CN106520684B - 一种心肌细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心肌细胞培养基，其配方如下：每1000mL DMEM/F12培养基中含有100～150nM氯化钙、50‑150nM氯化镁、5～15％胎牛血清、2～‑8％马血清、50nM～400nM异丙肾上腺素、0.2～0.8mg/ml ATP、0.05～1.5U/ml辅酶A和1×的抗生素、10～20ng/ml FGF和5～15nM β‑巯基乙醇；其配制方法为：将异丙肾上腺素、氯化钙、氯化镁、胎牛血清、马血清、β‑巯基乙醇、FGF、ATP、辅酶A和抗生素溶解于DMEM/F12培养基中，过滤除菌后即成。本发明的培养基主要基于心肌细胞对营养物主的需要配制，可以维持心肌细胞的正常跳动，并保持心肌细胞正常跳动功能一个月以上，此外本发明的培养基的配制方法简单，成本低廉。

Description

一种心肌细胞培养基
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种心肌细胞培养基。
背景技术
心肌细胞的培养是心脏疾病研究的基础，心肌细胞状态的好坏，直接关系到研究的结果，培养状态良好且具有功能的心肌细胞是心脏疾病研究不可忽略的重要部分。市场上的心肌细胞系，并不具有正常心肌的功能，对于心脏疾病的研究，原代心肌细胞的提取培养是研究心肌缺血再灌注、心梗、心脏病治疗等研究必不可少的必经之路。原代心肌细胞的分离培养，还不够成熟，在整个实验过程中由于细胞培养基的配制不够给心肌细胞提供良好的营养，往往导致心肌细胞的死亡和难以培养。随着干细胞的发展，干细胞应用于治疗心脏疾病的研究也越来越多，干细胞向心肌细胞诱导分化成为研究的热点，以间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的研究为主，为干细胞治疗心脏疾病提供依据。原代心肌细胞的培养及干细胞向心肌细胞的诱导都成为心脏疾病研究的基础实验，该实验的结果直接关系到后续整体实验的结论，心肌细胞培养状态的好坏直接与培养基密切相关。关于心肌细胞的培养及培养基的配制，也有许多报道。较为详实的心肌细胞提取培养的记录在由TimothyD.O’Connell，Manoj C.Rodrigo，and Paul C.Simpson Summary等人编写的书中出现(O’Connell，Rodrigo，and Simpson 2007)，其主要成份为培养基缓冲液及钙离子，但该培养基配制复杂，操作繁琐。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种心肌细胞培养基。
本发明的技术方案如下：
一种心肌细胞培养基，其配方如下：每1000mL DMEM/F12培养基中含有100～150nM氯化钙、50-150nM氯化镁、5～15％胎牛血清、2～-8％马血清、50nM～400nM异丙肾上腺素、0.2～0.8mg/ml ATP、0.05～1.5U/ml辅酶A和1×的抗生素、10～20ng/ml FGF和5～15nMβ-巯基乙醇；其配制方法为：将异丙肾上腺素、氯化钙、氯化镁、胎牛血清、马血清、β-巯基乙醇、FGF、ATP、辅酶A和抗生素溶解于DMEM/F12培养基中，过滤除菌后即成。
在本发明的一个优选实施方案中，每1000mL DMEM/F12培养基中含有100nM～200nM异丙肾上腺素。
在本发明的一个优选实施方案中，所述抗生素为antibiotic-antimycotic。
本发明的有益效果：本发明的培养基主要基于心肌细胞对营养物主的需要配制，可以维持心肌细胞的正常跳动，并保持心肌细胞正常跳动功能一个月以上，此外本发明的培养基的配制方法简单，成本低廉。
附图说明
图1为本发明实施例1的心肌细胞培养基培养新生大鼠心肌细胞。
图2为本发明实施例2的心肌细胞培养基培养大鼠胚胎心管细胞。
图3为本发明心肌细胞培养基诱导带有绿色荧光的大鼠间充质分化为心肌细胞。
图4为本发明实施例1和实施例2中心肌细胞和心管细胞的动作电位图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
心肌细胞完全培养基配方：将10％胎牛血清、5％马血清、1×antibiotic-antimycotic、100nM异丙肾上腺素、120nM CaCl2、80nM MgCl2、10nM β-巯基乙醇、0.4mg/mlATP、0.1U/ml辅酶A、10ng/ml FGF和1000mL DMEM/F12培养基混匀过滤备用。
分离1-3天Lewis大鼠的乳鼠心肌细胞，用该培养基，37℃，5％的二氧化碳条件下进行培养，可见乳鼠心肌细胞可跳动，且贴壁生长良好(见图1)，细胞进行电生理实验，具有典型的心肌动作电位(见图4)。
实施例2
心肌细胞完全培养基配方：将15％胎牛血清、8％马血清、1X antibiotic-antimycotic、400nM异丙肾上腺素、150nM CaCl2、150nM MgCl2、15nM β-巯基乙醇、0.8mg/ml ATP、1.5U/ml辅酶A、20ng/ml FGF和1000mL DMEM/F12培养基混匀过滤备用。
提取11.5天孕鼠胚胎心管细胞，用该培养基培养37℃，5％的二氧化碳条件下进行培养，可以看到大鼠胚胎心管细胞成团生长，状态良好，显微镜下可以观察到心管细胞的跳动(见图2)，进行电生理实验，具有典型的心肌细胞动作电位(见图4)。
实施例3
心肌细胞完全培养基配方：将5％胎牛血清、2％马血清、1X antibiotic-antimycotic、50nM异丙肾上腺素、50nM CaCl2、50nM MgCl2、10M β-巯基乙醇、0.2mg/mlATP、0.5U/ml辅酶A、10ng/ml FGF和1000mL DMEM/F12培养基混匀过滤备用。
大鼠心肌细胞与带绿色荧光的间充质干细胞在本实施例的培养基中共同培养7天后，用大鼠的cTnT抗体和Desmin进行免疫染色分析，可以看到间充质干细胞已经表达了cTnT和Desmin，这表明间充质干细胞已经被诱导转化为心肌细胞(见图3，该图为激光共聚焦的结果。MSC(大鼠间充质干细胞)用心肌培养集培养诱导成为心肌细胞。DAPI为细胞核染料，可以看到MSC的细胞核，GFP为绿色荧光，是通过慢病毒转染到MSC中的基因，此蛋白发绿色荧光。cTnT和desmin为心肌细胞主要标记，此蛋白的表达，标志着MSC成为心肌。从图中看到带有带有GFP的MSC细胞表达cTnT和desmin，证明MSC被诱导变成心肌细胞)。
本领域普通技术人员可知，本发明的技术方案在下述范围内变化时，仍然能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍然属于本发明的保护范围：
一种心肌细胞培养基，其配方如下：每1000mL DMEM/F12培养基中含有100～150nM氯化钙、50-150nM氯化镁、5～15％胎牛血清、2～-8％马血清、50nM～400nM异丙肾上腺素、0.2～0.8mg/ml ATP、0.05～1.5U/ml辅酶A和1×的抗生素、10～20ng/ml FGF和5～15nMβ-巯基乙醇；其配制方法为：将异丙肾上腺素、氯化钙、氯化镁、胎牛血清、马血清、β-巯基乙醇、FGF、ATP、辅酶A和抗生素溶解于DMEM/F12培养基中，过滤除菌后即成。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (3)

1.一种心肌细胞培养基，其特征在于：其配方如下：每1000mL DMEM/F12培养基中的组分为：100~150 nM氯化钙、50-150nM氯化镁、5~15%胎牛血清、2~8%马血清、50nM~400nM异丙肾上腺素、0.2~0.8 mg/ml ATP、0.05~1.5U/ml辅酶A和1×的抗生素、10~20ng/ml FGF和5~15 nM β-巯基乙醇；其配制方法为：将异丙肾上腺素、氯化钙、氯化镁、胎牛血清、马血清、β-巯基乙醇、FGF、ATP、辅酶A和抗生素溶解于DMEM/F12培养基中，过滤除菌后即成。
2.如权利要求1所述的一种心肌细胞培养基，其特征在于：每1000mL DMEM/F12培养基中含有100nM~200nM异丙肾上腺素。
3.如权利要求1所述的一种心肌细胞培养基，其特征在于：所述抗生素为antibiotic-antimycotic。
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