CN107509730A - 一种壳聚糖制剂及其对甘薯采后黑斑病防治的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农产品病害防治领域，具体涉及壳聚糖在防治甘薯黑斑病中的应用。本发明提供了一种壳聚糖的制剂，该制剂含有壳聚糖粘度为60‑70mPa.s，脱乙酰度为85‑90％，制剂中壳聚糖的浓度未0.25‑2mg/mL，pH为6.0‑6.5。本发明提供的制剂在甘薯黑斑病防治中的应用，实验显示具有很好地防治甘薯黑斑病的效果。

Description

一种壳聚糖制剂及其对甘薯采后黑斑病防治的应用
技术领域
本发明属于农产品病害防治领域，具体涉及壳聚糖在防治甘薯黑斑病中的应用。
背景技术
甘薯是一种现代新型保健食品，在生物医药资源领域具有良好的发展前景。但甘薯是多发病作物，甘薯黑斑病是甘薯生产上分布广泛的一种重要病害。该病是由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted)侵染引起，主要危害块根及幼苗茎基部，易从伤口侵入，育苗期染病多因种薯带菌引起，贮藏期危害最重，是各甘薯产区危害最严重的一种常发病害，且在幼苗期、生长期和贮藏期均能发病。长期以来对甘薯黑斑病的防治一直以选育抗病品种和化学农药防治为主。但选育品质好又抗病的品种非常困难，育成品种多为垂直抗性，田间种植几年即丧失抗性，而化学农药的反复施用不可避免的带来环境污染与农产品农药残留问题，影响着生态环境和人类健康，因此，绿色、环保型农药的开发以及植物保护新技术的研究已经受到越来越多研究者的关注。
壳聚糖是一种多聚阳离子的天然高分子化合物。在农业方面，壳聚糖不仅能够有效抑制植物病原真菌孢子萌发和菌丝生长，还能够激发植物体内茉莉酸、水杨酸、乙烯等信号分子通路基因表达诱导植物产生抗性反应。曾有关于使用壳聚糖抑制甘薯黑斑病的报道(何日安等，2009)，但是在较高的壳聚糖浓度下对甘薯黑斑病菌的抑制作用仍然较弱，未取得理想的研究结果，无法有效防治甘薯黑斑病的发生。原因是，壳聚糖的抑菌作用和诱导植物抗性的活性受到多种因素的影响，且同一种壳聚糖对不同病原菌的抑制作用也存在较大差异。因此，必须对不同性质的壳聚糖进行严格筛选，并找到最佳的使用条件，才能够获得高效抑菌防病的壳聚糖制剂。
发明内容
壳聚糖是一种多聚阳离子的天然高分子化合物，来源于甲壳素的部分脱乙酰化，具有生物相容性、生物可降解性、无毒性、抗菌活性、抗肿瘤活性、免疫增强作用等。在农业方面，壳聚糖不仅能够有效抑制植物病原真菌孢子萌发和菌丝生长，还能够激发植物体内茉莉酸、水杨酸、乙烯等信号分子通路基因表达诱导植物产生抗性反应。抑菌活性和抗性诱导的双重作用使得壳聚糖在控制由病原菌引起的植物病害时具有化学药物无法比拟的优势。本发明目的在于提供一种壳聚糖制剂及其在防治甘薯黑斑病中的应用，解决了现有药剂对人体有害，污染环境的问题，从而能够简便有效的防治甘薯生产和储存过程中出现的甘薯黑斑病。
本发明提供了一种壳聚糖的制剂，该制剂含有壳聚糖粘度为60-70mPa.s，脱乙酰度为85-90％，制剂中壳聚糖的浓度未0.25-2mg/mL，pH为6.0-6.5。
另一方面，本发明提供所述的制剂在甘薯黑斑病防治中的应用。进一步的，该制剂可以应用于甘薯生长、甘薯采后黑斑病的防治。
本发明还提供了一种上述制剂的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖粉末溶于体积百分比为0.5％的醋酸溶液中，配置成0.25-2mg/mL的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调节pH为6.0-6.5。使用时，壳聚糖的浓度可根据需要进行调整。
本发明还提供了上述制剂在抑制甘薯黑斑病菌菌丝生长和分生孢子产生中的应用，包含以下步骤：将适量壳聚糖溶液添加至PDA培养基中，充分混匀得到壳聚糖终浓度为0.25、0.5、1、2mg/mL的含药培养基(pH调整至6.0-6.5左右)，倒平板冷却待用。用6mm打孔器在培养10d的菌落边缘打取菌饼，分别将其菌丝面向下接入各PDA培养基平板中央，分别置于25℃的培养箱中恒温培养进行离体实验。可以有效抑制甘薯黑斑病菌菌落的生长，并降低病原菌的分生孢子产生量。
本发明还提供了上述制剂对鲜切甘薯片黑斑病的防治作用，包含以下步骤：挑选表面无损伤的甘薯，去皮切取若干3×3×0.5cm3的鲜切甘薯块。分别夹取甘薯片放入不同浓度的上述制剂中浸泡10min。室温晾干(约3-4h)后，夹取甘薯块在孢子悬浮液中(1.0×106个/mL)浸蘸10s，室温晾干(约3-4h)。放置在相对应的湿室中，于25℃恒温箱培养箱中培养。鲜切甘薯片实验表明，上述制剂可明显减轻黑斑病的发病情况。
本发明还提供了上述制剂对甘薯整薯上黑斑病的防治作用，包含以下步骤：选取若干健康甘薯，用无菌水冲洗，室温晾干(约3-4h)。用接种针在甘薯腰部针刺20个伤口。将晾干的甘薯浸泡在2mg/mL壳聚糖溶液中10min，室温晾干。将甘薯浸泡在病原菌孢子悬浮液中10s，室温晾干后，放入无菌保鲜盒中。25℃恒温培养18d。整薯实验表明，上述制剂可有效防治采后甘薯黑斑病的发生。
采用上述壳聚糖制剂不仅可在离体条件下抑制甘薯黑斑病的生长，而且在甘薯活体上也能有效防治黑斑病的发生。
有益效果：
本发明所使用的壳聚糖制剂安全性好，成本低，配制方法简单，防治方法简便。且防治效果好，不仅可以直接抑制甘薯黑斑病菌的菌落生长和孢子产生，还可以诱导甘薯对黑斑病产生抗性，有效防治甘薯采后黑斑病的发生。
附图说明
图1.不同浓度壳聚糖对鲜切甘薯片黑斑病的防治作用(72h)
图2.壳聚糖对甘薯黑斑病的防治作用(18d)
具体实施方式
具体技术方案如下：
1.壳聚糖制剂的制备方法
称取1.5g粘度为60-70mPa.s，脱乙酰度为85-90％的壳聚糖粉末，在超净工作台中紫外灯照射12h，加入适量无菌水中，轻微搅拌待壳聚糖粉末在水中充分溶胀，滴加醋酸0.5mL，磁力搅拌至壳聚糖完全溶解，加无菌水定容至100mL，配置成浓度为15mg/mL的壳聚糖母液。按照倍比稀释法可将壳聚糖母液浓度调整至0.25-2mg/mL，用NaOH溶液调节pH为6.0-6.5。使用时，壳聚糖的浓度可根据需要进行调整。
2.壳聚糖制剂对甘薯黑斑病菌菌丝生长和产孢量的影响
将PDA培养基(去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)在121℃下灭菌20min，按照倍比稀释法滴加适量壳聚糖母液至PDA培养基中，充分混匀得到壳聚糖终浓度为0.25、0.5、1、2mg/mL的含药培养基(pH调整至6.0-6.5左右)，倒平板冷却待用。用6mm打孔器在培养10d的菌落边缘打取菌饼，分别将其接入各PDA培养基平板中央，分别置于25℃的培养箱中恒温培养，每个处理设3个重复。未加入壳聚糖的PDA平板和加入等量0.5％醋酸溶液的PDA作为对照。10d后用十字交叉法测定菌落直径。用定量的无菌水冲洗各平板，用血球计数板计算产孢量。按下列公式计算抑制率：
结果如表1所示，壳聚糖对甘薯黑斑病菌有明显抑制作用，能有效抑制甘薯黑斑病菌菌丝的生长。甘薯黑斑病菌培养10d后，无菌水对照组和醋酸对照组甘薯黑斑病菌菌丝生长直径为52.67和50.33mm，壳聚糖处理组0.25,0.5,1和2mg/mL浓度下菌丝直径分别为49.00,47.33,12.33和9.33mm，随着壳聚糖浓度的升高，菌丝直径逐渐减小。对菌丝生长的抑制率，从6.97％提高到82.29％。甘薯黑斑病菌培养10d后，无菌水对照组和醋酸对照组甘薯黑斑病菌产孢量为9.03×106和8.00×106个/mL，壳聚糖处理组0.25,0.5,1和2mg/mL浓度下菌丝直径分别为7.40×106,5.77×106,2.24×105和4.00×104个/mL，随着壳聚糖浓度的升高，产孢量逐渐减小。可知在一定范围内，壳聚糖浓度越高抑菌作用越强，因此可以得出结论壳聚糖对甘薯黑斑病菌有良好的抑菌效果。
3.壳聚糖制剂对鲜切甘薯片上黑斑病的防治
按照上述方法配置0.25,0.5,1和2mg/mL的壳聚糖溶液(pH调整至6.0-6.5左右)。另设无菌水和0.5％醋酸溶液(pH 6.0-6.5)对照组。
配制孢子悬浮液。在无菌室中，取5mL的无菌水加入生长有甘薯黑斑病菌的培养皿中，用涂布棒将孢子洗下。经适当稀释后获得1.0×106个/mL的甘薯黑斑病菌的孢子悬浮液。用烧杯盛放孢子悬浮液。
挑选表面无损伤的甘薯，去皮切取若干3×3×0.5cm3的鲜切甘薯块备用。
准备湿室。用镊子取无菌滤纸，放置在一次性的培养皿中。用移液枪吸取1mL无菌水，浸湿滤纸。
用无菌镊子分别夹取甘薯片放入不同浓度的壳聚糖溶液、无菌水和醋酸溶液中浸泡10min。室温晾干(约3-4h)后，用镊子夹取甘薯块，在孢子悬浮液中浸蘸10s。室温晾干(约3-4h)后，将甘薯块分别放置在相对应的培养皿中，置于25℃恒温箱培养箱中培养。
结果如图1所示，壳聚糖制剂处理明显降低了鲜切甘薯片上黑斑病的发病情况。如表2所示，壳聚糖制剂处理组可以有效延迟鲜切干薯片上黑斑病的发病情况，并降低病情指数。0.5和1mg/mL壳聚糖处理后，鲜切甘薯片48h内不发病。2mg/mL的壳聚糖处理后，鲜切甘薯片72h内不发病，明显低于对照组77.78％发病的情况。鲜切甘薯片实验表明，上述制剂可明显减轻黑斑病的发病情况。
4.壳聚糖制剂对甘薯整薯上对黑斑病的防治
选取若干健康甘薯，用无菌水冲洗，室温晾干(约3-4h)。用无菌接种针在甘薯腰部针刺20个伤口。将晾干的甘薯分别浸泡在2mg/mL壳聚糖溶液、无菌水和0.5％醋酸溶液(pH6.0-6.5)中10min，室温晾干。按照上述方法制备病原菌孢子悬浮液(1.0×106个/mL)。将甘薯浸泡在病原菌孢子悬浮液中10s，室温晾干后，放入无菌保鲜盒中。25℃恒温培养18d。
结果如图2所示，培养18d后，无菌水处理组的甘薯横切面已经整体变黑，表明甘薯已经严重发病。而2mg/mL壳聚糖处理组的甘薯横切面，没有明显发病情况，甘薯横切面正常、健康。证明本壳聚糖制剂可以有效防治甘薯采后黑斑病的发生。
表1不同浓度壳聚糖对甘薯黑斑病菌菌丝生长和产孢量的影响
*同列中小写字母不同，表示在p＜0.05水平上差异显著。
表2不同浓度壳聚糖处理对鲜切甘薯薯片病情指数(％)的影响

Claims (6)

1.一种壳聚糖的制剂，其特征在于，该制剂含有壳聚糖粘度为60-70mPa.s，脱乙酰度为85-90％，制剂中壳聚糖的浓度未0.25-2mg/mL，pH为6.0-6.5。
2.一种如权利要求1所述的制剂在甘薯黑斑病防治中的应用。
3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用于甘薯生长、甘薯采后黑斑病的防治。
4.如权利要求1所述的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将壳聚糖粉末溶于体积百分比为0.5％的醋酸溶液中，配置成0.25-2mg/mL的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调节pH为6.0-6.5。
5.如权利要求1所述的制剂在抑制甘薯黑斑病菌菌丝生长和分生孢子产生中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：
将适量壳聚糖溶液添加至PDA培养基中，充分混匀得到壳聚糖终浓度为0.25、0.5、1、2mg/mL的含药培养基，pH调整至6.0-6.5，倒平板冷却待用，用6mm打孔器在培养10d的菌落边缘打取菌饼，分别将其菌丝面向下接入各PDA培养基平板中央，分别置于25℃的培养箱中恒温培养进行离体实验。
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