CN106536742A - D‑赤藓糖和乙酰磷酸的酶促生产方法 - Google Patents

D‑赤藓糖和乙酰磷酸的酶促生产方法 Download PDF

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Abstract

描述了生产D‑赤藓糖和乙酰磷酸的方法，包括通过利用磷酸酮醇酶将D‑果糖酶促转化成D‑赤藓糖和乙酰磷酸。生产的D‑赤藓糖可以通过生产乙醇醛的方法进一步转化成乙醇醛，上述生产乙醇醛的方法包括通过利用醛缩酶将D‑赤藓糖酶促转化成乙醇醛，其中所述醛缩酶是2‑脱氧核糖‑5‑磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖‑二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)。通过利用磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶将由此生产的乙醇醛酶促转化成乙酰磷酸，可以将生产的乙醇醛最终转化成乙酰磷酸。

Description

D-赤藓糖和乙酰磷酸的酶促生产方法
发明领域
本发明涉及生产D-赤藓糖和乙酰磷酸的方法，其包括通过利用磷酸酮醇酶将D-果糖酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。生产的D-赤藓糖可以通过生产乙醇醛的方法进一步转化成乙醇醛，上述方法包括利用醛缩酶将D-赤藓糖酶促转化成乙醇醛，其中所述醛缩酶是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)。通过利用磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶将由此生产的乙醇醛酶促转化成乙酰磷酸，可以将生产的乙醇醛最终转化成乙酰磷酸。
过去数十年来，代谢工程从业者致力于开发生产化学品的生物方案，从而提供更多传统化学方法的替代。通常，生物方案使人们得以利用可再生原料(例如糖)，与现有的基于石油化学的方法竞争。用于生产化学品的多步骤生物方案通常包括作为催化剂的微生物，用于将原料转化成目标分子。一整套用于特定目标分子的酶反应可以分组成属于中心碳路径的反应和属于产物特异性路径的反应。属于中心碳和产物特异性路径的反应的关联在于每个酶反应的氧化还原(通常，NAD(P)H)和能量(通常，ATP)限制必须导致促成方法竞争力的总的平衡。历史上，将在糖上异养生长的中心碳路径描述为Embden-Meyerhoff-Parnas路径(EMPP；即，“糖酵解”)、戊糖磷酸路径(PPP)、Entner-Doudoroff路径(EDP)和磷酸酮醇酶路径(PKP)(参见Gottschalk(1986),Bacterial Metabolism,第二版,Springer-Verlag,New York)。每种中心路径或中心路径的组合均就特定目标分子而言提供优势和劣势。为了提供有竞争力的生物方法，已经描述了具有涉及EMPP、PPP和EDP的修饰的重组微生物(M.Emmerling等人,Metab.Eng.1:117(1999)；L.O.Ingram等人,Appl.Environ.Microbiol.53:2420(1987)；C.T.Trinh等人,Appl.Environ.Microbiol.74:3634(2008))。再最近，已经描述了具有涉及PKP的修饰的重组微生物(参见Sonderegger等人Appl.Environ.Microbiol.70(2004),2892-2897,美国专利7,253,001,Chinen等人J.Biosci.Bioeng.103(2007),262-269,美国专利7,785,858；Fleige等人,Appl.Microbiol.Cell Physiol.91(2011),769-776)。
EMPP(糖酵解)将1mol葡萄糖转化成2mol丙酮酸(PYR)。当需要乙酰辅酶A时，可以将1mol PYR转化成1mol乙酰辅酶A(AcCoA)，同时产生1mol CO2和1mol NADH。总的反应在方程1中给出。
葡萄糖+2ADP+2H3PO4+2CoA+4NAD+→
2乙酰辅酶A+2CO2+2ATP+2H2O+4NADH+4H+
(方程1)
PPP提供了将1mol葡萄糖转化成1mol CO2和2mol NADPH、同时产生0.67mol果糖-6-磷酸(F6P)和0.33mol甘油醛-3-磷酸(GAP)的方式。由此形成的F6P和GAP必须通过其他反应路径代谢，例如，通过EMPP。EDP将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1mol PYR，同时产生1molNADPH。与PPP同样，由此形成的GAP必须通过其他反应路径代谢。PKP提供了将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1.5mol乙酰磷酸(AcP)的方式。当需要乙酰辅酶A时，通过磷酸转乙酰酶的作用可以将1当量AcP加1当量辅酶A(CoA)转化成1当量乙酰辅酶A和1当量无机磷酸(Pi)。
对于源自通过PKP产生的AcCoA部分以及与AcCoA部分接近氧化还原中性的特定目标分子，在整体能量平衡上存在缺陷。PKP(类似地，以及PPP和EDP)不产生用于将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的ATP。在依赖于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的葡萄糖摄取的情形中，PEP必须通过其他方式产生，例如通过EMPP。通过PKP回收GAP使问题加剧，特别是当产物特异性路径提供极少ATP时。
Sonderegger(见上文)和美国专利7,253,001公开了包括天然或超量表达的磷酸酮醇酶活性以及超量表达的磷酸转乙酰酶的重组酿酒酵母菌株，以增加葡萄糖/木糖混合物转化成乙醇的收率。这些菌株特征在于EMPP和PPP起作用的不依赖于PEP的葡萄糖摄取。
Chinen(见上文)和美国专利7,785,858公开了选自肠杆菌科家族、棒状杆菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的重组细菌，其包括增加的磷酸酮醇酶活性，用于将葡萄糖转化成经由中间体乙酰辅酶A产生的目标分子，包括L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸和多羟基丁酸。这些菌株特性在于EMPP起作用的依赖于PEP的葡萄糖摄取。值得注意，与野生型或未修饰的菌株相比较，美国专利7,785,858的细菌中磷酸果糖激酶的活性降低(参见第33页)。
存在对提供以下方法的需求：其包括中心碳和产物特异性路径，通过对酶反应的氧化还原和能量限制加以最佳适应，使原料到产物的转化得以最大化，从而允许能量上高效地生产乙酰辅酶A前体——在许多生物、特别是可用于由可再生资源生产大量工业上重要的化合物的微生物的分解代谢中最为中心的代谢物之一。通过提供权利要求所定义的实施方式，申请人已经解决了这一需求。
而且，在生物技术领域，不仅需要允许能量上高效地生产乙酰辅酶A前体，而且还需要生产赤藓糖醇及其前体D-赤藓糖。赤藓糖醇是一种四碳多元醇，其用作食品和制药工业应用的生物甜味剂。它还可以用作用于糖尿病和肥胖人群的特殊食品的功能性糖替代物。而且，赤藓糖醇可以安全地在食物中用作非致龋甜味剂，因为它不能被导致龋齿的细菌发酵。赤藓糖醇还用作生产其他糖的起始原料。尽管赤藓糖醇可以通过化学方法生产，其中在镍催化剂的存在下通过高温化学反应将二醛淀粉转化成赤藓糖醇，由于收率低，该化学方法没有达成工业化。因此，目前，赤藓糖醇在商业上主要使用嗜高渗酵母通过微生物方法生产。赤藓糖醇日益受欢迎，在食品工业中存在增长的需求。因此，通过使用生物方法大量生产赤藓糖醇、特别是其前体变得日益重要。D-赤藓糖是赤藓糖醇的直接前体，其很容易如下所述转化成赤藓糖醇；综述参见Moon等人,Appl Microbiol.Biotechnol,86:1017-1025(2010)。因此，对于生产赤藓糖醇的前体D-赤藓糖存在日益增加的需求。
本发明提供一种生产D-赤藓糖和乙酰磷酸的方法，其包括通过利用磷酸酮醇酶将D-果糖和磷酸酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。然后可以将生产的乙酰磷酸，乙酰辅酶A前体如下文进一步所述有益地转化成乙酰辅酶A，而生产的D-赤藓糖可以通过利用本领域已知酶的方法转化成赤藓糖醇。事实上，真核生物含有通过依赖于NAD(P)H的还原反应催化赤藓糖还原产生赤藓糖醇的赤藓糖还原酶；综述参见Moon等人,ApplMicrobiol.Biotechnol,86:1017-1025(2010)。
产生的D-赤藓糖可以通过生产乙醇醛的方法进一步转化成乙醇醛，上述方法包括通过利用醛缩酶将D-赤藓糖酶促转化成乙醇醛，其中所述醛缩酶是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶或果糖-二磷酸醛缩酶。通过利用磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)将由此产生的乙醇醛酶促转化成乙酰磷酸，产生的乙醇醛可以最终转化成乙酰磷酸。从D-葡萄糖开始，通过利用葡萄糖-果糖异构酶将D-葡萄糖酶促转化成D-果糖，可以得到上述D-果糖。对应的反应在图1中图示。因此，通过进行上述反应，产生乙酰磷酸，其然后可以通过磷酸转乙酰酶转化成乙酰辅酶A，所述乙酰辅酶A然后可以有益地用于生产代谢物，例如源自乙酰辅酶A的烯烃或丙酮。相对于天然的代谢路径，上述生产乙酰辅酶A的人造代谢路径具有乙酰磷酸(以及因此乙酰辅酶A)的收率增加的优势。这是由于，在最后，从葡萄糖作为底物开始，产生3个乙酰辅酶A分子(没有花费ATP)，而天然存在的EMMP路径(糖酵解)仅产生2个乙酰辅酶A分子。
因此，一方面，本发明涉及生产D-赤藓糖和乙酰磷酸的方法，其包括通过根据以下反应利用磷酸酮醇酶将D-果糖和磷酸酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸：
D-果糖+磷酸→D-赤藓糖+乙酰磷酸+H2O
本发明人出人意料地发现，分类为磷酸酮醇酶的酶能够催化根据以上反应的D-果糖和磷酸酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。这是令人惊讶的因为尚不知晓非磷酸化形式的D-果糖是磷酸酮醇酶的底物。
已知不同类型的磷酸酮醇酶，其所有均可以用于根据本发明的方法中。通常，基于就其天然催化的反应而言的底物优先性将磷酸酮醇酶分成两种类型：木酮糖-5-磷酸(X5P)磷酸酮醇酶，其分类为EC 4.1.2.9并且天然地使用X5P和果糖-6-磷酸(F6P作为底物、但优选X5P；以及X5P/果糖-6-磷酸(F6P)磷酸酮醇酶，其分类为4.1.2.22并且以可比较的活性使用X5P和F6P作为底物(Suzuki等人,J.Biol.Chem.44(2010),34279-34287)。在下文中，术语“磷酸酮醇酶”始终指两种类型。
因此，X5P磷酸酮醇酶是分类为EC 4.1.2.9并且能够催化以下反应的酶：
D-木酮糖-5-磷酸+磷酸→D-甘油醛-3-磷酸+乙酰-磷酸+H2O
分类为EC 4.1.2.22的另一类型的磷酸酮醇酶通常称作果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶并且天然地能够催化以下反应：
D-果糖-6-磷酸+磷酸→乙酰磷酸+D-赤藓糖-4-磷酸+H2O
另外存在有磷酸酮醇酶指定为两种类型的磷酸酮醇酶的类型，例如，在来自Nitrolancetus hollandicus Lb的磷酸酮醇酶的情形中，或者识别出的磷酸酮醇酶尚未指定为两种类型中任一者，但通常简单地分类为磷酸酮醇酶。当在本文中使用时，术语“磷酸酮醇酶”也指这些磷酸酮醇酶。
因此，在根据本发明方法的一实施方式中，通过利用分类为EC 4.1.2.9中的磷酸酮醇酶的磷酸酮醇酶，实现将D-果糖和磷酸酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。该酶已经在许多种生物中识别出，特别是例如细菌和真菌的微生物。在一优选的实施方式中，磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.9)来源于原核生物，特别是细菌。例如，已经描述酶在以下中发现：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Uniprot登陆号：Q88S87；Q88U67)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)(Uniprot登陆号：Q937F6)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)(Uniprot登陆号：A0PAD9)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Uniprot登陆号：Q9AEM9)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrovibrio fibrisolvens)、肠道丝状杆菌(Fibrobacter intestinalis)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、Starkeya novella、硫杆菌属物种(Thiobacillus sp.)、Thermobispora bispora(菌株ATCC 19993/DSM 43833/CBS 139.67/JCM 10125/NBRC14880/R51；Uniprot登陆号D6YAD9)、Thermobaculum terrenum(菌株ATCC BAA-798/YNP1；Uniprot登陆号D1CI63)和Nitrolancetus hollandicus Lb(Uniprot登陆号I4EJ52)。
在另一优选实施方式中，磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.9)来源于真核生物，优选真菌，如，酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisia)。例如，已经描述酶在以下中发现：构巢裸壳孢菌(Emericella nidulans)(Uniprot登陆号：Q5B3G7)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)(Uniprot登陆号：C1K2N2)、博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)、弯假丝酵母(Candidacurvata)、无名假丝酵母(Candida famata)、土生假丝酵母(Candida humicola)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、近平滑假丝酵母NCYC 926、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、Cyberlindnera jadinii、Cyberlindnera saturnus、Debaromycesrobertsiae、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、Kluyveromyces phaseolosporus、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、Ogataea angusta、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、Priceomyces medius、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Rhodospiridium toruloides、黏红酵母(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.9)的酶促活性可以用本领域技术人员已知的方法评价。例如，这些方法描述于Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)和Suzuki等人(ActaCryst.F66(2010),941–943)中。
磷酸酮醇酶(如上文所述，EC 4.1.2.9和EC 4.1.2.22通常分别称作木酮糖5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖6-磷酸磷酸酮醇酶)在结构上和功能上都很明确。例如，作为EC 4.1.2.9和EC 4.1.2.22的磷酸酮醇酶的代表，Petrareanu等人(Acta Crystallographica F66(2010),805-807)描述了已经显示对于木酮糖5-磷酸和果糖6-磷酸二者作为底物均有活性的酶——来自乳酸乳球菌的木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶的X-射线晶体学分析。
在根据本发明方法的另一实施方式中，通过利用分类为EC 4.1.2.22中的果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶的磷酸酮醇酶，实现将D-果糖和磷酸酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。该酶已经在许多种生物中识别出，特别是例如细菌和真菌的微生物。在一优选的实施方式中，果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(EC4.1.2.22)来源于原核生物，优选细菌。例如，已经描述酶在以下中发现：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Uniprot登陆号：Q9AEM9)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)，特别是假长双歧杆globosum亚种、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、Bifidobacterium mongoliense、Bifidobacterium bombi、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、木葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacter xylinus)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、肠膜明串珠菌和Nitrolancetus hollandicus Lb(Uniprot登陆号I4EJ52)。
在另一优选的实施方式中，果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.22)来源于真核生物，优选真菌，例如，酵母，例如巴斯德酵母(S.pastorianus)。例如，已经描述酶发现于以下中：假丝酵母属物种、假丝酵母属物种107、热带假丝酵母、黏红酵母、禾本红酵母和巴斯德酵母。
酶在结构上和功能上是很明确的。例如，Suzuki等人(Acta CrystallographicaF66(2010),941-943；J.Biol.Chem.285(2010),34279-34287)描述了来自短双歧杆菌的磷酸酮醇酶的超量表达、结晶和X-射线分析。例如，编码来自乳酸双歧杆菌的木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶的基因描述于Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中。
果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.22)的酶促活性可以用本领域技术人员已知的方法评价。例如，该方法描述于Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)和Suzuki等人(Acta Cryst.F66(2010),941–943)中。
其他尚未分类至EC 4.2.1.9或EC 4.2.1.22中并且可以用于根据本发明的方法的磷酸酮醇酶为，例如，来自Thermosynechococcus elongatus(菌株BP-1；Uniprot登陆号：Q8DJN6)的磷酸酮醇酶、来自凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)36D1(Uniprot登陆号：G2TIL0)的磷酸酮醇酶、来自乳酸乳球菌乳酸亚种(菌株KF147；Uniprot登陆号：A9QST6)的磷酸酮醇酶、来自假长双歧杆菌globosum亚种(Uniprot登陆号：Q6R2Q6)的磷酸酮醇酶和来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(菌株ATCC 824；Uniprot登陆号：Q97JE3；Servisky等人(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.39(2012),1859-1867)；SEQ ID NO:2)的磷酸酮醇酶。
在所附实施例中，显示出假长双歧杆菌globosum亚种(Uniprot登陆号：Q6R2Q6；SEQ ID NO:1)、丙酮丁醇梭菌(菌株ATCC 824；Uniprot登陆号：Q97JE3；SEQ ID NO:2)以及乳酸乳球菌乳酸亚种(菌株KF147；Uniprot登陆号：A9QST6；SEQ ID NO:3)的磷酸酮醇酶能够将D-果糖和磷酸转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。
在优选的实施方式中，本发明的方法中使用的磷酸酮醇酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1-3中任一个所示，或者显示出与SEQ ID NO:1-3中任一个的同源性为至少x％，并且具有磷酸酮醇酶活性，x为30至100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这样的酶能够如本文以上所述将D-果糖和磷酸转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。优选地，同一性程度通过将各个序列与上述SEQ ID NO中任一个的氨基酸序列比较确定。当比较的序列不具有相同长度时，同一性程度优选地是指与序列较长的氨基酸残基相同的序列较短的氨基酸残基的百分比，或者与序列较短的氨基酸残基相同的序列较长的氨基酸残基的百分比。序列同一性程度可以根据本领域公知的方法使用优选合适的计算机算法例如CLUSTAL确定。
当使用Clustal分析方法确定特定序列是否与参考序列例如80％相同时，可以使用缺省设定，或者设定优选如下：矩阵：blosum 30；开放间隙罚分：10.0；延长间隙罚分：0.05；延迟发散：40；间隙分隔距离：8用于比较氨基酸序列。对于核苷酸序列比较，延长间隙罚分优选设定为5.0。
优选地，同一性程度在序列的整个长度上计算。
已经说明，磷酸酮醇酶序列的多重对比显示出若干高度保守的区域，这些区域中的两个用作磷酸酮醇酶的标志模式(http://prosite.expasy.org/PDOC60002)。第一个标志模式是E-G-G-E-L-G-Y，第二个标志模式是G-x(3)-[DN]-x-P-x(2)-[LIVFT]-x(3)-[LIVM]-x-G-D-G-E。第一个标志模式的功能尚未知晓，而第二个标志模式与硫胺素焦磷酸结合位点相应。因此，在优选的实施方式中，在本文中如上述定义的磷酸酮醇酶具有以下氨基酸序列：其含有上述两个标志模式中的至少一个，优选含有至少第二个标志模式，再更优选含有两个标志模式。
序列对比显示，不同来源磷酸酮醇酶的整体序列同一性可以低至大约26％。例如，Meile等人(J.Biol.Chem.183(2001),2929-2936)报道，乳酸双歧杆菌的D-木酮糖5-磷酸/D-果糖6-磷酸磷酸酮醇酶基因(xfp)显示出与其他生物基因组中的序列的同一性为26％至55％。
选择的磷酸酮醇酶是否能够将D-果糖和磷酸转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸可以例如，通过所附实施例中所述的测定来评价。
与本发明的方法有关所使用的术语“磷酸”是指对于将D-果糖和磷酸转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸的方法中使用的酶来说可作为磷酸来源接受的化合物。一种可能是提供磷酸即H3PO4形式的磷酸。但是，也可以想到其他的形式，特别是磷酸(H3PO4)的盐的形式，其中一个、两个或三个氢原子被其他离子例如钠离子取代。
磷酸酮醇酶是依赖于硫胺素二磷酸的酶，即，其要求硫胺素二磷酸(也称作ThDP或TPP)作为辅因子。因此，在根据本发明的方法中在反应过程中提供TPP是有利的。而且，一些磷酸酮醇酶要求例如Mg2+或Ca2+的离子作为辅因子。在该情形中，根据本发明的方法还包括在上述转化过程中存在这些离子。
通过磷酸酮醇酶进行的D-果糖和磷酸的上述转化的产物即D-赤藓糖和乙酰磷酸是重要的代谢物，其可以进一步转化成所关注的化合物。以下将进一步说明将乙酰磷酸进一步转化成所关注的化合物。
在下文中，将进一步说明D-赤藓糖的转化，并且特别地，在第一方面，说明最终导致两个另外乙酰磷酸分子的D-赤藓糖的转化。在该上下文中，提供了允许将一分子D-赤藓糖转化成两分子乙醇醛的方法。因此，在另一方面，本发明还提供一种生产乙醇醛的方法，包括通过利用醛缩酶将一分子D-赤藓糖酶促转化成两分子乙醇醛。合适的醛缩酶的例子为2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)和果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)。
本发明人出人意料地发现，可以使用醛缩酶例如2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)将一分子D-赤藓糖转化成两分子乙醇醛。这一发现是惊人的，因为由这些酶天然催化的反应是完全不同的，并且涉及磷酸化底物，并且这些酶可以使用D-赤藓糖作为底物以将其转化成乙醇醛是尚未知晓的。
分类为2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)的醛缩酶也称作脱氧核糖-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)，其为催化以下反应的酶：
该酶属于切割碳-碳键的裂解酶特别是醛-裂解酶家族。该酶分类的系统命名为2-脱氧-D-核糖-5-磷酸乙醛-裂解酶(形成D-甘油醛-3-磷酸)。该酶也常常称作磷酸脱氧核糖醛缩酶、脱氧核糖醛缩酶、脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和2-脱氧-D-核糖-5-磷酸乙醛-裂解酶。该酶参与戊糖磷酸路径。
2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)已经在许多种生物中得以识别，特别是例如细菌的微生物。在一优选的实施方式中，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(4.1.2.4)来源于原核生物，优选细菌。已经说明该酶在以下中发现：大肠杆菌(Escherichia coli)(Uniprot登陆号：P0A6L0)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)(Uniprot登陆号：Q9Y948)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Klebsiella butylicus(Uniprot登陆号：A2BLE9)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(SwissProt编号：Q7WT44)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)(Uniprot编号：C7E719)、变形链球菌(Streptococcus mutans)(SwissProt编号：Q9AIP7)、Thermococcus kodakarensis(SwissProt编号：Q877I0)和耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp)EA015(Uniprot登陆号：C0LSK9)。
在另一优选的实施方式中，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)来源于真核生物。例如，已经说明该酶发现于牛(Bos Taurus)和智人(Homo sapiens)中。
而且，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)也在以下中得以识别：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(菌株HB8)(Uniprot登陆号：Q5SJ28)、丙酮丁醇梭菌(菌株ATCC824)(Uniprot登陆号：Q97IU5)、醋酸杆菌属物种(Acetobacter sp.)(Uniprot登陆号：R5Q5K8)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(菌株ATCC 700396)(Uniprot登陆号：Q5FLZ2)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(牛菌株RF122)(Uniprot登陆号：Q2YUU4)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)(Uniprot登陆号：K1GTP0)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)(菌株ATCC 29683)(Uniprot登陆号：H6LFY1)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)(菌株Challis)(Uniprot登陆号：A8AX59)、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)(菌株MR-1)(Uniprot登陆号：Q8EHK4)、Neosartorya fumigata(烟曲霉(Aspergillus fumigatus))(菌株ATCC MYA-4609)(Uniprot登陆号：A4D9G0)和丁酸栖高温菌(Hyperthermus butylicus)(Uniprot登陆号：A2BLE9)。
2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)的酶促活性可以用本领域即使人员已知的方法评价。例如，这些方法描述于以下文献中：DeSantis等人,Biorg.Med.Chem.11:43-52(2003)；和Sakuraba等人,Appl.Environ.Microbiol.73:7427-7434(2007)。如本文所述，例如，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的酶促活性可以通过2-脱氧核糖-5-磷酸切割(反羟醛)测定或羟醛缩合(羟醛)测定评价。
2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)在结构上和功能上是很确定的。如，Heine等人(J.Mol.Biol.(2004)343:1019-1034)说明了大肠杆菌的细菌I类2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶通过Se-Met多重反常色散(MAD)方法在分辨率下的晶体结构。Heine等人及其中的出版物说明，由一级序列分析可以预计，来自大肠杆菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶表现出典型的TIM(α/β)8桶状折叠。醛缩酶中发现的由TIMα/β桶状结构组成的结构域在InterPro中称作InterPro IPR013785(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR013785)。
根据其化学机制，醛缩酶分成两类。脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)是I类醛缩酶之一。I类醛缩酶不依赖于辅因子，通过与严格保守的活性位点赖氨酸形成席夫碱激活其供体底物(Dean等人Adv.Synth.Catal.349(2007),第1308-1320页)。
如Heine等人所示，大肠杆菌2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶在活性位点中含有两个赖氨酸残基。Lys167形成席夫碱中间体，而紧邻于反应性赖氨酸残基的Lys201造成Lys 167的pKa的扰动，因此也是关键残基。
将来自不同生物的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶与大肠杆菌2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶比较，显示如下序列同一性(Heine等人，见上文)。
与来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶为30％，与来自敏捷气热菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶为23％，与来自嗜热栖热菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶为32％，与来自Aquifex aeolicus的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶为27％。
但是，尽管序列同一性水平低，对于所有这些酶来说，活性位点的环境是相似的。
Kullartz和Pietruzska(Journal of Biotechnology 161(2012)第174-180页)从红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)识别出新的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶，并提供了该酶和来自大肠杆菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的序列对比。尽管序列享有的同一性低(28％)，相似性仅59％，来自大肠杆菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶催化活性位点的关键残基(DeSantis等人,Biorg.Med.Chem.11(2003)第43-52页)与来自红串红球菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的对应残基完美匹配。来自大肠杆菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶中的席夫碱形成残基Lys167与来自红串红球菌的DERA中的Lys155对应，而大肠杆菌中的Asp102和Lys176的质子转移(shuffling)系统与红串红球菌中的Asp92和Lys176匹配。
嗜热微生物的代表性2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶蛋白(包括A.boonei(Uniprot登陆号：B5IEU6)、A.pernix(Uniprot登陆号：Q9Y948)、P.aerophilum(Uniprot登陆号：Q8ZXK7)和海栖热袍菌(Uniprot登陆号：Q9X1P5))的序列对比显示，在2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶中残基Lys127是高度保守的，这在席夫碱的形成中至关重要。而且，所有这些酶中的残基Asp92和Lys185也是高度保守的，已知这在质子传递中非常重要(Yin等人,Africanjournal of Biotechnology,10(2011)第16260-16266页)。
在本发明的方法中将D-赤藓糖转化成乙醇醛使用的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)可以是任何来自原核或真核生物的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)。在实施例部分，描述了原核2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶，即大肠杆菌菌株K12的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(SEQ ID NO:4)；Uniprot P0A6L0。如所附实施例中所示，发现2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)能够使用D-赤藓糖作为底物，并将其转化成乙醇醛。原则上，在本发明的方法中可以使用任何2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)，特别是来自真核或原核生物的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)。
在优选的实施方式中，在本发明的方法中将D-赤藓糖转化成乙醇醛使用的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)可以是来自以下的脱氧核糖-磷酸醛缩酶：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(菌株HB8/ATCC27634/DSM 579)；Uniprot Q5SJ28(SEQ ID NO:5)、来自丙酮丁醇梭菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株ATCC 824/DSM 792/JCM 1419/LMG5710/VKM B-1787)；Uniprot Q97IU5(SEQ ID NO:6)、来自醋酸菌属物种(Acetobactersp.)的脱氧核糖-磷酸醛缩酶；Uniprot R5Q5K8(SEQ ID NO:7)、来自嗜酸乳杆菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株ATCC 700396/NCK56/N2/NCFM)；Uniprot Q5FLZ2(SEQ ID NO:8)、来自丁酸栖高温菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株DSM 5456/JCM 9403)；Uniprot A2BLE9(SEQID NO:9)、来自格氏链球菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株Challis/ATCC 35105/CH1/DL1/V288)；Uniprot A8AX59(SEQ ID NO:10)、来自脆弱拟杆菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶；Uniprot K1GTP0(SEQ ID NO:11)、来自金黄色葡萄球菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株牛RF122/ET3-1)；Uniprot Q2YUU4(SEQ ID NO:12)、来自伍氏醋酸杆菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株ATCC 29683/DSM 1030/JCM 2381/KCTC1655)；Uniprot H6LFY1(SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:32)、来自Neosartorya fumigata的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株ATCC MYA-4609/Af293/CBS 101355/FGSC A1100)(烟曲霉)；Uniprot A4D9G0(SEQ ID NO:14)或者来自奥奈达希瓦氏菌的脱氧核糖-磷酸醛缩酶(菌株MR-1)；Uniprot Q8EHK4(SEQ ID NO:15)。
因此，在优选的实施方式中，在本发明中用于将D-赤藓糖转化成乙醇醛的方法中使用的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4-15中任一个所示，或者氨基酸序列显示出与SEQ ID NO:4-15中任一个的同源性为至少x％并且具有催化D-赤藓糖转化成乙醇醛的能力，x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。优选地，同一性程度通过将各个序列与上述SEQID NO中任一个的氨基酸序列比较确定。当比较的序列不具有相同长度时，同一性程度优选地是指与序列较长的氨基酸残基相同的序列较短的氨基酸残基的百分比，或者与序列较短的氨基酸残基相同的序列较长的氨基酸残基的百分比。序列同一性程度可以根据本领域公知的方法使用优选合适的计算机算法例如CLUSTAL确定。
当使用Clustal分析方法确定特定序列是否与参考序列具有例如80％同一性时，可以使用缺省设定，或者设定优选如下：矩阵：blosum 30；开放间隙罚分：10.0；延长间隙罚分：0.05；延迟发散：40；间隙分隔距离：8用于比较氨基酸序列。对于核苷酸序列比较，延长间隙罚分优选设定为5.0。
优选地，同一性程度在序列的整个长度上计算。
选择的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)是否能够催化D-赤藓糖转化成乙醇醛可以例如，通过所附实施例中所述的测定评价。
如上所述，将一分子D-赤藓糖转化成两分子乙醇醛还可以通过由果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)催化的酶促反应实现。果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)是可以催化以下反应的酶：
该酶已经在许多种生物中识别出，果糖-1,6-二磷酸醛缩酶分成两类，其依赖于不同的反应机制。I类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶主要发现于动物和高等植物中，而II类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶主要发现于藻类、细菌和酵母中。属于II类的酶要求二价金属离子作为辅因子。
I型和II型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶均已从不同的原核和真核来源中分离出并且因此，果糖-1,6-二磷酸醛缩酶是在糖酵解、糖质新生和果糖代谢中发挥关键作用的普遍存在的糖分解酶(Brovetto M.等人Chem.Rev.111(2011),4346-4403)。
因此，在优选的实施方式中，果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)来源于原核生物，优选细菌。如，已经说明酶发现于以下中：不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)、大肠杆菌、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、梭菌属物种(Clostridium sp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)、青霉菌属物种(Penicillinum sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)和兔甲基球菌(Methylococcuscuniculus)。
此外，在优选的实施方式中，果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)来源于真核生物。例如，已经说明该酶发现于以下中：智人、果蝇(Drosophila melanogaster)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、原鸡(Gallus gallus)、玉米(Zea mays)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和紫花苜蓿(Medicago sativa)。
Siebers等人的研究首次显示，在任何经测序的古菌基因组中没有识别出编码经典I类和II类酶的基因(Siebers B.等人,J Bol.Chem.276(2001),28710-28718)。后来的来自两种超嗜热古菌Thermoproteus tenax和强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的醛缩酶的生物化学和结构表征说明，这些酶使用席夫碱基质，并因此属于I类醛缩酶(Siebers等人，见上文；Lorentzen E.等人,Biochem.Soc.Trans.32(2004),259-263)。
I类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶可以分类成三种同工酶形式，其可基于免疫反应性以及对于果糖-1,6-二磷酸和果糖1-磷酸底物的转换区分(Blonski等人,Biochem.J.323(1997),71-77)。来自兔肌肉的同工酶A在I类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶中得以最广泛的研究(Gefflaut等人,Prog.Biophys.Mol.Biol.63(1995),301-340)。已经对数十种不同的同工酶进行测序，并已确定若干醛缩酶同工酶的结构，包括来自以下的那些：兔肌肉(Sygusch等人,Proc.Natl.Acad.Sci.84(1987),7846-7850)、人肌肉(Gamblin等人,FEBS Lett.262(1987),282-286；Arakaki等人,Protein Sci.13(2004),3077-3084)和果蝇(Drosophila)(Hester等人,FEBS Lett.292(1991),237-242)。除包括C-端区的20个氨基酸残基以外，这些同工酶的分子结构是高度保守的。同源四聚体每个酶亚基的多肽折叠与β-桶状结构对应，活性位点位于β-桶状结构的中心(Sygusch等人,Proc.Natl.Acad.Sci.84(1987),7846-7850)。与其他的β-桶状结构同工酶不同，活性位点由相当数量带电荷的氨基酸残基即Asp-33、Lys-107、Lys-146、Glu-187和Lys-229组成(Blonski等人,Biochem.J.323(1997),71-77)。
II类FBP-醛缩酶要求二价阳离子，通常为Zn2+，并被单价阳离子激活(Horecker等人,In The Enzymes(Boyer,P.D.,编辑),1972,第3版,vol.7,213-258,Academic Press,New York)。它们与I类酶共享大约15％的序列同一性(Naismith等人,J.Mol.Biol.225(1992),1137-1141)。因此，在优选的实施方式中，本发明的方法中使用的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶在二价阳离子、优选Zn2+的存在下提供，并通过单价阳离子激活。
II类FBP酶可以进一步分类为IIA类和IIB类家族。传统上，IIA类和IIB类FBP酶根据序列同一性及其低聚状态分类。IIA类FBP酶被认为是二聚体，而IIB类FBA可能是二聚体、四聚体或八聚体(Izard和Sygush,J.Biol.Chem 279(2004),11825-11833；Galkin等人,Biochemistry 48(2009),3186-3196；Nakahara等人,Plant Cell Physiol.44(2003),326-333)。FBP-蛋白质的序列对比显示，属于每个家族的成员表现出40％的序列相似性，并且A型和B型II类FBP醛缩酶之间的氨基酸序列同一性在25-30％的量级(Plaumann等人,Curr.Genet.31(1997),430-438)。八种已知的II类FBP醛缩酶的随后序列对比显示，Arg-331是高度保守的残基之一。化学修饰和定点诱变已经证实了该氨基酸在活性位点中的关键作用(Qamar等人,Protein Sci.5(1996),154-161)。
若干酶的晶体结构已经确定，如，来自大肠杆菌(Hall等人,J.Mol.Biol.287(1999),383-394)、水生栖热菌(Izard和Sygush；见上文)、Thermus caldophilus(Lee等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.347(2006),616-625)、肠兰伯氏鞭毛虫(Giardia lamblia)(Galkin等人；见上文)、结核杆菌(Pegan等人,J.Mol.Biol.386(2009),1038-1053)。结核杆菌FBP醛缩酶的二级结构与其他细菌的II类醛缩酶类似(Pegan等人,见上文)。该酶具有八链β-折叠核心，其中每个β-链(β1–β8)通常接着是α-螺旋(α1–α8a)，产生了总的(β/α)8-桶状折叠，其也称作TIM桶状折叠(在InterPro数据库中称作IPR013785)。
原则上，任何果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)均可以用于根据本发明的方法将D-赤藓糖转化成乙醇醛。
在优选的实施方式中，根据本发明的方法使用的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)是来自家兔(Oryctolagus cuniculus)的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(UniprotP00883)，其显示的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；或者来自大肠杆菌(菌株K12)的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(即，II类果糖1,6-二磷酸醛缩酶)(Uniprot P0AB71)，其显示的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；或者来自酿酒酵母(菌株ATCC 204508/S288c)的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Uniprot P14540)，其显示的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；或者来自水生栖热菌的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Uniprot Q9RHA2)，其显示的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；或者来自结核杆菌的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Uniprot P67475)，其显示的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；或者来自荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(菌株ATCC33009/NCIMB 11132/Bath)的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(即，II类果糖1,6-二磷酸醛缩酶)(Uniprot Q602L6)，其显示的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
因此，在优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)的氨基酸序列如SEQ ID NO:26-31中任一个所示，或者氨基酸序列显示出与SEQID NO:26-31中任一个的同源性为至少x％，并且具有果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性，x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中该酶能够将D-赤藓糖转化成乙醇醛，如本文以上所述。优选地，同一性程度如上所述确定。
果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的酶促活性可以用本领域技术人员已知的方法评价。例如，这样的方法描述于以下文献中：Blonski K.等人,Biochem.J.323(1997),71-77；和Szwergold等人,Arch.Biochem.Biophys.317(1995),244-252。
本发明还涉及一种方法，其中在后续反应中组合上述两种酶促转化，导致从D-果糖产生乙醇醛和乙酰磷酸。因此，本发明提供从D-果糖生产乙醇醛和乙酰磷酸的方法，包括(a)根据本发明上述方法通过利用磷酸酮醇酶从D-果糖和磷酸生产D-赤藓糖和乙酰磷酸；并还包括(b)根据本发明上述方法通过利用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)将由此生产的D-赤藓糖酶促转化成乙醇醛。关于磷酸酮醇酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)和果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)，与关于单独转化上文所述的内容也适用。
通过利用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)通过上述将D-赤藓糖转化成乙醇醛产生的乙醇醛可以有利地进一步转化成乙酰磷酸。从D-果糖开始的总的反应则将会产生三分子乙酰磷酸。
因此，在本发明的其他方面，可以将根据上述任意方法生产的乙醇醛进一步转化成乙酰磷酸，其自身可以用作生产例如乙酰辅酶A的底物，如下文进一步说明。
将乙醇醛转化成乙酰磷酸可以通过本领域技术人员已知的方法实现，特别地，通过由磷酸酮醇酶催化的酶促反应。根据以下反应将乙醇醛转化成乙酰磷酸是不可逆的：
乙醇醛+磷酸→乙酰磷酸+H2O
该反应描述于Melvin等人,J.Biol.Chem.237:3841-3842(1962)中。
与本发明的方法有关所使用的术语“磷酸”是指对于将乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸的方法中使用的酶来说可作为磷酸来源接受的化合物。一种可能是提供磷酸即H3PO4形式的磷酸。但是，其他的形式也是能想到的，特别是磷酸(H3PO4)的盐的形式，其中一个，两个或三个氢原子被其他离子例如钠离子取代。
因此，上述根据本发明的方法还可以包括通过利用磷酸酮醇酶将生产的乙醇醛酶促转化成乙酰磷酸的步骤。在上文中已在将D-果糖和磷酸酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸的上下文中对磷酸酮醇酶进行说明。对于能够将D-果糖和磷酸转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸的磷酸酮醇酶以及对于共底物磷酸所述相同内容同样适用于可以用于将乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸的磷酸酮醇酶。
因此，将乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸使用的磷酸酮醇酶可以是任何磷酸酮醇酶，特别地，分类为(a)磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.9)或(b)果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(EC4.1.2.22)的磷酸酮醇酶。乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸所使用的磷酸酮醇酶可以是来自原核或真核生物的磷酸酮醇酶。在实施例部分，关于该转化对原核磷酸酮醇酶进行说明，例如，(a)假长双歧杆菌globosum亚种的磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.22)(SEQ ID NO:1)；或(b)来自丙酮丁醇梭杆菌(菌株ATCC824)的磷酸酮醇酶(SEQ ID NO:2)；或(c)乳酸乳球菌乳酸亚种的磷酸转酮酶(菌株KF147；Uniprot登录号：A9QST6；SEQ ID NO:3)。
在优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的用于将乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸的磷酸酮醇酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3中任一个所示，或者氨基酸序列显示出与SEQ ID NO:1-3中任一个的同源性为至少x％，并且具有将乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸的活性，x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。关于同一性程度的确定，如上所述内容同样适用。
选择的磷酸酮醇酶是否能够催化乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸可以例如通过所附实施例中所述的任意测定确定。
将乙醇醛转化成乙酰磷酸也可以通过由硫代乙醛乙酰基转移酶(EC2.3.3.15)催化的酶促反应实现。硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)是可以催化以下反应的酶：
2-硫代乙醛+磷酸→乙酰磷酸+亚硫酸盐
与本发明的方法有关所使用的术语“磷酸”是指对于将2-硫代乙醛和磷酸转化成乙酰磷酸和亚硫酸盐的方法中使用的酶来说可作为磷酸来源接受的化合物。一种可能是提供磷酸即H3PO4形式的磷酸。但是，其他的形式也是可能的，特别是磷酸(H3PO4)的盐的形式，其中一个、两个或三个氢原子被其他离子例如钠离子取代。
该酶已经在许多种生物中识别出，特别是细菌。在一优选的实施方式中，硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)来源于原核生物，优选细菌。例如，已经说明该酶发现于以下中：Castellaniella defragans(Uniprot登陆号：Q84H44；以前称Alcaligenes defragans(Ruff等人,Biochem.J.369(2003),275-285))、木糖氧化产碱杆菌(Alcaligenesxylosoxydans)(Uniprot登陆号：Q84H41)、Desulfonispora thiosulfatigenes(Uniprot登陆号：Q93PS3)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)(菌株1021)(Uniprot登陆号：Q92UW6)、Ruegeria pomeroyi(Uniprot登陆号：Q5LMK2)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(Uniprot登陆号：Q0K022)、Roseovarius nubinhibens(Uniprot登陆号：A3SR25)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。
原则上，在根据本发明的方法将乙醇醛和磷酸转化成乙酰磷酸中可以使用任何硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)。
与磷酸酮醇酶类似，硫代乙醛乙酰基转移酶是依赖于硫胺素焦磷酸(TPP)的酶，因此特征在于其含有TPP结合结构域。在已知的硫代乙醛乙酰基转移酶当中，TPP结合结构域是高度保守的(例如，参见Ruff等人,Biochem.J.369(2003),275-285)。总体上，已知的硫代乙醛乙酰基转移酶在N-端附近表现出高度的序列保守，包括TPP结合结构域(参见Ruff等人,见上文)。在酶自身的N-端中以及C.defragans酶靠近氨基酸400的区域中可以观察到序列趋异。Ruff等人(见上文)说明，硫代乙醛乙酰基转移酶形成3个亚群(参见所述出版物图4)。据称亚群2和3表现出TPP结合结构域，与PROSITE共有序列符合，
(L/I/V/M/F)(G/S/A)X5PX4(L/I/V/M/F/Y/W)X(L/I/V/M/F)XGD(G/S/A)(G/S/A/C)，而亚组与共有序列略微偏离：
(L/I/V/M/F)(G/S/A)X5PX4(L/I/V/M/F/Y/W)X(L/I/V/M/F/Y)XGD(G/S/A)(G/S/A/C)。
除这些区域以外，不同硫代乙醛乙酰基转移酶之间的序列同一性可以相当低(低至大约44％)。
在优选的实施方式中，根据本发明的方法中使用的硫代乙醛乙酰基转移酶是C.defragans的硫代乙醛乙酰基转移酶，其表现出的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者木糖氧化产碱杆菌的硫代乙醛乙酰基转移酶，其表现出的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；或者Desulfonispora thiosulfatigenes的硫代乙醛乙酰基转移酶，其表现出的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；或者苜蓿根瘤菌(菌株1021)的硫代乙醛乙酰基转移酶，其表现出的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者Roseovarius nubinhibens的硫代乙醛乙酰基转移酶，其表现出的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示或者显示出相关的氨基酸序列。
因此，在优选的实施方式中，本发明的方法中使用的硫代乙醛乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:21-25中任一个所示，或者氨基酸序列显示出与SEQ ID NO:21-25中任一个的同源性为至少x％，并且具有硫代乙醛乙酰基转移酶活性，x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中该酶能够如本文以上所述将乙醇醛和磷酸转移成乙酰磷酸。优选地，同一性程度如上所述确定。
硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)的酶促活性可以用本领域技术人员已知的方法评价。例如，这样的方法描述于Ruff等人(Biochem.J.369(2003),275-285)中。
如上所述，本发明涉及通过利用磷酸酮醇酶将D-果糖酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸，其中任选地通过利用醛缩酶(2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13))可以将D-赤藓糖进一步转化成乙醇醛，其中任选地可以将由此产生的乙醇醛进一步转化成乙酰磷酸。用作产生D-赤藓糖和乙酰磷酸的底物的D-果糖可以外部提供，例如，通过加入其作为底物，或者通过使用含有D-果糖的碳源，或者其自身可以通过酶促转化提供。就该方面而言，一种选择是通过本领域技术人员已知的方法将D-葡萄糖酶促转化成D-果糖。例如，公知通过利用葡萄糖-果糖异构酶可以将D-葡萄糖酶促转化成D-果糖。
因此，在另一实施方式中，本发明还涉及上述方法，其中先于上述步骤进行另一步骤，其中形成用作上述反应的底物的所述D-果糖自身通过利用葡萄糖-果糖异构酶将D-葡萄糖酶促转化产生。将D-葡萄糖酶促转化成D-果糖是天然发生并利用葡萄糖-果糖异构酶的酶促步骤。在该上下文中可以使用的葡萄糖-果糖异构酶是本领域技术人员已知的。因此，在本发明中，通过利用葡萄糖-果糖异构酶可以在体外或在体内将D-葡萄糖酶促转化成D-果糖。
如本申请所用，“葡萄糖-果糖异构酶”或“葡萄糖-果糖异构酶活性”是指能够将D-葡萄糖转化成D-果糖的酶或酶促活性。这样的葡萄糖-果糖异构酶通常分类为木糖异构酶(EC 5.3.1.5)。木糖异构酶(EC 5.3.1.5)是催化以下反应的酶。
葡萄糖-果糖异构酶(或木糖异构酶)酶属于异构酶家族，具体地为醛糖和酮糖互变的分子内氧化还原酶。该类酶的系统命名为D-木糖醛糖-酮糖-异构酶。这些酶也称作D-木糖异构酶、D-木糖酮异构酶和D-木糖酮醇-异构酶。该酶参与戊糖和葡糖醛酸互变以及果糖和甘露糖代谢。在工业上在高果糖玉米糖浆的生产中使用该酶将葡萄糖转化成果糖。它有时也称作“葡萄糖异构酶”。
葡萄糖-果糖异构酶(或木糖异构酶)酶发现于许多种生物中，特别是原核生物、真核生物和古菌。因此，在根据本发明的方法的优选实施方式中，上述反应式和图1所示的的D-葡萄糖酶促转化成D-果糖通过利用分类为木糖异构酶(EC 5.3.1.5)的葡萄糖-果糖异构酶(或木糖异构酶)实现。在一优选的而是方式中，葡萄糖-果糖异构酶来源于原核生物，优选来自细菌。例如，已经说明该酶发现于以下中：乳酸乳球菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)和大肠杆菌。在另一优选实施方式中，葡萄糖-果糖异构酶来源于真核生物，优选真菌，例如，例如酿酒酵母的酵母。例如，已经说明该酶发现于以下中：橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)(Uniprot登陆号：P15587)、嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)(Uniprot登陆号：D2DK62)、弧菌属物种(Vibrio sp.)(Uniprot登陆号：C7G532)、密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)(Uniprot登陆号：P12851)、Burkholeria sacchari(Uniprot登陆号：B6VCW7)、根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)(Uniprot登陆号：B7SLY1)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)(Uniprot登陆号：P24300)和嗜热栖热菌(P26997)。
在本发明的方法中用于将葡萄糖转化成果糖的葡萄糖-果糖异构酶可以是任何葡萄糖-果糖异构酶，特别是来自原核或真核生物的葡萄糖-果糖异构酶。作为例子，可以使用氨基酸序列为SEQ ID NO:16的来自大肠杆菌的葡萄糖-果糖异构酶(或木糖异构酶)(Uniprot P00944)。
在优选的实施方式中，在本发明的方法中用于将葡萄糖转化成果糖的葡萄糖-果糖异构酶(或木糖异构酶)可以是来自地衣芽孢杆菌(菌株DSM13/ATCC 14580)的木糖异构酶；Uniprot P77832(SEQ ID NO:17)、来自橄榄产色链霉菌的木糖异构酶；Uniprot P15587(SEQ ID NO:18)、来自嗜热栖热菌(菌株HB8/ATCC 27634/DSM 579)的木糖异构酶；UniprotP26997(SEQ ID NO:19)或来自博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的木糖异构酶；Uniprot I1VX39(SEQ ID NO:20)。
因此，在优选的实施方式中，本发明的方法中使用的葡萄糖-果糖异构酶(或木糖异构酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO:16-20中任一个所示，或者氨基酸序列显示出与SEQ IDNO:16-20中任一个的同源性为至少x％，并且具有催化D-葡萄糖转化成D-果糖的活性，x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。就同一性程度的确定而言，上文所述者同样适用。
如上所述，本发明提供一种生产D-赤藓糖的方法。D-赤藓糖是赤藓糖醇的直接前体，其可以如下所述转化成赤藓糖醇；综述参见Moon等人,Appl Microbiol.Biotechnol,86:1017-1025(2010)。因此，本发明还提供一种从本发明上述方法生产的D-赤藓糖生产赤藓糖醇的方法。因此，作为后续步骤，本发明提供一种生产赤藓糖醇的方法，其包括通过利用相应的能够将D-赤藓糖转化成赤藓糖醇的酶将生产的D-赤藓糖酶促转化成赤藓糖醇。用于将D-赤藓糖转化成赤藓糖醇的酶是本领域已知的。作为例子，真核生物含有通过依赖于NAD(P)H的还原反应催化赤藓糖的还原以产生赤藓糖醇的赤藓糖还原酶；综述参见Moon等人,Appl Microbiol.Biotechnol,86:1017-1025(2010)。这些酶可以用于将D-赤藓糖转化成赤藓糖醇。
然后可以将由此产生的赤藓糖醇用作食品和制药工业中应用的生物甜味剂。它还可以用作用于糖尿病和肥胖人群的特殊食品的功能性糖替代物。而且，生产的赤藓糖醇可以在食物中用作非致龋甜味剂，或者用作生产其他糖的起始原料。
如上所述，上述人工代谢路径(总结于图1中)最终可以导致从一分子葡萄糖作为底物开始产生三分子乙酰磷酸。根据本发明，根据本发明的方法由此产生的乙酰磷酸可以进一步转化成所需的分子，例如乙酸或大多数生物中的中心代谢物乙酰辅酶A(也称作乙酰-CoA)。
因此，在优选的实施方式中，本发明涉及一种生产乙酸的方法，其包括根据本发明的上述任意方法生产乙酰磷酸，并还包括将由此产生的乙酰磷酸转化成乙酸。
乙酰磷酸水解成乙酸在体外是自发发生的，因为乙酰磷酸相当地不稳定。例如，通过利用乙酸激酶(EC 2.7.2.1)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)、丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或乙酸激酶(二磷酸)(EC 2.7.2.12)，还可以将乙酰磷酸在体外或在体内酶促转化成乙酸。
乙酸激酶是催化以下反应的酶：
由于该反应是可逆的，酶可以用于将乙酰磷酸转化成乙酸。通过从反应中连续除去ATP，例如，通过进一步的酶转化或者通过以本领域技术人员已知的方式和方法从反应中除去，可以将反应推进至乙酸方向。该酶发现于许多种生物中，特别是原核生物、真核生物和古细菌中。它是糖酵解中非常重要的酶，酶水平在过量葡萄糖的存在下通常增加。原则上，在根据本发明的方法中，可以使用任何乙酸激酶(EC 2.7.2.1)将乙酰磷酸转化成乙酸。
已经说明丙酸激酶(EC 2.7.2.15)能够根据以下反应式将乙酰磷酸转化成乙酸：
该酶发现于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中，例如大肠杆菌或肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enteric subsp.enterica serovar.thyphimurium)。
将乙酰磷酸转化成乙酸还可以通过利用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)实现。丁酸激酶是催化以下反应的酶：
但是，已经发现对于一些丁酸激酶，例如，对于来自丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶，它们还可以催化以下反应：
因此，在本发明的方法中可以使用任何也能够催化ATP+乙酸可逆转化成ADP+乙酰磷酸的丁酸激酶用于乙酰磷酸转化成乙酸。
而且，将乙酰磷酸转化成乙酸还可以通过利用乙酸激酶(二磷酸)(EC2.7.2.12)实现。乙酸激酶(二磷酸)(EC 2.7.2.12)是催化以下反应的酶：
已经说明该酶发现于痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)中。
乙酰磷酸酶促水解成乙酸和H3PO4还可以通过使用酰基磷酸酶(EC3.6.1.7)实现。乙酰磷酸酶(AcP；EC 3.6.1.7)是在真核和原核生物(嗜中温和嗜极生物)中广泛表达的细胞溶质酶(分子量大约10kDa)。AcP可以在脊椎动物物种的许多组织中在骨骼肌中和在心脏中作为肌肉型AcP(MT-AcP)发现，并且在红细胞、脑和睾丸中作为(器官)普通型AcP(CT-AcP)发现(Zuccotti等人,Acta Cryst.61(2005),144-146)。
酰基磷酸酶催化以下反应：
乙酰磷酸+H2O→乙酸+H3PO4
已经在许多种生物中对该酶进行说明。优选地，根据本发明的方法中使用的酰基磷酸酶源自原鸡(Gallus gallus)、豚鼠(Cavia porcellus)(Liguri等人,Biochem.J.217(1984),499-505)、智人、野猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、家兔、Equus acallus或掘越氏热球菌(Pyrococcus hirokoshii)(Miyazoo等人,Acta Crystallographica D60(2004),1135-1136)。
这些酶的结构和功能特性已经详细研究，并描述于以下文献中：例如，Liguri等人(Biochem.J.217(1984),499-505)；Miyazoo等人(Acta Crystallographica D60(2004),1135-1136)；和Taddei等人(FEBS Letters362(1995),175-179)。
在另一优选实施方式中，还可以通过磷酸转乙酰酶将产生的乙酰磷酸转化成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A可以用作生产许多源自乙酰辅酶A的另外的代谢物例如烯烃或丙酮的起点。因此，本发明涉及一种生产乙酰辅酶A的方法，其包括根据如上所述本发明的任意方法生产乙酰磷酸，并还包括(b)在辅酶A(CoA)的存在下通过利用磷酸转乙酰酶将由此产生的乙酰磷酸转化成乙酰辅酶A。
例如，通过利用磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)，可以酶促实现将乙酰磷酸转化成乙酰辅酶A(在体外或体内)。该酶也称作磷酸转乙酰酶、磷酸酰基转移酶或PTA。该酶天然地催化以下反应：
该酶发现于许多种生物中，例如原核生物、真核生物和古细菌。原则上，该转化可以使用任何已知的磷酸乙酰基转移酶。
当涉及氨基酸或核苷酸序列的“同源性”时，优选是指序列同一性。序列同一性程度可以使用优选合适的计算机算法例如CLUSTAL根据本领域公知的方法确定。
当使用Clustal分析方法确定特定序列是否与参考序列具有例如至少60％同一性时，可以使用缺省设定，或者设定优选如下：矩阵：blosum 30；开放间隙罚分：10.0；延长间隙罚分：0.05；延迟发散：40；间隙分隔距离：8用于比较氨基酸序列。对于核苷酸序列比较，延长间隙罚分优选设定为5.0。
在优选的实施方式中，使用ClustalW2进行氨基酸序列的比较。在成对比较/对比的情形中，优选地选择以下设定：蛋白质重量矩阵：BLOSUM62；间隙开放：10；间隙延长：0.1。在多重比较/对比的情形中，优选地选择以下设定：蛋白质重量矩阵：BLOSUM 62；间隙开放：10；间隙延长：0.2；间隙距离：5；无端部间隙。
优选地，同一性程度在序列的整个长度上计算。当比较的序列长度不相同时，同一性程度是指较短序列中与较长序列中的残基相同的残基的百分比，或者较长序列中与较短序列中的残基相同的残基的百分比。优选地，其是指较短序列中与较长序列中的残基相同的残基的百分比。
根据本发明的方法可以在体外或在体内进行。体外反应理解成其中不使用细胞的反应，即非细胞反应。因此，体外优选地是指无细胞系统。在一实施方式中，术语“体外”是指在分离的酶(或者任选地包括可能要求的辅因子的酶系统)的存在下。在一实施方式中，该方法中使用的酶以纯化的形式使用。
对于在体外进行反应，将用于反应的底物和酶在使得酶有活性并且使酶促转化发生的条件(缓冲液、温度、共底物、辅因子等)下孵育。使反应进行足够长的时间，以生产各个产物。各个产物的生产可以通过本领域已知的方法测量，例如高效液相色谱(HPLC)，其可能与质谱(MS)检测连接。
酶可以处于任何使得酶促反应发生的适当形式。它们可以是纯化的或部分纯化的，或者处于粗细胞提取物或部分纯化的提取物的形式。也可以将细胞固定化在适当的载体上。
实施例说明了使用来自不同来源的磷酸酮醇酶和/或醛缩酶的根据本发明的体外反应。
根据本发明的体外方法可以在一锅(one-pot)反应中进行，即，将底物在一份反应混合物中与上述想要的转化必需的酶混合，并允许反应进行足够长的时间，以产生各个产物。另外可选地，该方法还可以通过以连续方式进行一个或多个酶促步骤，即，通过首先将底物与一种或多种酶混合，并允许反应进行至中间体，并然后加入一种或多种其他酶，以将中间体进一步转化成中间体或转化成最终产物。
此外根据本发明的体外反应可以包括通过使用本领域已知的方法回收来收集想要的产物的步骤。
在另一实施方式中，根据本发明的方法在生物、优选微生物的存在下在培养物中进行，产生如上文所述酶的至少一种，所述酶是产生D-果糖和/或D-赤藓糖和/或乙醇醛和/或乙酰磷酸或者进一步将产生的乙酰磷酸转化成其他化合物例如乙酸或乙酰辅酶A所必需。因此，在另一实施方式中，根据本发明的方法在生物、优选微生物的存在下在培养物中进行，产生根据本发明的方法之一生产D-果糖所必需的至少一种上述酶。此外，在另一实施方式中，根据本发明的方法在生物、优选微生物的存在下在培养物中进行，产生根据本发明方法之一生产D-赤藓糖和乙酰磷酸所必需的上述酶。此外，在另一实施方式中，根据本发明的方法在生物、优选微生物的存在下在培养物中进行，产生根据本发明方法之一生产乙醇醛所必需的上述酶。此外，在另一实施方式中，根据本发明的方法在生物、优选微生物的存在下在培养物中进行，产生根据本发明方法之一生产乙酰磷酸所必需的上述酶。使用微生物进行根据本发明方法的方法被称作“体内”方法。
各个底物可以外部提供，或者可以通过用于产生上述各个底物的表达相应酶的所使用的微生物来产生。这些微生物表达至少一种用于上述酶促转化之一的酶。
因此，在本发明的这些实施方式中，使用产生至少一种说明书中说明的酶的生物，优选微生物。可以使用天然产生一种或多种所需酶的(微)生物，以及对这样的(微)生物进行遗传修饰，使得其也表达其天然不表达的那些酶。
如果使用天然表达所需酶活性之一的(微)生物，可以对这样的(微)生物进行修饰，使得该活性在(微)生物中超量表达。例如，这可以通过在对应基因的启动子区域中进行突变以导致确保基因表达更高的启动子。另外可选地，也可以将基因本身突变，以导致表现出更高活性的酶。
通过使用表达实现上述酶促转化所必需的酶的(微)生物，可以在培养基中直接进行根据本发明的反应，无需对酶进行分离或纯化。
在一实施方式中，根据本发明的方法中使用的生物是以下生物、优选微生物，其已进行遗传修饰，以含有一种或多种编码一种或多种上述酶的外来核酸分子。在该上下文中，术语“外来”是指核酸分子在所述生物/微生物中天然地不存在。这是指其不以相同的结构或在相同的位置处在生物/微生物中存在。在一优选实施方式中，外来核酸分子是包括启动子和编码各个酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列的表达的启动子相对于编码序列是异源的。在该上下文中，异源是指启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同编码序列的启动子，即，其来源于另一基因，或者是合成启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是与生物/微生物异源的启动子，即，在各个生物/微生物中天然不存在的启动子。再更优选地，启动子是诱导型启动子。在不同类型生物、特别是微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员公知的。
在另一实施方式中，核酸分子对于生物/微生物是外来的，在于被编码的酶对于生物/微生物不是内源的，即，其在不遗传修饰时不被生物/微生物天然地表达。换言之，被编码的酶相对于生物/微生物是外源的。外来核酸分子可以染色体外的形式在生物/微生物中存在，例如，作为质粒，或者稳定地整合在染色体中。优选稳定整合。因此，遗传修饰可以在于，例如，将编码酶的对应基因整合到染色体中，或者在于从含有酶编码序列上游的启动子、启动子和编码序列优选地来源于不同生物的质粒表达酶，或者是本领域技术人与已知的任何其他方式。
本发明中使用的生物可以是原核生物或真核生物，优选地，它们是微生物例如细菌、酵母、真菌或霉菌，或者植物细胞或动物细胞。在具体实施方式中，微生物是细菌，优选埃希氏杆菌(Escherichia)或芽孢杆菌(Bacillus)属，再更优选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌物种。
也可以使用嗜极细菌，例如嗜热栖热菌，或者来自梭状芽孢杆菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。
在一实施方式中，微生物是真菌，更优选酵母属、裂殖酵母属、曲霉属、木霉属、毕赤酵母属或克鲁维酵母属的真菌，再更优选酿酒酵母、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichodermareesei)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)物种，或者乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)物种的真菌。
在另一实施方式中，根据本发明的方法利用表达至少一种实现上述酶促表达所必需的酶的光合微生物。优选地，微生物是光合细菌或微藻类。在另一实施方式中，微生物是藻类，更优选属于硅藻的藻类。
也可以想到在根据本发明的方法中使用(微)生物的组合，其中不同(微)生物表达不同的上述酶。
在另一实施方式中，根据本发明的方法利用表达至少一种实现上述酶促转化所必需的酶的多细胞生物。这些生物的例子为植物或动物。
在特别的实施方式中，根据本发明的方法涉及在标准培养条件(1atm下30-37℃，在允许细菌需氧生长的发酵罐中)或非标准条件(例如，对应于嗜热生物培养条件的较高的温度)下培养微生物。
当根据本发明的方法通过使用提供各个酶活性的生物/微生物在体内进行时，生物、优选微生物在允许酶促反应发生的适合的培养条件下培养。具体的培养条件依赖于使用的具体生物/微生物，但是本领域技术人员公知的。通常这样选择培养条件使得所述条件允许表达编码各个反应的酶的基因。多种方法是本领域技术人员已知的，以在某些培养阶段提高和微调某些基因的表达，例如通过化学诱导剂或者通过温度变化诱导基因表达。
在另一实施方式中，根据本发明的方法中使用的生物是植物。原则上，可以使用任何可能的植物，即，单子叶植物或双子叶植物。优选地，使用可以在农业上有意义的规模下培养并且可以产生大量生物质的植物。例子为草，如黑麦草属(Lolium)，谷类，如黑麦、小麦、大麦、燕麦、小米、玉米，其他淀粉储藏植物，如土豆，或者储糖植物，例如甘蔗或甜菜。也可以想到使用烟草或蔬菜植物，例如土豆、胡椒、黄瓜、茄子等。另一种可能是使用储油植物，例如油菜籽、橄榄等。另外可以想到使用树，特别是速生树，例如桉树、白杨或橡胶树(巴西橡胶树(Hevea brasiliensis))。
在另一实施方式中，本发明的方法包括提供(细胞)培养物的形式、优选液体细胞培养物的形式的载有各个酶活性或多种活性的生物、优选微生物的步骤，在允许表达各个酶的适当条件下在发酵罐(也常称作生物反应器)中培养生物、优选微生物的后续步骤，并还包括进行如上所述的本发明的方法的酶促转化的步骤。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域几乎人员已知的。生物反应器或发酵罐是指本领域已知的支持生物活性环境的任何制造的或改造的装置或系统。因此，生物反应器或发酵罐可以是容器，其中进行化学和/生物化学过程，如本发明的方法，其涉及生物，优选微生物和/或生物化学活性物质，即，源自携带有上述酶的此类生物或微生物的上述酶。在生物反应器或发酵罐中，该过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器通常是圆柱状，大小范围可以是从数升至数立方米，常由不锈钢制成。在这一方面，无意拘泥于理论，发酵罐或生物反应器可以适合于培养生物、优选微生物的方式设计成，例如，分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化器培养，所有这些都是本领域公知的。
培养基可以是适合于培养各生物或微生物的任意培养基。在优选的实施方式中，培养基含有果糖或者这样的化合物，所述化合物含有果糖(例如蔗糖)并且从其可以释放果糖，或者可以转化成果糖的化合物例如其他己糖，如葡萄糖。
如上所述，在根据本发明的方法中可以使用经遗传修饰以含有编码至少一种实现上述酶促转化所必需的酶的核酸分子的(微)生物。这种编码上述酶的核酸分子可以单独使用，或者作为载体的一部分使用。核酸分子可以进一步包括与包含在核酸分子中的多核苷酸有效连接的表达控制序列。贯穿于本说明书中使用时，术语“有效地连接”或“有效连接”是指在要表达的多核苷酸中一个或多个表达控制序列和编码区之间的连接方式使得在与表达控制序列相容的条件下实现表达。
表达包括异源DNA序列的转录，优选转录为可翻译的mRNA。确保在真菌以及细菌中表达的调节元件是本领域技术人员公知的。它们包括启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。在关于载体的解释下文进一步给出例子。
就其来源而言和/或就要表达的基因而言，关于核酸分子使用的启动子可以是同源的或异源的。例如，合适的启动子是导致自身组成型表达的启动子。但是，也可以使用仅在由外部影响决定的时间点激活的启动子。在该上下文中可以使用人工和/或化学诱导型启动子。
载体还可以包括与载体中含有的所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。这些表达控制序列可以适合于确保可翻译RNA在细菌或真菌中的转录和合成。
根据本发明的方法中使用的酶可以是天然存在的酶(即磷酸酮醇酶、醛缩酶、葡萄糖-果糖异构酶和/或磷酸转乙酰酶)或者源自天然存在的酶的酶，例如，引入改变或提高酶促活性、稳定性等的突变或其他变化。
修饰和/或提高蛋白质的想要的酶促活性的方法是本领域技术人员公知的，其包括，例如，随机诱变或定点诱变，以及随后的具有想要的特性的酶的选择，或者所谓的“定向进化”方法。
此外，通过分子生物学中常用的方法能够将不同的突变插入到多核苷酸中(例如，参见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)，导致合成可能具有修饰的生物特性的多肽。可以想到在氨基酸序列的修饰例如影响多肽生物活性或调节的位置处引入点突变。
而且，可以制备具有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，这种突变体表现出增加的活性。而且，在编码上述酶的多核苷酸中引入突变使得由所述多核苷酸编码的酶的基因表达率和/或活性得以最优化。
对于遗传修饰细菌或真菌，可以将编码上述酶的多核苷酸或这些分子的一部分引入到允许通过DNA序列的重组的诱变或序列修饰的质粒中。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold SpringHarbor,NY,USA)使得可以进行碱基交换，或者可以加入天然或合成序列。通过对片段应用衔接物或接头，可以将DNA片段彼此连接。而且，可以使用提供适当的限制位点或除去多余DNA或限制位点的改造措施。在这些情形中，其中可以进行插入、删除或置换时，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。通常，进行序列分析、限制酶切分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。
在本发明的上下文中，“增加的活性”是指在遗传修饰的微生物中，酶特别是磷酸酮醇酶、醛缩酶、葡萄糖-果糖异构酶和/或磷酸转乙酰酶的表达和/或活性比对应的非修饰的微生物高至少10％，优选至少20％，更优选至少30％或50％，再更优选至少70％或80％，特别优选至少90％或100％。在再更优选的实施方式中，表达和/或活性的增加可以是至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，表达比对应的非修饰的微生物高至少10倍，更优选至少100倍，再更优选至少1000倍。
术语“增加的”表达/活性也包括其中对应的非修饰的微生物不表达相应的酶使得非修饰微生物中相应的表达/活性为零的情形。
测量细胞中指定蛋白质表达水平的方法是本领域技术人员公知的。在一实施方式中，表达水平的测量通过测量对应蛋白质的量进行。相应的方法是本领域技术人员公知的并且包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一实施方式中，表达水平的测量通过测量对应RNA的量进行。相应的方法是本领域技术人员公知的，例如，RNA印迹。
测量根据本发明的方法中使用的酶的酶促活性的方法是本领域已知的，并且已在上文中加以说明。
表达(微)生物中引入的多核苷酸以导致产生具有上述任意活性的多肽。例如，不同表达系统的综述包含在以下文献中：Methods in Enzymology153(1987),385-516，于Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)和于Sawers等人(AppliedMicrobiology and Biotechnology 46(1996),1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinionin Biotechnology 7(1996),500-4)，Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)，Griffiths等人(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)。例如，酵母表达系统的综述由以下文献给出：Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995),261-279)，Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994),13-19)，Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992),79-93)，Fleer(CurrentOpinion in Biotechnology3(1992),486-496)，Vedvick(Current Opinion inBiotechnology 2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991),1067-1072)。
表达载体已在文献中得以广泛说明。通常，它们不仅含有选择标志基因和确保在所选宿主中复制的复制起点，还含有细菌或病毒启动子，并且在大多数情形中含有转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常有至少一个限制酶切位点或能够插入编码DNA序列的多接头。如果其在所选择的宿主生物中有活性，可以使用天然地控制相应基因转录的DNA序列作为启动子序列。但是，该序列也可以与其他启动子序列交换。可以使用确保基因的组成型表达的启动子和允许基因表达的有意控制的诱导型启动子。具有这些特性的细菌和病毒启动子序列在文献中得以详细说明。用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)表达的调节序列在文献中得以充分说明。允许下游序列特别高表达的启动子为，例如，T7启动子(Studier等人,Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,in Rodriguez and Chamberlin(编辑),Promoters,Structure andFunction；Praeger,New York,(1982),462-481；DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene 42(1986),97-100)。优选使用诱导型启动子用于多肽合成。这些启动子常导致比组成型启动子更高的多肽产率。为了得到最佳量的多肽，常使用两步法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养至相对高细胞密度。在第二步中，取决于所用启动子的类型诱导转录。在这一方面，tac启动子特别合适，其可以通过乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)启动子诱导(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)。转录终止信号也在文献中得以说明。
根据本发明将宿主细胞用多核苷酸或载体转化可以通过标准方法进行，例如，如以下文献中所述：Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,A LaboratoryCourse Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990。将宿主细胞在符合所用的特别的宿主细胞要求，特别是在pH值、温度、盐浓度、曝气、抗生素、维生素、痕量元素等方面的营养培养基中培养。
本发明还涉及磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的(微)生物用于从D-果糖生产D-赤藓糖和/或乙酰磷酸的用途。对于磷酸酮醇酶和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
本发明还涉及上述2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)或表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)的(微)生物或表达果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的(微)生物用于从D-赤藓糖生产乙醇醛的用途。对于2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
在优选的实施方式中，本发明还涉及生物或微生物用于从D-果糖生产乙酰磷酸的用途。因此，在优选的实施方式中，本发明还涉及生物或微生物用于从D-果糖生产乙酰磷酸的用途，其中所述生物或微生物表达(i)如上文定义的磷酸酮醇酶；和(ii)如上文定义的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)。对于磷酸酮醇酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
也优选本发明涉及生物或微生物用于从D-葡萄糖生产乙酰磷酸的用途。因此，在优选的实施方式中，本发明还涉及生物或微生物用于从D-葡萄糖生产乙酰磷酸的用途，其中所述生物或微生物表达(i)如上文定义的磷酸酮醇酶；和(ii)2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)，并且其中所述生物或微生物还表达(iii)果糖-葡萄糖异构酶，优选木糖异构酶(EC 5.3.1.5)。对于磷酸酮醇酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)果糖-葡萄糖异构酶、和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
本发明不仅涉及磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的(微)生物用于从D-果糖生产D-赤藓糖和/或乙酰磷酸的用途，还涉及上述磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的(微)生物和上述2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)或表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)或表达果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的(微)生物的组合用于从D-果糖生产乙醇醛和乙酰磷酸的用途。对于磷酸酮醇酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
本发明还涉及上述磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的(微)生物以及上述葡萄糖-果糖异构酶或表达葡萄糖-果糖异构酶的(微)生物的组合用于从D-葡萄糖生产乙酰磷酸和D-赤藓糖的用途。对于磷酸酮醇酶、葡萄糖-果糖异构酶和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
本发明还涉及上述磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的(微)生物以及上述2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)或表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或表达果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的(微)生物的组合用于从D-果糖生产乙酰磷酸的用途。对于磷酸酮醇酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
本发明还涉及上述磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的(微)生物、上述2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)或表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或表达果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的(微)生物以及上述葡萄糖-果糖异构酶或表达葡萄糖-果糖异构酶的(微)生物的组合用于从D-葡萄糖生产乙酰磷酸的用途。对于磷酸酮醇酶、2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)、葡萄糖-果糖异构酶和(微)生物，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
本发明还涉及包括D-果糖和磷酸酮醇酶的组合物。本发明还涉及包括D-果糖和磷酸酮醇酶和2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的组合物。
本发明还涉及包括D-赤藓糖和2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的组合物。本发明还涉及包括D-赤藓糖和2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)和磷酸酮醇酶的组合物。
本发明还涉及包括D-葡萄糖、葡萄糖-果糖异构酶和磷酸酮醇酶并且任选地还包括2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的组合物。
此外，本发明还涉及包括以下的组合物
(i)D-果糖；和
(ii)上述表达磷酸酮醇酶的生物或微生物。
优选地，生物或微生物还表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)
此外，本发明还涉及包括以下的组合物
(i)D-赤藓糖；和
(ii)上述表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)的生物或微生物。
优选地，生物或微生物还表达上述磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶(EC2.3.3.15)；或者
本发明还涉及包括以下的组合物
(i)D-葡萄糖；和
(ii)上述表达葡萄糖-果糖异构酶并表达磷酸酮醇酶的生物或微生物。
优选地，生物或微生物还表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)、果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)，并且再更优选还表达硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)。
就上述组合物组分的优选实施方式而言，关于根据本发明的方法所述内容同样适用。
附图说明
图1显示了通过利用(天然存在的)葡萄糖-果糖异构酶(“第一酶促步骤”)、磷酸酮醇酶(“第二酶促步骤”)、醛缩酶(“第三酶促步骤”)和磷酸酮醇酶(“第四酶促步骤”)经由D-赤藓糖和乙醇醛从D-葡萄糖(或D-果糖)生产乙酰磷酸的人工代谢路径。
图2显示了以下的HPLC色谱图
a)来自假长双歧杆菌的磷酸酮醇酶和D-果糖作为底物的磷酸酮醇酶测定中的反应混合物；
b)没有酶的反应混合物。
图3显示了假长双歧杆菌的磷酸酮醇酶催化的磷酸酮醇酶反应的速率作为底物浓度的函数的图。起始速率从反应的100分钟的动力学计算。
图4显示了以下的HPLC色谱图
a)来自假长双歧杆菌的磷酸酮醇酶和乙醇醛作为底物的磷酸酮醇酶测定中的反应混合物；
b)没有酶的反应混合物。
图5显示了通过乙酰磷酸的水解产生乙酸，上述乙酰磷酸自身通过硫代乙醛乙酰基转移酶(Xsc)催化在磷酸的存在下从乙醇醛产生。
图6显示了如所示由不同2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶催化的从D-赤藓糖产生的乙醇醛的生产。
以下实例中将对本发明的其他方面和优势进行说明，给出所述实例的目的在于说明，而无意进行限制。
本申请中引用的各出版物、专利、专利申请或其他文件在此均全文并入作为参考。
具体实施方式
实施例
实施例1：磷酸酮醇酶的克隆、表达和纯化
重组酶的基因合成、克隆和表达
由原核生物基因组推导出的磷酸酮醇酶的序列通过寡核苷酸串联产生，以适合大肠杆菌密码子使用(基因由商业合成)。将一段6组氨酸密码子插入到蛋氨酸起始密码子之后，以提供用于纯化的亲和力标签。将由此合成的基因克隆到含有修饰的多克隆位点(MCS)的修饰的pUC18表达载体(New England Biolabs)中。所关注的基因在PacI和NotI限制酶切位点克隆。
使用标准热休克方法将感受态MG1655大肠杆菌细胞用这些载体转化。将转化的细胞在30℃、160rpm震摇的条件下在LB-氨苄青霉素培养基中生长。
通过在4℃、10,000rpm下离心20分钟，收集细胞，并将沉淀物在-80℃下储存。
蛋白质纯化和浓缩
将来自200ml培养细胞的沉淀物在冰上融化，并再悬浮在3ml含有300mM NaCl、5mMMgCl2、1mM DTT和10mM咪唑的50mM Tris-HCl pH 7.5中。加入10μl lysonase(Merck)。将细胞在室温下孵育10分钟，然后返回冰上20分钟。通过超声2x 30秒，完成细胞溶解。然后将细胞提取物通过在4℃、10,000rpm下离心20分钟澄清。将澄清的细菌溶解物装载在允许吸附6-His标记的蛋白质的PROTINO-1000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上。将柱洗涤，所关注的酶用含有300mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、250mM咪唑的4ml 50mM Tris-HCl pH 7.5洗脱。然后将洗脱物在Amicon Ultra-4 10kDa过滤单位(Millipore)上浓缩，脱盐，并将酶再悬浮在50mM Tris-HCl pH 7.5中。在长期储存之前，将酶制剂补充有10％甘油。在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上通过直接UV 280nm测量，对蛋白质浓度进行定量。由此纯化的蛋白质纯度从70％到90％变化。
实施例2：用D-果糖作为底物研究磷酸酮醇酶活性
酶促反应
酶促反应在以下条件下进行：
50mM Tris-HCl pH 7.5
50mM磷酸钠pH 7.5
5mM硫胺素焦磷酸(TPP)
5mM MgCl2
23mM氟化钠
1.9mM L-半胱氨酸盐酸盐
50mM果糖(Sigma)
pH调节至7.5。
酶浓度范围为3-5mg/ml。
进行不加入酶或不加入底物的对照测定。
磷酸酮醇酶使用D-果糖作为底物的能力通过使用多达3种分析方法确认：使用基于HPLC分析检测乙酸和D-赤藓糖以及乙酰磷酸的化学测定。
基于HPLC的方法
使用基于HPLC的方法，监测在磷酸酮醇酶的存在下从D-果糖形成乙酸和D-赤藓糖。乙酰磷酸对水解特别不稳定，释放出乙酸。因此，选择监测乙酸作为分析方法的一部分。
酶促反应(参见上述)在37℃在震摇下以0.15ml总体积进行18小时，并通过在80℃孵育5分钟停止。然后将测定管离心，将100μl澄清的上清液转移至洁净的小管中。使用商业乙酸钠、D-果糖和D-赤藓糖(Sigma-Aldrich)作为参比。使用装有折射计检测器和柱加热模块的1260亲和力LC系统(Agilent)进行HPLC分析。在装有PL Hi-Plex H保护柱(50x 7.7mm)的Hi-Plex H柱(300x 7.7mm，粒径8μm，柱温65℃)上分离10μl样品。流动相由硫酸水溶液(5.5mM)组成，并以0.6ml/分钟的流速运转。这些条件下D-果糖、D-赤藓糖和乙酸钠的保留时间分别为12.5、14.4和18.5分钟。用来自假长双歧杆菌的重组磷酸酮醇酶得到的典型色谱图如图2所示。
HPLC分析结果显示于表1。乙酸和D-赤藓糖的收率说明D-葡萄糖碳部分的定量回收。
表1.由不同来源的磷酸酮醇酶(PKT)转化50mM D-果糖形成的产物
(HPLC测量的精度和准确度分别为约20％和80-120％)。
使用基于异羟肟酸的比色测定对从D-果糖形成乙酰磷酸的动力学分析
酶促反应的组成与上述相同。使用D-果糖浓度范围(0-500mM)和恒定浓度磷酸钠(50mM)确定动力学参数。
每个酶促反应通过加入3mg/ml纯化的磷酸酮醇酶开始。孵育在37℃在震摇下进行20、40、60、80、100分钟。通过使用以下流程检测乙酰基-异羟肟酸铁(III)确定乙酰磷酸的浓度(Racker E.,Methods Enzymol.5,1962,276-280)：
将0.1ml盐酸羟基(2M,pH 6.5)加入到0.1ml反应混合物中。在室温下孵育10分钟之后，将样品用35μl 30％三氯乙酸酸化。然后加入35μl8M HCl和35μl FeCl3试剂(0.1MHCl中10％FeCl3)。将样品通过离心进一步澄清，并在505nm处测量乙酰基-异羟肟酸铁复合物的吸收。使用商业乙酰磷酸(Sigma-Aldrich)制备校正曲线。纯化的重组磷酸酮醇酶的动力学参数显示于表2中。
表2.以D-果糖作为底物来自不同来源的磷酸酮醇酶的动力学参数
图3显示了与来自假长双歧杆菌的磷酸酮醇酶收集的数据对应的Michaelis-Menten图的例子
实施例3：以乙醇醛作为底物磷酸酮醇酶的活性分析
酶促反应
酶促反应在以下条件下进行：
50mM Tris-HCl pH 7.5
50mM磷酸钠pH 7.5
5mM硫胺素焦磷酸(TPP)
5mM MgCl2
23mM氟化钠
1.9mM L-半胱氨酸盐酸盐
50mM乙醇醛(Sigma)
pH调节至7.5。
酶浓度范围为3-5mg/ml。
进行不加入酶或不加入底物的对照测定。
磷酸酮醇酶使用乙醇醛作为底物的能力通过使用多达两种分析方法确认：使用基于HPLC的分析检测乙酸以及乙酰磷酸的化学测定。
基于HPLC的方法
酶促反应(参见上述)在37℃在震摇下进行48小时，并通过在80℃下孵育5分钟停止。然后将测定管离心，将100μl澄清的上清液转移至洁净的小管中。根据实施例2中所述的流程在Hi-Plex H柱上进行HPLC分析。使用商业乙酸钠和乙醇醛(Sigma-Aldrich)作为参比。这些条件下乙醇醛的保留时间为15.4分钟。
在磷酸酮醇酶的存在下在酶促测定中产生大量乙酸，在没有酶的对照反应中检测不到乙酸信号。
用来自假长双歧杆菌的磷酸酮醇酶得到的典型色谱图如图4所示。
使用基于异羟肟酸的比色测定对从乙醇醛形成乙酰磷酸的动力学分析
酶促反应的组成与上述相同。使用乙醇醛浓度范围(0-100mM)和恒定浓度磷酸钠(50mM)确定动力学参数。
每个测定通过加入3mg/ml纯化的磷酸酮醇酶开始。孵育在37℃在震摇下进行20、40、60、80、100分钟。通过根据实施例2中所述的流程检测乙酰基-异羟肟酸铁(III)在化学上确定乙酰磷酸的浓度。
纯化的重组磷酸酮醇酶的动力学参数显示于表3中。
表3.以乙醇醛作为底物来自不同来源的磷酸酮醇酶的动力学参数
实施例4：大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的表达和纯化
蛋白质表达
含有编码大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(Uniprot P0A6L0)的基因的载体pCAN购自NAIST(Nara Institute of Science and Technology,Japan,ASKAcollection)。提供的载体在蛋氨酸起始密码子之后含有一段6组氨酸密码子。
使用标准热休克流程将感受态BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)用该载体转化。转化的细胞在补充有氯霉素(25μg/ml)的ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW,Prot.Exp.Pur.41(2005),207-234)中在震摇(160rpm)下在37℃生长7小时。蛋白质表达在18℃持续过夜(大约12小时)。通过在4℃、10,000rpm下离心20分钟收集细胞，沉淀物在-80℃冷冻。
蛋白质纯化
将来自200ml培养的细胞的沉淀物在冰上融化，并再悬浮在6ml含有0.5M NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT和10mM咪唑的50mM Tris-HCl中。加入10μl lysonase(Merck)。将细胞在室温下孵育10分钟，然后返回冰上20分钟。通过超声2x 30秒，完成细胞溶解。然后将细胞提取物通过在4℃、10,000rpm下离心20分钟澄清。
根据制造商推荐将2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶在PROTINO-1000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上纯化。然后将含有所关注的酶的洗脱物浓缩，在Amicon Ultra-410kDa过滤单位(Millipore)上脱盐，将酶再悬浮在50mM Tris-HCl pH 7.5中，并补充有50mM NaCl和10％甘油。。在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上通过直接UV280nm测量，对蛋白质浓度进行定量。由此纯化的蛋白质纯度从70％到90％变化。
实施例5：研究从D-赤藓糖酶促生产乙醇醛
酶促反应在以下条件下进行：
50mM Tris-HCl pH 7.5
50mM NaCl
10mM MgCl2
1mM DTT
50mM D-赤藓糖(Sigma-Aldrich)
pH调节至7.5。
将1mg纯化的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶加入到0.2ml反应混合物中。进行不加入酶或不加入底物的对照测定。将反应混合物在37℃下孵育过夜(大约18小时)，通过在80℃孵育10分钟将反应停止。
然后将测定管离心，过滤，将100μl澄清的上清液转移至洁净的小管中。根据实施例2中所述的方法在Hi-Plex H柱上进行HPLC分析。
在没有底物的情况下观察不到乙醇醛的形成。没有酶的反应的HPLC分析显示仅有痕量乙醇醛，可能由D-赤藓糖的自发分解导致。催化测试显示，在来自大肠杆菌的纯化的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的存在下，乙醇醛的生产显著增加。从乙醇醛峰面积判断，在酶的存在下孵育18小时之后产生的乙醇醛对比不存在酶的情况下产生的乙醇醛的比例为大约9倍(表4)。这些结果清楚地表明，2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶催化D-赤藓糖转化为乙醇醛。
表4.从D-赤藓糖产生乙醇醛
实施例6：以乙醇醛作为底物硫代乙醛乙酰基转移酶的活性研究
基因克隆和蛋白质表达
由原核生物基因组推导出的硫代乙醛乙酰基转移酶(Xsc)序列通过寡核苷酸串联产生，以适合大肠杆菌密码子使用(基因由商业合成)。将一段6组氨酸密码子插入到蛋氨酸起始密码子之后，以提供用于纯化的亲和标签。将由此合成的基因克隆到pET-25b(+)表达载体(载体由构建)中。
使用标准热休克流程将感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)用这些载体转化。将转化的细胞使用ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW,Prot.Exp.Pur.41,(2005),207-234)在震摇(160rpm)下在30℃生长7小时，蛋白质表达在18℃持续过夜(大约16小时)。通过在4℃、10,000rpm下离心20分钟收集细胞，沉淀物在-80℃储存。
蛋白质纯化
根据实施例1中所述的流程使用PROTINO-1000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)并使用50mM磷酸钠pH 7.5代替Tris-HCl缓冲液对硫代乙醛乙酰基转移酶进行纯化。在NanoDrop1000分光光度计(Thermo Scientific)上通过直接UV 280nm测量，对蛋白质浓度进行定量。如SDS-PAGE分析推测，由此纯化的蛋白质纯度从75％到90％变化。
酶促测定
酶促测定在以下条件下进行：
50mM磷酸钠pH 7.5
1mM硫胺素焦磷酸(TPP)
5mM MgCl2
50mM乙醇醛(Sigma-Aldrich)
pH调节至7.5。
通过加入5mg/ml纯化的酶开始每个测定。孵育在37℃在震摇下进行1小时。进行不加入酶或不加入底物的对照测定。
硫代乙醛乙酰基转移酶(Xsc)使用乙醇醛作为底物的能力通过使用两种分析方法确认：化学测定乙酰磷酸和使用基于HPLC的分析检测乙酸。
基于异羟肟酸的比色测定
通过根据实施例2中所述的流程检测乙酰基-异羟肟酸铁来测定乙酰磷酸。
使用不同硫代乙醛乙酰基转移酶在酶促测定中产生的乙酰磷酸的浓度显示于表5中。
表5.由不同硫代乙醛乙酰基转移酶催化的从乙醇醛和磷酸产生乙酰磷酸
基于HPLC的方法
酶反应在37℃在震摇下进行1小时(参见上述)，并通过在80℃孵育5分钟停止。然后将测定管离心，将等份澄清的上清液转移至洁净的小管中。根据实施例2中所述的流程在Hi-Plex H柱上进行HPLC分析。在使用硫代乙醛乙酰基转移酶(Xsc)的测定中产生大量乙酸(图5)，在不含酶的对照和没有底物的测定中均没有观察到乙酸信号。
总体上，这些数据说明，来自不同来源的硫代乙醛乙酰基转移酶能够催化从乙醇醛和磷酸形成乙酰磷酸。
实施例7：不同2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶催化的将D-赤藓糖转化成乙醇醛
构建编码来自不同原核和真核生物的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DeoC,DERA)家族代表的11基因文库，并进行测试。
基因克隆、蛋白质表达和纯化
如实施例6所述合成编码2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶EC 4.1.2.4的基因，并将其克隆到pET-25b(+)表达载体(载体由构建)中。
将对应的酶在大肠杆菌中表达，并如实施例4中所述纯化。使用以下测定测试每个酶催化从D-赤藓糖产生乙醇醛的能力：
50mM Tris-HCl pH 7.5
50mM D-赤藓糖(Sigma-Aldrich)
10mM MgCl2
50mM NaCl
1mM DTT
酶5mg/ml
进行不加入酶或不加入底物的对照测定。测定在37℃进行4小时(参见上文所述)，并通过在95℃孵育10分钟停止。然后将测定管离心，将等份澄清的上清液转移至洁净的小管中。使用装有折射计检测器和柱加热模块的1260Infinity LC系统(Agilent)进行HPLC分析。使用如下连续连接的3个柱分离10μl样品：
1.Hi-Plex保护柱(50x 7.7mm，粒径8μm)(Agilent)
2.Hi-Plex柱(100x 7.7mm，粒径8μm)(Agilent)
3.Hi-Plex柱(300x 7.7mm，粒径8μm，柱温70℃)(Agilent)
流动相由硫酸水溶液(8.4mM)组成，并以0.5ml/分钟运行。分析在70℃进行。
使用市售乙醇醛(Sigma-Aldrich)作为参比。这些条件下赤藓糖和乙醇醛的保留时间分别为20.2和22分钟。
在没有底物的测定中没有观察到乙醇醛信号。在商业提供的D-赤藓糖中发现一定量乙醇醛(参见，例如，图6，“无酶”的柱)。2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶测定显示来自赤藓糖的乙醇醛生产的酶依赖性的增加，从乙醇醛的峰面积判断(图6)。这些数据表明，D-赤藓糖切割成乙醇醛可以由2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶催化。

Claims (15)

1.生产D-赤藓糖和乙酰磷酸的方法，包括通过利用磷酸酮醇酶将D-果糖酶促转化成D-赤藓糖和乙酰磷酸。
2.权利要求1的方法，其中磷酸酮醇酶是
(a)磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.9)，或
(b)果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.22)。
3.生产乙醇醛的方法，包括通过利用醛缩酶将D-赤藓糖酶促转化成乙醇醛，其中所述醛缩酶是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)。
4.从D-果糖生产乙醇醛和乙酰磷酸的方法，包括：
(a)根据权利要求1或2的方法从D-果糖生产D-赤藓糖和乙酰磷酸；并还包括：
(b)根据权利要求3的方法将由此生产的D-赤藓糖酶促转化成乙醇醛。
5.生产乙酰磷酸的方法，包括：
(a)根据权利要求3或4的方法生产乙醇醛；并还包括：
(b)通过利用磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)将由此生产的乙醇醛酶促转化成乙酰磷酸。
6.权利要求5的方法，其中磷酸酮醇酶是
(i)磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.9)，或
(ii)果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(EC 4.1.2.22)。
7.权利要求1、2和4-6中任一项的方法，还包括通过利用葡萄糖-果糖异构酶将D-葡萄糖酶促转化成所述D-果糖。
8.权利要求7的方法，其中所述葡萄糖-果糖异构酶是木糖异构酶(EC5.3.1.5)。
9.生物或微生物用于从D-果糖生产乙酰磷酸的用途，所述生物或微生物表达
(i)磷酸酮醇酶；和
(ii)2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)。
10.如权利要求9中定义的生物或微生物用于从D-果糖生产乙酰磷酸的用途，其中所述生物或微生物还表达
(iii)果糖-葡萄糖异构酶。
11.组合物，包括
(i)D-果糖；和
(ii)磷酸酮醇酶；
和任选地
(iii)2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)
或者
(i)D-赤藓糖；和
(ii)2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)；
和任选地
(iii)磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)；
或者
(i)D-葡萄糖；
(ii)葡萄糖-果糖异构酶；和
(iii)磷酸酮醇酶；
和任选地
(iv)2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC4.1.2.13)。
12.组合物，包括
(i)D-果糖；和
(ii)生物或微生物，其表达磷酸酮醇酶或者表达磷酸酮醇酶和2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或者表达磷酸酮醇酶和果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)；
或者
(i)D-赤藓糖；和
(ii)生物或微生物，其表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或者表达果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)或者表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)和磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)或者表达果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)和磷酸酮醇酶或硫代乙醛乙酰基转移酶(EC 2.3.3.15)；
或者
(i)D-葡萄糖；和
(ii)生物或微生物，其表达葡萄糖-果糖异构酶并且表达磷酸酮醇酶，并任选地表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)。
13.磷酸酮醇酶或表达磷酸酮醇酶的生物或微生物用于从D-果糖生产D-赤藓糖和/或乙酰磷酸的用途。
14.2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4)或表达2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EC4.1.2.4)或果糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的生物或微生物用于从D-赤藓糖生产乙醇醛的用途。
15.生产乙酰-CoA的方法，包括
(a)根据权利要求1、2和5-8中任一项的方法生产乙酰磷酸；并还包括
(b)在辅酶A(CoA)的存在下通过利用磷酸转乙酰酶将由此生产的乙酰磷酸酶促转化成乙酰-CoA。
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