CN108424404A - 一种抗甘薯黑斑病菌的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种可用于抗甘薯黑斑病菌的化合物，经鉴定，其为2‑(1‑羟基‑2‑乙酰氧基)丙基‑7‑氧杂二环[4.1.0]‑2,4‑庚二烯。该化合物的制备方法为，将一株肉座目真菌(Hypocreales sp.)菌株活化培养后接种到培养基上进行发酵培养，再将发酵培养后的上清液用乙酸乙酯萃取，浓缩，得乙酸乙酯浸膏，最后将乙酸乙酯浸膏经两次柱层析纯化，得到目标产物。该化合物对甘薯黑斑病菌的抑制作用实验结果表明，其对甘薯黑斑病菌具有很好的抑制作用，可作为生物农药替代化学农药用于防治甘薯黑斑病。该化合物为天然产物，无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。

Description

一种抗甘薯黑斑病菌的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物农药领域，尤其涉及一种抗甘薯黑斑病菌的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
甘薯黑斑病菌，又称甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata EllisetHalsted)，其侵染甘薯能引起甘薯黑斑病，是甘薯生产中的一种重要病害，分布广泛，对我国甘薯生产造成严重损失。目前，对甘薯黑斑病的防治技术主要包括农业防治和化学防治。农业防治是指防治农作物病害所使用的农业技术，即改变作物的生长环境，以增强作物对病害的抵抗力。农业防治的主要措施包括三个方面：一、育种，即选择具有抗病性的种子，从而得到健康种苗；二、田间管理，即合理施肥，及时灌溉松土；三、田间布局，即实施轮作和调节播种期等。农业防治措施的效果不能立竿见影，是随着逐年的积累显现出来的，因此只是具有一定的预防作用，且还受人力、季节和地区等多种因素的限制，效果不明显易见。化学防治是用化学药剂来防治植物病害的技术。化学农药具有经济效益高、效率高、效果明显、方便、快捷等优点，但如果使用不当不仅对植物产生伤害，杀害有益微生物，还会引起人畜中毒，甚至导致病原微生物产生抗药性。农药的高残留还会对生态环境造成严重污染。因此，寻找新的防治甘薯黑斑病菌的方法迫在眉睫。
生物防治是利用各个生物之间的关系，即用一种生物抑制另一种不同生物，或者是利用生物的代谢产物，即生物农药来防治病害的方法。生物防治具有特异性强、毒性低、病原菌不易产生抗药性、天然产物易降解、对环境污染小等优点，现已成为植物病害防治发展的一个重要方向，成为现代科技工作者研究的重点领域。目前，有关拮抗甘薯黑斑病菌的生物农药鲜有报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可用于抗甘薯黑斑病菌的化合物，其结构式如下式(Ⅰ)所示，
本发明的另一个目的在于提供上述化合物的制备方法，包括步骤：
S1：将肉座目真菌(Hypocreales sp.)菌株活化培养后接种到培养基上进行发酵培养，其中，所用肉座目真菌(Hypocreales sp.)菌株保藏编号为CGMCC NO：14981；
S2：将发酵培养后的上清液用乙酸乙酯萃取，浓缩，得乙酸乙酯浸膏；
S3：将乙酸乙酯浸膏装柱、洗脱、柱层析纯化，得到目标产物。
优选的，所述步骤S3中的洗脱以石油醚-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯-甲醇混合液和纯甲醇为洗脱溶剂。
优选的，所述步骤S3中的柱层析纯化利用石油醚-丙酮混合液进行洗脱。
优选的，所述石油醚与丙酮的体积比为3：7。
本发明还提供了上述化合物在生物防治中的应用。
优选的，生物防治的对象为甘薯黑斑病菌。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种新型的可用于防治甘薯黑斑病菌的化合物；
2.本发明的防治甘薯黑斑病菌的化合物制备方法，工艺简单易行、条件温和、易于控制；
3.以真菌发酵的产物防治甘薯黑斑病，成本低、使用简单，且无污染、无毒素残留、对人畜和环境不构成危害。
本发明所用的菌种保藏日期为2017年11月24日，保藏编号为：CGMCC No.14981。分类名称为：肉座菌目真菌(Hypocreales sp.)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
附图说明
图1为本发明实施例1所述化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的1H NMR图谱(400MHz，CDCl3)；
图2为本发明实施例1所述的化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的13C NMR图谱(100MHz，CDCl3)；
图3为本发明实施例1所述的化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的1H-1H COSY图谱(CDCl3)；
图4为本发明实施例1所述的化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的13C/DEPT135NMR图谱(CDCl3)；
图5为本发明实施例1所述的化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的HSQC图谱(CDCl3)；
图6为本发明实施例1所述的化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的HMBC图谱(CDCl3)。
具体实施方式：
实施例1：抗甘薯黑斑病菌的化合物的制备
将菌株KLBMP-Pt686发酵液30L与乙酸乙酯按1：1比例萃取3次，合并后减压浓缩干燥得乙酸乙酯浸膏(9.5g)。将所得的浸膏与硅胶(200-300目)进行拌样，混匀后干法上硅胶柱(450mm×55mm，200-300目)进行分离，以石油醚：乙酸乙酯(10：1和1：1)，乙酸乙酯：甲醇(1：1)和甲醇为洗脱溶剂进行梯度洗脱，共收集60个组分。将收集的组分再次进行硅胶柱层析，利用石油醚：丙酮(3：7)混合液洗脱，流出液按10mL/瓶收集，挥干溶剂，得到淡黄色固体，即为目标化合物(31.0mg)。该化合物的表征为：淡黄色固体，熔点77.1℃-78.0℃，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等，1H-NMR(500MHz，CDCl3)，δH：1.57(s，3H，H-2”)，1.76～1.80(d，3H，H-3')，2.90～2.94(b，1H，1'-OH)，4.06～4.09(d，2H，H-1/H-6)，4.24～4.27(m，1H，H-1')，4.34～4.39(m，1H，H-2')，5.68～5.73(m，1H，H-3)，5.87～5.96(m，1H，H-4)，6.85～6.87(m，1H，H-5)，其中s表示单峰，d表示双峰，b表示宽峰，m表示多重峰；13C-NMR(100MHz，CDCl3)，δc：79.79.20(C-1)，133.82(C-2)，125.84(C-3)，131.19(C-4)，133.04(C-5)，63.97(C-6)，79.75(C-1')，79.17(C-2')，18.12(C-3')，167.01(C-1”)，18.78(C-2”)。该化合物的1H NMR图谱(400MHz)如图1所示，13C NMR图谱(100MHz)如图2所示，1H-1H COSY图谱如图3所示，13C/DEPT135NMR图谱如图4所示，HSQC图谱如图5所示，HMBC图谱如图6所示。根据以上数据确定该化合物为2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯，其结构式如下：
实施例2：化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯的对甘薯黑斑病菌的抑制作用测定
吸取100μL的甘薯黑斑病孢子悬液(1×106cfu/mL)涂抹在PDA平板上，在平板中心位置垂直放上牛津杯，然后轻微加压使牛津杯与培养基表面无空隙。
将化合物2-(1-羟基-2-乙酰氧基)丙基-7-氧杂二环[4.1.0]-2,4-庚二烯用20％的DMSO溶解并配制成浓度为400μg/mL、200μg/mL和100μg/mL的溶液。
在牛津杯中分别加入上述不同浓度的样品溶液200μL(以20％DMSO无菌溶液做对照)，重复三次。加好样品后的平板放置培养箱中培养4d，观察抑菌结果并测量抑菌圈直径。
结果显示，目标化合物浓度在400μg/mL时对甘薯黑斑病的平均抑菌圈直径为33.33±1.53mm，浓度在200μg/mL时对甘薯黑斑病的平均抑菌直径为25.33±0.58mm，当浓度在100μg/mL时对甘薯黑斑病的平均抑菌直径为16.00±1.00mm。实验结果表明，该化合物对甘薯黑斑病菌具有很好的抑制作用。

Claims (7)

1.一种抗甘薯黑斑病菌的化合物，其特征在于，其结构式如下式(Ⅰ)所示，
2.制备权利要求1所述的抗甘薯黑斑病菌的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将肉座目真菌(Hypocreales sp.)菌株活化培养后接种到培养基上进行发酵培养，所述肉座目真菌(Hypocreales sp.)菌株保藏编号为CGMCC NO：14981；
S2：将发酵培养后的上清液用乙酸乙酯萃取，浓缩，得乙酸乙酯浸膏；
S3：将乙酸乙酯浸膏装柱、洗脱、两次柱层析纯化，得到目标产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中第一次柱层析纯化的洗脱以石油醚-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯-甲醇混合液和纯甲醇为洗脱溶剂。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的第二次柱层析纯化以石油醚-丙酮混合液进行洗脱。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述石油醚与丙酮的体积比为3：7。
6.权利要求1所述的化合物在生物防治中的应用。
7.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物防治的对象为甘薯黑斑病菌。
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