体或动物体上的大段骨缺损进行治疗，且操作方便，安全可靠；由于本方法中采用了患病动物的同类或患者的同类的骨髓，同时凝胶又很好地保护并限制了骨髓流失，且凝胶的存在为其中所含的可以促进骨生长的干细胞提供合适的生长环境，因此，凝胶/骨髓/异体骨的三元体系可以很好地促进缺损骨骼的再生，显著提高骨融合率；又由于凝胶中添加有植物多糖，可降低机体乳酸脱氢酶活性、增加超氧化物歧化酶活力，提高机体的运动能力、延缓机体的衰老，同时对细菌和病毒有抑制作用，增强细胞的免疫功能，对骨的再生起到明显的促进作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一：一种人工再生骨的制备方法，其具体制备过程为：
(1)、从刚去世的人的尸体上取新鲜骨块，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液冲去新鲜骨块中的骨髓，再将新鲜骨块放入PBS溶液中浸泡将血污等杂质清洗干净；
(2)、将上述干净骨块放入体积浓度为75％的酒精中浸洗2次，每次浸洗时间为3min，然后用PBS溶液将骨块漂洗4次，再将骨块浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震荡，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的质量浓度为1％，骨块与曲拉通X-100/PBS混合溶液的体积比为1：3，每6小时换液一次，共换液4次，然后将骨块从曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗2次；
(3)、将骨块浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量为5000U/L，骨块与胰脂酶/PBS混合溶液的体积比为1：1，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的温度为30℃，对骨块处理15小时，然后将骨块从胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗2次，再将骨块浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均为1000U/L，骨块与DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的体积比为1：3，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的温度为40℃，对骨块处理5小时，然后将骨块从DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后将骨块放入含有青霉素与链霉素的PBS溶液中震荡漂洗，其中：青霉素与链霉素在PBS溶液中的含量均为100U/L，每12小时换液一次，共换液两次，漂洗结束后将脱细胞的骨块取出置于PBS溶液中，并在4℃的温度下保存待用；
(4)、将平均分子量为1800000道尔顿的透明质酸溶于水，得到质量浓度为1％的透明质酸水溶液；
(5)、将菟丝子多糖溶于水，得到质量浓度为10％的多糖水溶液；
(6)、将透明质酸水溶液和多糖水溶液按体积比为50：1的比例混合得到混合水溶液，再向混合水溶液中加入浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，使混合水溶液的pH值达到9，再向混合水溶液中加入乙烯基砜，其中：混合水溶液与乙烯基砜的质量比为20：1，形成均匀的粘稠液，在室温下放置5小时后得到凝胶；
(7)、将凝胶放入无菌水中浸泡一天，洗掉多余的乙烯基砜，然后将凝胶放入体积浓度为75％的酒精中浸泡消毒2小时，再将凝胶浸入无菌水中8小时，换水2次，最后用PBS溶液浸泡凝胶2小时，取出后将凝胶在4℃的温度下保存待用；
(8)、从刚去世的人的尸体上抽取骨髓，置于肝素抗凝管内，并在2000r/min的转速下离心10min，然后去除上层血浆，得到浓缩骨髓；
(9)、在无菌条件下，将脱细胞骨块加工成所需尺寸和形状的骨条，并将凝胶注入骨条网格内直至注满，再将浓缩骨髓多点注入凝胶-骨条内，以凝胶不溢出骨条为限，得到人工再生骨。
实施例二：一种人工再生骨的制备方法，其具体制备过程为：
(1)、从刚去世的兔子的尸体上取新鲜骨块，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液冲去新鲜骨块中的骨髓，再将新鲜骨块放入PBS溶液中浸泡将血污等杂质清洗干净；
(2)、将上述干净骨块放入体积浓度为75％的酒精中浸洗1次，每次浸洗时间为1min，然后用PBS溶液将骨块漂洗2次，再将骨块浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震荡，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的质量浓度为3％，骨块与曲拉通X-100/PBS混合溶液的体积比为1：1，每8小时换液一次，共换液2次，然后将骨块从曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗2次；
(3)、将骨块浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量为3000U/L，骨块与胰脂酶/PBS混合溶液的体积比为1：2，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的温度为40℃，对骨块处理10小时，然后将骨块从胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗2次，再将骨块浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均为3000U/L，骨块与DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的体积比为1：1，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的温度为30℃，对骨块处理10小时，然后将骨块从DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后将骨块放入含有青霉素与链霉素的PBS溶液中震荡漂洗，其中：青霉素与链霉素在PBS溶液中的含量均为200U/L，每12小时换液一次，共换液两次，漂洗结束后将脱细胞的骨块取出置于PBS溶液中，并在4℃的温度下保存待用；
(4)、将平均分子量为800000道尔顿的透明质酸溶于水，得到质量浓度为10％的透明质酸水溶液；
(5)、将枸杞多糖溶于水，得到质量浓度为20％的多糖水溶液；
(6)、将透明质酸水溶液和多糖水溶液按体积比为100：1的比例混合得到混合水溶液，再向混合水溶液中加入浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，使混合水溶液的pH值达到8，再向混合水溶液中加入二甲基亚砜，其中：混合水溶液与二甲基亚砜的质量比为10：1，形成均匀的粘稠液，在室温下放置3小时后得到凝胶；
(7)、将凝胶放入无菌水中浸泡一天，洗掉多余的二甲基亚砜，然后将凝胶放入体积浓度为75％的酒精中浸泡消毒3小时，再将凝胶浸入无菌水中10小时，换水2次，最后用PBS溶液浸泡凝胶2小时，取出后将凝胶在4℃的温度下保存待用；
(8)、从刚去世的兔子的尸体上抽取骨髓，置于肝素抗凝管内，并在1000r/min的转速下离心20min，然后去除上层血浆，得到浓缩骨髓；
(9)、在无菌条件下，将脱细胞骨块加工成所需尺寸和形状的骨条，并将凝胶注入骨条网格内直至注满，再将浓缩骨髓多点注入凝胶-骨条内，以凝胶不溢出骨条为限，得到人工再生骨。
实施例三：一种人工再生骨的制备方法，其具体制备过程为：
(1)、从刚去世的猪的尸体上取新鲜骨块，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液冲去新鲜骨块中的骨髓，再将新鲜骨块放入PBS溶液中浸泡将血污等杂质清洗干净；
(2)、将上述干净骨块放入体积浓度为75％的酒精中浸洗2次，每次浸洗时间为2min，然后用PBS溶液将骨块漂洗3次，再将骨块浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震荡，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的质量浓度为2％，骨块与曲拉通X-100/PBS混合溶液的体积比为1：2，每7小时换液一次，共换液3次，然后将骨块从曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗1次；
(3)、将骨块浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量为1000U/L，骨块与胰脂酶/PBS混合溶液的体积比为1：3，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的温度为35℃，对骨块处理20小时，然后将骨块从胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗1次，再将骨块浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均为2000U/L，骨块与DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的体积比为1：2，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的温度为35℃，对骨块处理8小时，然后将骨块从DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后将骨块放入含有青霉素与链霉素的PBS溶液中震荡漂洗，其中：青霉素与链霉素在PBS溶液中的含量均为300U/L，每12小时换液一次，共换液两次，漂洗结束后将脱细胞的骨块取出置于PBS溶液中，并在4℃的温度下保存待用；
(4)、将平均分子量为1400000道尔顿的透明质酸溶于水，得到质量浓度为5％的透明质酸水溶液；
(5)、将黄芪多糖溶于水，得到质量浓度为1％的多糖水溶液；
(6)、将透明质酸水溶液和多糖水溶液按体积比为10：1的比例混合得到混合水溶液，再向混合水溶液中加入浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，使混合水溶液的pH值达到11，再向混合水溶液中加入环氧氯丙烷，其中：混合水溶液与环氧氯丙烷的质量比为5：1，形成均匀的粘稠液，在室温下放置2小时后得到凝胶；
(7)、将凝胶放入无菌水中浸泡一天，洗掉多余的环氧氯丙烷，然后将凝胶放入体积浓度为75％的酒精中浸泡消毒3小时，再将凝胶浸入无菌水中6小时，换水2次，最后用PBS溶液浸泡凝胶3小时，取出后将凝胶在4℃的温度下保存待用；
(8)、从刚去世的猪的尸体上抽取骨髓，置于肝素抗凝管内，并在1500r/min的转速下离心15min，然后去除上层血浆，得到浓缩骨髓；
(9)、在无菌条件下，将脱细胞骨块加工成所需尺寸和形状的骨条，并将凝胶注入骨条网格内直至注满，再将浓缩骨髓多点注入凝胶-骨条内，以凝胶不溢出骨条为限，得到人工再生骨。
上述实施例中，刚去世的尸体可以为猪、狗、兔子、鼠等动物的尸体，也可以为人的尸体；植物多糖为菟丝子多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、香菇多糖、巴戟天多糖或黄精多糖等。

Claims (2)

1.一种人工再生骨的制备方法，其特征在于具体制备过程为：新鲜骨块脱细胞处理→制备凝胶→制备浓缩骨髓→制备人工再生骨，其中：
所述的新鲜骨块脱细胞处理的具体过程为：
(1)、从刚去世的猪、狗、兔子、鼠或人的尸体上取新鲜骨块，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液冲去新鲜骨块中的骨髓，再将新鲜骨块放入PBS溶液中浸泡将血污清洗干净；
(2)、将上述干净骨块放入体积浓度为75％的酒精中浸洗1～2次，每次浸洗时间为1～3min，然后用PBS溶液将骨块漂洗2～4次，再将骨块浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震荡，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的质量浓度为1～3％，骨块与曲拉通X-100/PBS混合溶液的体积比为1：1～3，每6～8小时换液一次，共换液2～4次，然后将骨块从曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗1～2次；
(3)、将骨块浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量为500～5000U/L，骨块与胰脂酶/PBS混合溶液的体积比为1：1～3，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的温度为30～40℃，对骨块处理10～20小时，然后将骨块从胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗1～2次，再将骨块浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均为1000～3000U/L，骨块与DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的体积比为1：1～3，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的温度为30～40℃，对骨块处理5～10小时，然后将骨块从DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后将骨块放入含有青霉素与链霉素的PBS溶液中震荡漂洗，其中：青霉素与链霉素在PBS溶液中的含量均为100～300U/L，每12小时换液一次，共换液两次，漂洗结束后将脱细胞的骨块取出置于PBS溶液中，并在4℃的温度下保存待用；
所述的制备凝胶的具体过程为：
(4)、将平均分子量为800000～1800000道尔顿的透明质酸溶于水，得到质量浓度为1～10％的透明质酸水溶液；
(5)、将植物多糖溶于水，得到质量浓度为1～20％的多糖水溶液，其中：植物多糖为菟丝子多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、香菇多糖、巴戟天多糖或黄精多糖；
(6)、将透明质酸水溶液和多糖水溶液按体积比为1～100：1的比例混合得到混合水溶液，再向混合水溶液中加入浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，使混合水溶液的pH值达到8～11，再向混合水溶液中加入交联剂，其中：混合水溶液与交联剂的质量比为5～20：1，形成均匀的粘稠液，在室温下放置2～5小时后得到凝胶；
(7)、将凝胶放入无菌水中浸泡一天，洗掉多余的交联剂，然后将凝胶放入体积浓度为75％的酒精中浸泡消毒2～3小时，再将凝胶浸入无菌水中5～10小时，换水2次，最后用PBS溶液浸泡凝胶2～3小时，取出后将凝胶在4℃的温度下保存待用；
所述的制备浓缩骨髓的具体过程为：从刚去世的尸体上抽取骨髓，骨髓取自患病动物的同类或患者的同类的骨髓，置于肝素抗凝管内，并在1000～2000r/min的转速下离心10～20min，然后去除上层血浆，得到浓缩骨髓；
所述的制备人工再生骨的具体过程为：在无菌条件下，将脱细胞骨块加工成所需尺寸和形状的骨条，并将凝胶注入骨条网格内直至注满，再将浓缩骨髓多点注入凝胶-骨条内，以凝胶不溢出骨条为限，得到人工再生骨。
2.如权利要求1所述的一种人工再生骨的制备方法，其特征在于：所述的步骤(6)中所使用的交联剂为砜类化合物或环氧类化合物。
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