CN106520932A - 一种检测nk/t细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，包括如下步骤：（1）样本的制备与预处理；（2）样本DNA和无重复序列探针共变性和杂交；（3）杂交后洗涤、复染；（4）观察判读结果。本发明所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其准确性高，信号清晰，重复性好，检测成本低。

Description

一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法
技术领域
本发明涉及诊断NK/T细胞淋巴瘤，尤其涉及一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法。
背景技术
结外NK/T细胞淋巴瘤，是鼻型的一种少见类型，约占非霍奇金淋巴瘤的2%～10%，其恶性细胞大部分来源于成熟的NK细胞，少部分来源于NK样T细胞，因此称之为NK/T细胞淋巴瘤。多数病例原发于鼻腔和咽喉部以上部位，少数病例原发于鼻外，如皮肤、胃肠道、肺等，极少数病例发病初期即表现为全身播散， 而无明显鼻腔受累。其病理表现独特，具有以血管为中心的多形性淋巴细胞浸润， 瘤细胞浸润破坏血管继而引起坏死等特点，多数病例存在EB病毒感染证据。
结外 NK/T细胞淋巴瘤发病有地域或种族易感性，多发于亚洲以及南美洲，特别高发于中国、韩国、日本，西欧及北美少见。
现在，结外 NK/T细胞淋巴瘤发病率逐渐变高，临床症状常表现为鼻塞、流涕、血涕或鼻衄、耳鸣、声嘶、咽痛、吞咽不适及黏膜溃疡等严重侵害了患者的健康。其他结外病变部位如皮肤,可表现为结节、溃疡和黏膜红斑等;胃肠道受累可引起腹痛、肠梗阻或穿孔等;肺部受累可有咳嗽、咯血等。由于结外 NK/T细胞淋巴瘤的发病机制与EBV感染密切相关，因此该肿瘤一个重要的临床特点即容易发生噬血细胞综合征，表现为发热、肝脾肿大、血细胞减少、组织可见噬血细胞现象、肝功能异常、血乳酸脱氢酶升高、血清铁蛋白升高等。
各部位发生的结外 NK/T细胞淋巴瘤病理组织学形态及免疫表型基本相似。组织学方面,瘤细胞呈弥漫性浸润,常围绕并侵入、破坏血管壁,伴组织大片坏死。瘤细胞大小不等，以小到中等的淋巴细胞混合为主,常常可出现数量不等的大细胞，背景中可有大量混合性炎性细胞。虽然大细胞数量不一,但并不代表肿瘤的恶性度不同。
结外 NK/T细胞淋巴瘤容易误诊,主要有以下原因:1)本病发病率低,早期临床表现不典型,造成对疾病的认识不足;2)病理取材不当。该疾病以坏死性病变为主，故病灶中心多为坏死组织，因此活检部位应在坏死灶与病变组织交界处取材，必要时反复多次并多点取材，组织块要足够大,并采用"咬切",避免挤压导致细胞变形,以提高活检的正确率;3)由于肿瘤细胞变异较大，可见大、中、小多样细胞,甚至有的病变并发感染,这都导致病理诊断相当困难,很容易与坏死组织伴炎性浸润混淆。
结外NK/T细胞淋巴瘤对放疗敏感，对于早期鼻腔结外 NK/T细胞淋巴瘤患者，给予单纯放疗效果较好，且较大剂量的放疗远期生存率较高。但考虑到患者治疗后远处转移率较高，提示采用合理的化疗仍有必要，目前对于早期结外NK/T细胞淋巴瘤提倡放化疗联合的治疗方案。
结外NK/T细胞淋巴瘤化学治疗。所以前期的体外分子诊断对NK/T细胞淋巴瘤的治疗有很好的指导意义。
但现有NK/T细胞淋巴瘤的检测存在检测准确性低，检测结果不清晰、重复性差，检测成本高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其准确性高，信号清晰，重复性好，检测成本低。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，包括如下步骤：
（1）样本的制备与预处理；
（2）样本DNA和无重复序列探针共变性和杂交；
（3）杂交后洗涤、复染；
（4）观察判读结果。
所述样本为确诊为NK/T细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织切片。
所述确诊为NK/T细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织切片的制备与预处理包括如下步骤：首先将患者新鲜组织取下1小时内放入10%中性福尔马林溶液中固定，固定时间为6—48小时；接着用切片机将石蜡切成3—5um，然后将3—5um的石蜡放入温度为40℃的超纯水中漂浮展开，接着将展开的石蜡切片附在带正电荷的玻璃片上，然后将附着有石蜡切片的玻璃片风干后再在56℃的温度下烤片备用。
10%中性福尔马林溶液是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好别的标本保存液。经它固定的标本，可适应一些特殊染色。它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织 缩轻微，硬性大于酒精。
所述无重复序列探针是通过Genome Browser 搜索特异序列，经过合成，标记、纯化制得。
所述玻片上混合无重复序列探针混合液，盖上盖玻片，封胶；接着将无重复序列探针与样本DNA通过ThermoBrite杂交仪变性、杂交。
所述ThermoBrite杂交仪内变性的温度为75℃，变性时间为5分针；所述ThermoBrite杂交仪内杂交的温度为37℃，杂交的时间为18小时。
所述杂交后洗涤包括如下步骤：首先去除树胶，放入第一缸杂交后洗液中，室温，浸泡1-5分针后除去盖玻片；接着取出玻片，放入第二缸杂交后洗液中，温度为72—74℃，漂洗2分钟；然后取出玻片，吸取残留液体，暗处自然干燥玻片，备用。
所述杂交后复染包括如下步骤：首先将玻片完全干燥，接着将15µl DAPI复染剂滴加于杂交区域，盖上盖玻片，然后在暗处且-20℃避光储存。暗处且-20℃避光储存能防止荧光信号淬灭。
本发明的有益效果是：一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其准确性高，信号清晰，重复性好，检测成本低。
具体实施方式
实施例1
一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，包括如下步骤：
（1）样本的制备与预处理；
（2）样本DNA和无重复序列探针共变性和杂交；
（3）杂交后洗涤、复染；
（4）观察判读结果。
所述样本为确诊为NK/T细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织切片。
所述确诊为NK/T细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织切片的制备与预处理包括如下步骤：首先将患者新鲜组织取下1小时内放入10%中性福尔马林溶液中固定，固定时间为6—48小时；接着用切片机将石蜡切成3—5um，然后将3—5um的石蜡放入温度为40℃的超纯水中漂浮展开，接着将展开的石蜡切片附在带正电荷的玻璃片上，然后将附着有石蜡切片的玻璃片风干后再在56℃的温度下烤片备用。
所述无重复序列探针是通过Genome Browser 搜索特异序列，经过合成，标记、纯化制得。
所述玻片上混合无重复序列探针混合液，盖上盖玻片，封胶；接着将无重复序列探针与样本DNA通过ThermoBrite杂交仪变性、杂交。
所述ThermoBrite杂交仪内变性的温度为75℃，变性时间为5分针；所述ThermoBrite杂交仪内杂交的温度为37℃，杂交的时间为18小时。
所述杂交后洗涤包括如下步骤：首先去除树胶，放入第一缸杂交后洗液中，室温，浸泡1-5分针后除去盖玻片；接着取出玻片，放入第二缸杂交后洗液中，温度为72—74℃，漂洗2分钟；然后取出玻片，吸取残留液体，暗处自然干燥玻片，备用。
所述杂交后复染包括如下步骤：首先将玻片完全干燥，接着将15µl DAPI复染剂滴加于杂交区域，盖上盖玻片，然后在暗处且-20℃避光储存。
本实施例的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其准确性高，信号清晰，重复性好，检测成本低。

Claims (8)

1.一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)样本的制备与预处理；
(2)样本DNA和无重复序列探针共变性和杂交；
(3)杂交后洗涤、复染；
(4)观察判读结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述样本为确诊为NK/T细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织切片。
3.根据权利要求2所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述确诊为NK/T细胞淋巴瘤患者的石蜡包埋组织切片的制备与预处理包括如下步骤：首先将患者新鲜组织取下1小时内放入10%中性福尔马林溶液中固定，固定时间为6—48小时；接着用切片机将石蜡切成3—5um，然后将3—5um的石蜡放入温度为40℃的超纯水中漂浮展开，接着将展开的石蜡切片附在带正电荷的玻璃片上，然后将附着有石蜡切片的玻璃片风干后再在56℃的温度下烤片备用。
4.根据权利要求1所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述无重复序列探针是通过Genome Browser 搜索特异序列，经过合成，标记、纯化制得。
5.根据权利要求1所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述玻片上混合无重复序列探针混合液，盖上盖玻片，封胶；接着将无重复序列探针与样本DNA通过ThermoBrite杂交仪变性、杂交。
6.根据权利要求5所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述ThermoBrite杂交仪内变性的温度为75℃，变性时间为5分针；所述ThermoBrite杂交仪内杂交的温度为37℃，杂交的时间为18小时。
7.根据权利要求1所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述杂交后洗涤包括如下步骤：首先去除树胶，放入第一缸杂交后洗液中，室温，浸泡1-5分针后除去盖玻片；接着取出玻片，放入第二缸杂交后洗液中，温度为72—74℃，漂洗2分钟；然后取出玻片，吸取残留液体，暗处自然干燥玻片，备用。
8.根据权利要求1所述的一种检测NK/T细胞淋巴瘤拷贝数变异的检测方法，其特征在于：所述杂交后复染包括如下步骤：首先将玻片完全干燥，接着将15µl DAPI复染剂滴加于杂交区域，盖上盖玻片，然后在暗处且-20℃避光储存。
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