CN106540245A - 一种溶壁酶在抗鱼类真菌以及制备抗鱼类真菌药物中的应用 - Google Patents

一种溶壁酶在抗鱼类真菌以及制备抗鱼类真菌药物中的应用 Download PDF

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张丽
华亚南
张玲敏
谭文俊
陈金涛
吴清洋
魏逸峰
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Guangdong Institute of Microbiology
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Abstract

本发明公开了一种溶壁酶在抗鱼类真菌以及制备抗鱼类真菌药物中的应用。本发明提出一种安全、高效、环保的选择性抑杀同丝水霉菌的渔药替代孔雀石绿等化学药品，来抑制水霉病的产生，在水产养殖业有较大的应用前景。

Description

一种溶壁酶在抗鱼类真菌以及制备抗鱼类真菌药物中的应用
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种溶壁酶在抗鱼类真菌以及制备抗鱼类真菌药物中的应用。
背景技术：
水霉病是咸淡水养殖生产中一种常见的真菌寄生性疾病，它具有流行范围广、时间跨度大、无寄主选择性、难治愈等特点，因此水霉病的爆发常常导致鱼类大量死亡，从而给水产养殖业带来巨大经济损失。孔雀石绿曾经被广泛用于水产养殖中水霉病的防治，但是孔雀石绿不易降解，在水产动物体内存在高残留的现象，而且对哺乳动物和人类存在致畸、致癌、致突变的风险，故从上世纪90年代起就陆续被各国禁用于渔业生产中。尽管甲醛、高锰酸钾、二氧化氯和过氧化氢等化学药物对水霉病也具有一定防治效果，但是这些化学药物的使用也存在残留风险和污染环境等问题。因此，寻找一种安全、高效、环保的选择性抑杀水霉菌的技术变得愈发重要。
溶壁酶(lywallzyme)是一种真菌细胞壁溶解酶，是以长梗木霉(TrichodermaLongibrachiatum)为产酶菌株经诱导所获得的一种酶，命名为“溶壁酶”。它能溶解多种真菌(包括担子菌、子囊菌、藻状菌和半知菌)的细胞壁获得原生质体。溶壁酶的特性使其有望开发成为水产养殖使用的抗真菌病无公害渔药，发展前景广阔。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种溶壁酶在抗鱼类真菌中的应用。
优选地，所述的鱼类真菌为同丝水霉菌。本发明的工作原理是利用溶壁酶可以降解真菌细胞壁，从而抑制真菌生长。本发明参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)，结果表明溶壁酶具有较强的抑制同丝水霉菌活性，并且溶壁酶还具有无毒和不污染环境等优点，使其有望开发成为水产养殖使用的抗真菌病无公害渔药，发展前景广阔。
本发明的第二个目的是提供溶壁酶在制备抗鱼类真菌药物中的应用。
优选地，所述的抗鱼类真菌药物为抗同丝水霉菌药物。
本发明的第三个目的是提供一种抗鱼类真菌药物，含有大于或等于最低抑菌浓度为20mg/mL的溶壁酶作为活性成分。
本发明的有益效果是：本发明提出一种安全、高效、环保的选择性抑杀同丝水霉菌的渔药替代孔雀石绿等化学药品，来抑制水霉病的产生，在水产养殖业有较大的应用前景。
附图说明：
图1是实施例2的同丝水霉菌水浴2h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长24h的抑制试验结果；
图2是实施例2的同丝水霉菌水浴2h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长48h的抑制试验结果；
图3是实施例2的同丝水霉菌水浴2h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长72h的抑制试验结果；
图4是实施例2的同丝水霉菌水浴2h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长96h的抑制试验结果；
图5是实施例2的同丝水霉菌水浴4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长120h的抑制试验结果；
图6是实施例2的同丝水霉菌水浴4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长24h的抑制试验结果；
图7是实施例2的同丝水霉菌水浴4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长48h的抑制试验结果；
图8是实施例2的同丝水霉菌水浴4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长72h的抑制试验结果；
图9是实施例2的同丝水霉菌水浴4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长96h的抑制试验结果；
图10是实施例2的同丝水霉菌水浴4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长120h的抑制试验结果；
图11是实施例3的同丝水霉菌水浴2h后镜检菌丝结果；
图12是实施例3的同丝水霉菌水浴4h后镜检菌丝结果；
其中图1～10中图左为无菌水处理的对照组，图右为溶壁酶处理的试验组；图11～12图左为对照组，图右为溶壁酶处理的试验组。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
除特别说明，本发明中的实验材料和试剂均为本技术领域常规市购产品。
本发明提出的溶壁酶对同丝水霉菌的抑制试验的工艺路线是：
培养菌丝→同丝水霉孢子悬液制备→溶壁酶对同丝水霉孢子抑制试验；
培养菌丝→溶壁酶对同丝水霉菌丝抑制试验。
实施例1：溶壁酶对同丝水霉孢子抑制试验
实验材料：
同丝水霉菌株：上海海洋大学农业部动植物病原库提供(编号：XJ00)；
溶壁酶：广东省微生物研究所提供。
1、药物培养基的制备：
称取8g溶壁酶溶于0.6mol/L甘露醇溶液最后定容至10mL，此时浓度为800mg/mL，将配此浓度的溶壁酶液于无菌操作下，用已灭菌的0.22μm过滤除菌装置过滤除菌，备用。吸取不同量的上述溶壁酶液加入灭菌冷却至40℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，小心混匀，迅速倾倒于培养皿中，使平板中溶壁酶的浓度分别为80mg/mL，40mg/mL，20mg/mL，10mg/mL，和5mg/mL，凝固后备用。阴性对照为不加溶壁酶的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
2、菌丝培养：
挑取保存于试管的同丝水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，25℃培养48h待用。
3、同丝水霉孢子悬液制备：
挑取保存于试管的同丝水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，在平板上添加适量无菌水25℃培养48h，期间适量增添无菌水。待同丝水霉菌丝长满整个平皿后，倒出诱生有孢子的无菌水，再用无菌水轻轻冲洗平板1次，经灭菌8层纱布过滤2次，取滤液采用血球计数法计数同丝水霉孢子悬液的浓度，再将同丝水霉孢子悬液稀释为103个/mL的浓度待用。
4、试验方法：
取浓度为103个/mL的同丝水霉孢子菌悬液0.1mL分别涂布于80mg/mL，40mg/mL，20mg/mL，10mg/mL，和5mg/mL不同溶壁酶浓度的药物马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，25℃培养5天。5天后通过肉眼判定无菌落生长的最低药物培养皿的药物浓度为溶壁酶抑制同丝水霉孢子的最低抑菌浓度(MIC)。每个浓度设3个对照，同时设不加溶壁酶的空白马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)对照。
实验于接种后第5天观察结果，以有无菌落生长为判断标准，与对照组比较，肉眼可见菌落生长者为无抑菌作用，无菌落生长者的药物最低浓度为药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示，溶壁酶的最低抑菌浓度为20mg/mL。
实施例2：溶壁酶对同丝水霉菌丝抑制试验
实验材料：
同丝水霉菌株：上海海洋大学农业部动植物病原库提供(编号：XJ00)；
溶壁酶：广东省微生物研究所提供。
1、药物培养基的制备：
称取8g溶壁酶溶于0.6mol/L甘露醇溶液最后定容至10mL，此时浓度为800mg/mL，将配此浓度的溶壁酶液于无菌操作下，用已灭菌的0.22μm过滤除菌装置过滤除菌，备用。吸取不同量的上述溶壁酶液加入灭菌冷却至40℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，小心混匀，迅速倾倒于培养皿中，使平板中溶壁酶的浓度分别为80mg/mL，40mg/mL，20mg/mL，10mg/mL，和5mg/mL；阴性对照为不加溶壁酶的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，凝固后备用。
2、菌丝培养：
挑取保存于试管的同丝水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，25℃培养48h待用。
3、试验方法：
将经马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)25℃培养48h后铺满平板的同丝水霉用无菌刀片切成约2cm2的小块。将切好的同丝水霉小块放入盛有上述最低抑菌浓度(即：20mg/mL)的溶壁酶液的试管和加无菌水的试管中(各装4mL)中，做3个平行，摇匀，放于30℃水浴锅内，水浴间歇不停的振荡试管(动作要温和)，分别水浴2.0h、4.0h。再用无菌镊子取出浸泡过的同丝水霉小块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，25℃培养观察5d。孵育期每24h观察一次(观察是否长有同丝水霉菌丝，可适当添加适量溶壁酶液)，肉眼判定无水霉菌落生长的，表示此种药物在该浓度该作用时间(有效杀灭浓度和作用时间)下对同丝水霉菌丝具有杀灭作用。每个浓度设3个对照，同时设经蒸馏水浸泡过的水霉块空白对照。
如图1～10所示为同丝水霉菌水浴2h或4h后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长24h、48h、72h、96h和120h的抑制试验结果。结果表明：溶壁酶处理的试验组与无菌水处理的对照组相对比，经溶壁酶处理之后的同丝水霉菌的生长得到抑制，溶壁酶对同丝水霉菌有明显的抑制作用。
实施例3：溶壁酶对同丝水霉菌丝抑制试验
实验材料：
同丝水霉菌株：上海海洋大学农业部动植物病原库提供(编号：XJ00)；
溶壁酶：广东省微生物研究所提供。
1、药物培养基的制备：
称取8g溶壁酶溶于0.6mol/L甘露醇溶液最后定容至10mL，此时浓度为800mg/mL，将配此浓度的溶壁酶液于无菌操作下，用已灭菌的0.22μm过滤除菌装置过滤除菌，备用。吸取不同量的上述溶壁酶液加入灭菌冷却至40℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，小心混匀，迅速倾倒于培养皿中，使平板中溶壁酶的浓度分别为80mg/mL，40mg/mL，20mg/mL，10mg/mL，和5mg/mL，凝固后备用。阴性对照为不加溶壁酶的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
2、菌丝培养：
挑取保存于试管的同丝水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，25℃培养48h待用。
3、试验方法：
将经马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)25℃培养48h后铺满平板的同丝水霉用无菌刀片切成约2cm2的小块。将切好的同丝水霉小块放入盛有上述最低抑菌浓度(即：20mg/mL)的溶壁酶液的试管和加无菌水的试管中(各装4mL)中，做3个平行，摇匀，放于30℃水浴锅内，水浴间歇不停的振荡试管(动作要温和)，分别水浴2.0h、4.0h。分别用无菌镊子取菌丝，在显微镜下观察。
如图11和图12所示为同丝水霉菌水浴2h或4h后镜检菌丝结果，结果表明：经水浴后同丝水霉菌的生长受到抑制，水浴2h与水浴4h的相比，水浴4h，溶壁酶对同丝水霉菌的抑制效果更好。
本发明提出一种安全、高效、环保的选择性抑杀同丝水霉菌的渔药替代孔雀石绿等化学药品，来抑制水霉病的产生，在水产养殖业有较大的应用前景。
以上对本发明提供的溶壁酶在抗鱼类真菌中的应用进行了详细的介绍，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.溶壁酶在抗鱼类真菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的鱼类真菌为同丝水霉菌。
3.溶壁酶在制备抗鱼类真菌药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗鱼类真菌药物为抗同丝水霉菌药物。
5.一种抗鱼类真菌药物，其特征在于：含有大于或等于最低抑菌浓度为20mg/mL的溶壁酶作为活性成分。
6.根据权利要求5所述的抗鱼类真菌药物，其特征在于，所述的抗鱼类真菌药物为抗同丝水霉菌药物。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105265361A (zh) * 2015-11-06 2016-01-27 广西壮族自治区水产科学研究院 泥鳅苗种培育方法
CN105272571A (zh) * 2015-10-14 2016-01-27 武汉瑞泽园生物环保科技有限公司 增强作物免疫力的微量元素水溶肥料及其制作方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105272571A (zh) * 2015-10-14 2016-01-27 武汉瑞泽园生物环保科技有限公司 增强作物免疫力的微量元素水溶肥料及其制作方法
CN105265361A (zh) * 2015-11-06 2016-01-27 广西壮族自治区水产科学研究院 泥鳅苗种培育方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林岗等: "山苍子精油对同丝水霉卵孢子和菌丝超微结构的影响", 《福建师范大学学报(自然科学版)》 *

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