CN106520794B - 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法 - Google Patents

过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106520794B
CN106520794B CN201611115500.5A CN201611115500A CN106520794B CN 106520794 B CN106520794 B CN 106520794B CN 201611115500 A CN201611115500 A CN 201611115500A CN 106520794 B CN106520794 B CN 106520794B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus acidophilus
overexpressed
lba0625
gene
udpglucose pyrophosphorylase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611115500.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106520794A (zh
Inventor
曾小群
彭刘杨
潘道东
孙洁
黄芩
吴振
孙杨赢
曹锦轩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo University
Original Assignee
Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo University filed Critical Ningbo University
Priority to CN201611115500.5A priority Critical patent/CN106520794B/zh
Publication of CN106520794A publication Critical patent/CN106520794A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106520794B publication Critical patent/CN106520794B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07009—UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase (2.7.7.9), i.e. UDP-glucose-pyrophosphorylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法，特点是具体步骤如下：（1）以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；将表达载体pMG36e用限制性内切酶HindⅢ单酶切，并去磷酸化切胶回收后，将PCR扩增产物插入到表达载体pMG36e构建重组表达载体；（2）将过表达质粒提取浓缩后电转化导入至嗜酸乳杆菌，37℃复苏2h后，涂布红霉素抗性平板，再在37℃培养36h筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌PLY127‑1，优点是能显著提高嗜酸乳杆菌冻干存活率。

Description

过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆 菌的构建方法
技术领域
本发明属于生物工程及微生物发酵技术领域，具体是涉及一株过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法。
背景技术
嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus，La.)是第三代乳制品发酵剂，在食品和医药工业上常用作发酵剂及益生菌制品。其广泛存在于人及一些动物的肠道中，具有耐酸和耐胆酸盐能力，能顺利通过肠胃环境定植于动物肠道形成优势种群，当其达到一定数量时，能够起到很好的保健作用。主要包括以下几个方面：增强机体免疫力、缓解乳糖不耐症、延缓机体衰老、调节肠道菌群平衡。冷冻干燥法是制备乳酸菌发酵剂的主要技术之一。采用冷冻干燥法制备的发酵剂具有单位含菌量高、接种量小、运输方便、保存期长等优点，适用于长期保存，是目前应用最广泛的菌种保藏方法。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）是糖代谢中一种重要的酶，它能催化反应UTP+葡萄糖-1-磷酸⇋ UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）+PPi。UDPG是重要的核苷酸糖之一，是主要活化糖的形式，参与蔗糖、纤维素、胼胝质等的合成。而UDPG的主要来源是通过UGPase的催化下生成的，因此UGPase催化的这一反应将关系到下游的二糖或多糖的代谢。UGPase可能与乳酸菌抗冻干胁迫有关。目前，通过优化冻干保护剂配方来提高冻干存活率的报道已经很多，而从嗜酸乳杆菌的遗传及生理学角度对其冻干存活率的影响的报道甚是少见。因此，通过分子生物学技术改造菌株来提高嗜酸乳杆菌冻干存活率具有重要的经济价值和社会意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能显著提高冻干存活率的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625），所述基因来自于嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus ）ATCC 4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）的基因。
其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。
上述过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，具体步骤如下：
（1）重组表达载体pMG-LBA0625的构建
以嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus ）ATCC 4356基因组DNA为模板，设计PCR引物，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；将表达载体pMG36e用限制性内切酶HindⅢ单酶切，并去磷酸化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，将PCR扩增产物插入到表达载体pMG36e组成型启动子P32下游多克隆位点，在50℃反应15min，构建重组表达载体pMG-LBA0625；
（2）重组嗜酸乳杆菌的构建
将pMG-LBA0625过表达质粒经质粒小量提取试剂盒提取浓缩后电转化导入至嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus）ATCC 4356中，37℃复苏2h后，涂布红霉素抗性平板，再在37℃培养36h，筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1。
所述的PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT；LBA0625下游扩增引物：GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC。
所述的PCR扩增程序如下：（1）94℃ 4min；（2）98℃ 10sec， 60℃ 5sec，72℃1min；重复30个循环；（3）72℃ 5min；PCR反应体系如下表所示：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，20mM 正向引物1 μL，20mM 反向引物1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5 μL，用蒸馏水补足至 50μL。
所述的PCR扩增产物和所述的表达载体pMG36e摩尔比为2∶1。
所述的电转化具体步骤如下：
（1）嗜酸乳杆菌感受态的制备
将一环嗜酸乳杆菌ATCC 4356接种至20mL M17培养基中，37℃过夜培养得到种子液；将5mL种子液接入100mL含0.5wt%葡萄糖和0.5wt%甘氨酸的M17培养基中，培养至OD≈0.8；于3000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗3次之后，用20mL预冷的A液洗涤细胞2次，于3000rpm，离心10min，收集菌体，即得到感受态嗜酸乳杆菌细胞；然后用预冷的0.5mL A液重悬，80μL分装备用，再直接进行下一步实验，或-80℃保存感受态细胞；其中所述的A液为含有10wt%甘油和10wt%蔗糖的超纯水溶液；
（2）嗜酸乳杆菌的电转
将感受态嗜酸乳杆菌细胞和1～5μg过表达质粒pMG-LBA0625转移到冰冷的0.1cm间隙的电极杯中，以1.5kv，25μF，200 Ω，5.1ms脉冲转化；然后迅速往电极杯中加入1mL预冷MRS培养基，于37℃复苏2h，即感受态嗜酸乳杆菌导入过表达质粒pMG-LBA0625。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一株能显著提高冻干存活率的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）基因及其重组嗜酸乳杆菌PLY127-1的构建方法。通过克隆嗜酸乳杆菌ATCC4356（lactobacillus acidophilusATCC4356）的UGPase基因（LBA0625）片段连接到pMG36e表达载体上，利用电转化的方法导入到嗜酸乳杆菌中，通过红霉素抗性筛选并鉴定获得带有目的基因的重组菌，即过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1。该重组嗜酸乳杆菌比PLY127-0菌株的酶活提高了41.11%，并在以水、10%蔗糖、10%葡萄糖等保护剂为冷冻干燥保护剂时，其冻干存活率比空载嗜酸乳杆菌PLY127-0菌株分别提高了15.94%、19.97%、26.75%，其首次构建了一株能显著提高冻干存活率的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1，为制备高活性发酵剂和微生态制剂奠定研究基础和技术支持。
附图说明
图1为过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625 ）基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为目的基因LBA0625 PCR扩增后产物；
图2为表达载体pMG36e经HindⅢ单酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果；Lane1、2为pMG36e经HindⅢ单酶切并去磷酸化的验证结果图；
图3为pMG-LBA0625重组质粒图谱；
图4为重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与空载嗜酸乳杆菌工程菌PLY127-0的酶活测定结果图；
图5为用无菌水做冻干保护剂获得的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与重组空载菌PLY127-0的冻干存活率；
图6为用10wt%蔗糖溶液做冻干保护剂获得的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与重组空载菌PLY127-0的冻干存活率；
图7为用10wt%葡萄糖溶液做冻干保护剂获得的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与重组空载菌PLY127-0的冻干存活率。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
重组表达载体pMG-LBA0625的构建
1、设计PCR引物用于扩增过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因片段，PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT；LBA0625下游扩增引物：GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC。
2、以嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus）ATCC 4356（该嗜酸乳杆菌已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏中心登记入册编号为1.1878）基因组DNA为模板，进行如下PCR程序：
（1）94℃ 4min；
（2）98℃ 10sec；
（3）60℃ 5sec；
（4）72℃ 1min；
（5）72℃ 5min；
其中步骤（2）-（4）重复30个循环。
PCR反应体系如下表所示：表2
试剂 用量/μL
5×PrimeSTAR Buffer 10
dNTP Mixture 4
20mM 正向引物 1
20mM 反向引物 1
模板DNA 2
PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5
ddH2O 31.5
Total 50
图1为目的基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中Lane1、2为基因LBA0625 PCR扩增后产物，由产物条带位置可以看出产物分子量大小大致正确。
3、将表达载体pMG36e用限制性内切酶HindⅢ单酶切，并去磷酸化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，将PCR扩增产物插入到表达载体pMG36e组成型启动子P32下游多克隆位点，PCR产物和表达载体以2∶1的摩尔比用无缝克隆试剂盒在50℃反应15min，构建重组表达载体pMG-LBA0625；图2为表达载体pMG36e经HindⅢ单酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果，由图2可知载体酶切完全，并且条带位置正确。图3为pMG-LBA0625重组质粒图谱，是将PCR产物插入表达载体pMG36e中，成功构建了重组表达质粒pMG-LBA0625。
实施例2
嗜酸乳杆菌基因工程菌PLY127-1、PLY127-0的构建
将实施例1制备得到的pMG-LBA0625过表达质粒经质粒小量提取试剂盒提取浓缩后电击转化导入至嗜酸乳杆菌ATCC 4356，37℃复苏2h后，涂布红霉素抗性平板，再在37℃培养36h，筛选转化子，转化子经PCR验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1。
同时将未处理的表达载体pMG36e经质粒小量提取试剂盒提取及浓缩后，电击转化导入至嗜酸乳杆菌ATCC 4356，37℃复苏2h后，涂布红霉素抗性平板，再在37℃培养36h，筛选转化子，转化子经PCR验证，从而获得空载嗜酸乳杆菌工程菌PLY127-0。
上述质粒浓缩详细步骤如下：向提取的pMG36e质粒中（质粒浓度为200μg/μL）中加入DNA溶液1/10倍体积乙酸钠（3mol/L，pH=5.2）充分混匀，使其终浓度为0.3 mol/L；加入DNA溶液2倍体积用冰预冷的无水乙醇，充分混匀置于-20℃条件下30min；离心（12,000×g，10min），小心移除上清液，吸走管壁上的液滴；加入1/2离心管容量的70wt%乙醇溶液，离心（12,000×g，2min）；将EP管开盖，于室温下使残留液体挥发至干；加入适量ddH2O溶解DNA，浓缩后的质粒浓度大约为1mg/mL。
上述电转化具体步骤如下：
1、嗜酸乳杆菌感受态的制备：
将一环嗜酸乳杆菌ATCC 4356接种至20mL M17培养基中，37℃过夜培养得到种子液；将5mL种子液接入100mL含0.5wt%葡萄糖和0.5wt%甘氨酸的M17培养基中，培养至OD≈0.8；于3000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗3次之后，用20mL预冷的A液（含有10wt%甘油和10wt%蔗糖的超纯水溶液）洗涤细胞2次，于3000rpm，离心10min，收集菌体，即得到感受态嗜酸乳杆菌细胞；然后用预冷的0.5mL A液重悬，80μL分装备用，再直接进行下一步实验，或-80℃保存感受态细胞。
2、嗜酸乳杆菌的电转
将步骤1制备得到的感受态嗜酸乳杆菌细胞和1～5μg过表达质粒pMG-LBA0625转移到冰冷的0.1cm间隙的电极杯中，以1.5kv，25μF，200 Ω，5.1ms脉冲转化；然后迅速往电极杯中加入1mL预冷MRS培养基，于37℃复苏2h；将菌液涂布在抗性平板上，于37℃培养直到平板上出现菌落。
实施例3
嗜酸乳杆菌工程菌的酶活测定
将实施例2制备的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1接种于MRS肉汤培养基（配方为：以1000 ml蒸馏水为基准，酵母浸出液(BR)5 g，牛肉浸膏(BR)10 g，蛋白胨(BR)10 g，吐温-801 g，硫酸锰0.05 g，硫酸镁0.5 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，柠檬酸三铵2 g，磷酸二氢钾2g，121°C灭菌15分钟））中，于37℃静止培养活化18h，制备种子培养液，将种子培养液以2％(v/v)的接种量接种于MRS肉汤培养基中扩大培养18h，于5000rpm离心15min后弃上清，菌体用生理盐水洗3次后，超声破碎提取蛋白，于10,000×g离心20min后，取其上清用UGPase试剂盒检测酶活(如图4所示)，同理测定空载嗜酸乳杆菌工程菌PLY127-0的酶活(如图4所示)。由图4可知，LBA0625基因过表达重组基因工程菌的酶活为465.17 U/L，比PLY127-0菌株酶活329.65U/L提高了41.11%。
实施例4
嗜酸乳杆菌工程菌冻干存活率的测定方法
1、用无菌水做冻干保护剂，比较重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与重组空载菌PLY127-0的冻干存活率
将冷藏于-40℃冰箱的嗜酸乳杆菌工程菌PLY127-1、PLY127-0分别接种于MRS肉汤培养基中活化18h，得种子培养液；将种子培养液以2％（v/v）的接种量接种于MRS肉汤培养基中扩大培养18h，得发酵液；将20mL发酵液离心收集沉淀，用生理盐水洗3次后，再加入1mL无菌水，取100μL菌液进行平板计数，剩下的放入-80℃冰箱过夜预冻；将预冻好的样品冷冻干燥（-49℃，9Pa）24h，取出样品，每管加900μL无菌水重悬菌体，取100μL进行计数。冻干存活率=冻干前活菌数/冻干后活菌数。
结果如图5所示，用无菌水做冻干保护剂时，PLY127-1冻干存活率相比于PLY127-0提高了15.94%。
2、用10wt%蔗糖溶液做冻干保护剂，比较重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与重组空载菌PLY127-0的冻干存活率
将冷藏于-40℃冰箱的嗜酸乳杆菌工程菌PLY127-1、PLY127-0分别接种于MRS肉汤培养基中活化18h，得；将种子培养液以2％（v/v）的接种量接种于MRS肉汤培养基中扩大培养18h，得发酵液；将20mL发酵液离心收集沉淀，用生理盐水洗3次后，再加入1mL10wt%蔗糖溶液，取100μL菌液进行平板计数，剩下的放入-80℃冰箱过夜预冻；将预冻好的样品冷冻干燥（-49℃，9Pa）24h，取出样品，每管加900μL无菌水重悬菌体，取100μL进行计数。冻干存活率=冻干前活菌数/冻干后活菌数。
结果如图6所示，用10%蔗糖做冻干保护剂时，PLY127-1冻干存活率相比于PLY127-0提高了19.97%。
3、用10wt%葡萄糖溶液做冻干保护剂，比较重组嗜酸乳杆菌PLY127-1与重组空载菌PLY127-0的冻干存活率
将冷藏于-40℃冰箱的嗜酸乳杆菌工程菌PLY127-1、PLY127-0分别接种于MRS肉汤培养基中活化18h，得种子培养液；将种子培养液以2％（v/v）的接种量接种于MRS肉汤培养基中扩大培养18h，得发酵液；将20mL发酵液离心收集沉淀，用生理盐水洗3次后，再加入1mL10%葡萄糖, 取100μL菌液进行平板计数，剩下的放入-80℃冰箱过夜预冻；将预冻好的样品冷冻干燥（-49℃，9Pa）24h，取出样品，每管加900μL无菌水重悬菌体，取100μL进行计数。冻干存活率=冻干前活菌数/冻干后活菌数。
结果如图7所示，用10%葡萄糖做冻干保护剂时，PLY127-1冻干存活率相比于PLY127-0提高了26.75%。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因
<400> 1
ATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGCAGCTGGGTTAGGTACTAGATTCTTACCTGCAACTAAAGCTTTGCCAAAAGAAATGTTACCAATTGTTGATAAGCCAACAATTCAATTTATTGTTGAAGAAGCTAAAAAATCTGGAATTGAAGATATCCTGATTATTATTGGTAAAAATAAGCGCCCAATTGAAGACCATTTTGATGCAAATCCTGAACTAGAACAGGATTTGAAGGAAAAAGGGAAAGATGAACTTCTTGAATTAACTCAGGGAATTACTAATTTGGGTGTTAACTTATATTACACTAGACAACCTCATCCAGCAGGCCTTGGAGATGCAATTTATCGTGCCCGTAGTTTTGTTGGAGATGAACCTTTTGTAGTTATGCTTGGTGATGATTTGATGGACGACAAAGTTCCATTAACTAAGCAATTAATTGATCGATACAACAAGACTCATGCCTCAACTATTGCTGTTATGCCAGTACCACATGAAGAAGTATCAAAATATGGTGTTATCGAACCAGAAAATGAAATTTTACCTGGTTTAATTAACGTTAAGTCATTTGTCGAAAAACCAGATGTTGACAAGGCACCAAGTGACTATGCAATTATTGGCCGCTATTTGTTAATGCCTGAAATTTTTGAAATTTTAGCAAATCAAAAACCAGGTCGTGGTGGAGAAATCCAATTAACTGATGCCATTGATACAATGAATAAGACTCAACGTGTATTTGCCCATGTCTTTAAGGGTGAACGTCATGATGTTGGTAACAAAGAAGGATATCTTGAAACTTCAATTGAATATGGTTTAAAGCATCCAGAAATTAAAGATCAATTGCGTGAATATATTCAACGCTTAGGCAAAAAATTTGAAGCTGAAGATAAGCGAAAAAATAAATAA903
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LBA0625上游扩增引物
<400> 2
TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT 29
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LBA0625下游扩增引物
<400> 3
GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC 41

Claims (6)

1.一种过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于：所述基因来自于嗜酸乳杆菌ATCC 4356编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQID No：1所示。
2.过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)重组表达载体pMG-LBA0625的构建
以嗜酸乳杆菌ATCC 4356基因组DNA为模板，设计PCR引物，扩增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625，，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示；将表达载体pMG36e用限制性内切酶HindⅢ单酶切，并去磷酸化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，将PCR扩增产物插入到表达载体pMG36e组成型启动子P32下游多克隆位点，在50℃反应15min，构建重组表达载体pMG-LBA0625；
(2)重组嗜酸乳杆菌的构建
将pMG-LBA0625过表达质粒经质粒小量提取试剂盒提取浓缩后电转化导入至嗜酸乳杆菌ATCC 4356中，37℃复苏2h后，涂布红霉素抗性平板，再在37℃培养36h，筛选转化子；转化子经PCR进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌PLY127-1。
3.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，其特征在于PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游扩增引物：
TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT；LBA0625下游扩增引物：
GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC。
4.根据权利要求3所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，其特征在于PCR扩增程序如下：(1)94℃4min；(2)98℃10sec，60℃5sec，72℃1min；重复30个循环；(3)72℃5min；PCR反应体系如下所示：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，20mM 正向引物1μL，20mM反向引物1μL，模板DNA 2μL，PrimeSTAR HSDNA聚合酶0.5μL，用蒸馏水补足至50μL。
5.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，其特征在于：所述的PCR扩增产物和所述的表达载体pMG36e摩尔比为2∶1。
6.根据权利要求2所述的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，其特征在于所述的电转化具体步骤如下：
(1)嗜酸乳杆菌感受态的制备
将一环嗜酸乳杆菌ATCC 4356接种至20mL M17培养基中，37℃过夜培养得到种子液；将5mL种子液接入100mL含0.5wt％葡萄糖和0.5wt％甘氨酸的M17培养基中，培养至OD≈0.8；于3000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗3次之后，用20mL预冷的A液洗涤细胞2次，于3000rpm，离心10min，收集菌体，即得到感受态嗜酸乳杆菌细胞；然后用预冷的0.5mL A液重悬，80μL分装备用，再直接进行下一步实验，或-80℃保存感受态细胞；其中所述的A液为含有10wt％甘油和10wt％蔗糖的超纯水溶液；
(2)嗜酸乳杆菌的电转
将感受态嗜酸乳杆菌细胞和1～5μg过表达质粒pMG-LBA0625转移到冰冷的0.1cm间隙的电极杯中，以1.5kv，25μF，200Ω，5.1ms脉冲转化；然后迅速往电极杯中加入1mL预冷MRS培养基，于37℃复苏2h，即感受态嗜酸乳杆菌导入过表达质粒pMG-LBA0625。
CN201611115500.5A 2016-12-07 2016-12-07 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法 Active CN106520794B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611115500.5A CN106520794B (zh) 2016-12-07 2016-12-07 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611115500.5A CN106520794B (zh) 2016-12-07 2016-12-07 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106520794A CN106520794A (zh) 2017-03-22
CN106520794B true CN106520794B (zh) 2019-08-20

Family

ID=58341908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611115500.5A Active CN106520794B (zh) 2016-12-07 2016-12-07 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106520794B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486140A (zh) * 2018-02-27 2018-09-04 温州医科大学 一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒
CN111019958A (zh) * 2019-12-11 2020-04-17 宁波大学 过表达utp-葡萄糖-1-磷酸-尿苷转移酶基因及其重组工程菌的构建方法和应用
CN112080451A (zh) * 2020-07-13 2020-12-15 宁波大学 一种嗜酸乳杆菌的食品级基因表达体系及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014134195A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Chromatin, Inc. Methods for enabling farnesene accumulation in plants and related compositions
CN105624176A (zh) * 2016-01-15 2016-06-01 厦门大学 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014134195A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Chromatin, Inc. Methods for enabling farnesene accumulation in plants and related compositions
CN105624176A (zh) * 2016-01-15 2016-06-01 厦门大学 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Metabolic profiling reveals altered sugar and secondary metabolism in response to UGPase overexpression in Populus;Raja S Payyavula等;《BMC Plant Biology》;20141007;第14卷;1-14
甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析;连玲等;《农业生物技术学报》;20121231;第20卷(第5期);481-488

Also Published As

Publication number Publication date
CN106520794A (zh) 2017-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Probiotic properties of Weissella strains isolated from human faeces
Sun et al. Identification and characterization of the dominant lactic acid bacteria from kurut: The naturally fermented yak milk in Qinghai, China
CN106520794B (zh) 过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重组嗜酸乳杆菌的构建方法
CN101948794A (zh) 产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用
CN109679864B (zh) 一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
Sarikkha et al. Identification of bacteria and yeast communities in a Thai sugary kefir by Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) analyses
CN104560784A (zh) 副干酪乳杆菌及其应用以及发酵制品及其制备方法
CN109943617A (zh) 生产丁酸及／或其盐类的方法
CN104726360A (zh) 一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用
Wang et al. Identification and characterization of Diutina rugosa SD-17 for potential use as a probiotic
CN103993022B (zh) 低分子量透明质酸的制备方法及工程菌
CN117305169A (zh) 一株链球菌及其应用
CN107254428A (zh) 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用
CN105441334B (zh) 产灰树花多糖的菌株及其应用
Moussa et al. Rapid detection and characterization of Salmonella enterica serovars by multiplex polymerase chain reaction assay
CN115094010B (zh) 一种高产甲酸丁酸梭菌
CN116064360A (zh) 一种提高菌株冷冻干燥存活率的方法
CN104480056B (zh) 一种高产胞外多糖的基因工程菌及其制备方法和应用
CN115216460B (zh) 一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用
CN115851491A (zh) 植物乳植杆菌及其应用
Ayertey et al. Screening, isolation and characterization of lactic acid bacteria strains in fermenting cocoa heaps from the Eastern Region of Ghana
CN107630082A (zh) 一种检测、鉴定嗜酸乳杆菌ncfm的方法
Goranov et al. Kinetics of batch fermentation in the cultivation of a probiotic strain Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus B1
CN110144312B (zh) 一种产麦芽四糖淀粉酶的嗜热芽孢杆菌及其应用
CN102071158A (zh) 一种耐低温沼气菌剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant