CN106519266A

CN106519266A - 聚合物/生物实体合金的制备方法

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Publication number: CN106519266A
Application number: CN201611108522.9A
Authority: CN
Inventors: T·费雷拉; F·巴塔伊; C·德韦; J·巴尔比耶
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Poitiers; Valagro Carbone Renouvelable Poitou Charentes SAEM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Poitiers; Valagro Carbone Renouvelable Poitou Charentes SAEM
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: CA2859479A1; TR201809694T4; PL2794730T3; MX350934B; JP2015509990A; EP2794730A1; CA2859479C; KR102081171B1; EP2794730B1; ES2677102T3; US20210009765A1; FR2984354A1; CN104159950A; US20160333147A1; PT2794730T; FR2984355A1; JP2018076501A; CN106519266B; JP6334410B2; KR20140116418A

Abstract

本发明涉及一种聚合物/生物实体合金的制备方法，其包括在热处理过程中，将聚合物与降解它的生物实体混合的步骤，所述热处理在高于室温的温度T下进行且所述生物实体对所述温度T耐受，其特征在于所述生物实体选自降解所述聚合物的酶和降解所述聚合物的微生物。

Description

聚合物/生物实体合金的制备方法

本申请是申请日为2012年12月20日、申请号为201280069803.1、发明名称为“聚合物/生物实体合金的制备方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及石化工业衍生的和/或生物来源的聚合物材料的制备方法，在聚合物材料的组成中含有生物实体，其选自能够使其降解的酶和微生物。

背景技术

近些年来，特别是在塑料领域，聚合物材料已被密集使用。这种普遍的密集使用已由环境中积聚的塑料反映出，这是视觉滋扰、废地丛生以及土壤和海洋介质的污染的根源。由于聚合物材料本身固有的特性，特别是它们的耐降解，衍生自这些材料的废物的处理目前构成真正的环境和经济问题。

目前，已提出几种解决方案，其中之一是可生物降解塑料材料。它们的配方是特别针对适于环境微生物降解的。然而，这种降解通常是部分发生。此外，降解需要极其有利的条件，这特别在标准EN 13432中有详细描述。这些条件在人工条件下才能遇到，比如工业堆肥。例如，这些材料通常在40℃以上的温度降解。从能源和财务的角度看，要实现这些温度条件是非常昂贵的。

处理废物的标准替代方案，如焚烧或倾倒在垃圾场，证明是有害的，甚至当它们应用于可生物降解材料时，因为其降解并不完全发生。

此外，可生物降解材料在物理性能上，特别是对潮湿、温度以及机械拉伸的耐受性方面有缺陷。这些缺陷使它们不适合用于标准塑料加工操作，如注射成型或挤出，同时它们也不适合有针对性的应用。

因此，这些可生物降解的材料，虽然有前途的，但不能满足工业和环境要求。

已有人提出在由聚合物组成的材料中添加植物性填料以提高所述材料的可降解性。然而，降解是由于所述植物性填料的降解，这必然导致部分降解。此外，这种解决方案证明并不完善，因为它没有保留聚合物的机械性能。也因此限制了这种材料在塑料加工领域的应用。

因此，需要可生物降解的材料，其具有与石化来源塑料相同的机械性能，且适用于塑料加工的标准操作。所述材料能够以可接受的降解速率完全降解，且在与自然环境中通常发生的那些相适应的温度、pH和湿度条件下完全降解。

发明内容

经过长期深入的研究，本发明人已经研发出一种聚合物材料的制备方法，在该聚合物组成中含有使其能够降解的生物实体。由此制得的聚合物材料或聚合物/生物实体合金(polymer/biological entities alloy)所具有的物化性能使其能够在含水条件下完全降解而同时在固态条件下保持稳定。

本发明因此涉及一种聚合物/生物实体合金的制备方法，其包括在热处理过程中，将聚合物与降解它的生物实体混合的步骤，所述热处理在高于室温的温度T下进行且所述生物实体对所述温度T耐受，其特征在于所述生物实体选自能够降解所述聚合物的酶和能够降解所述聚合物的微生物。本发明人已表明，令人惊奇且出乎意料的是，这个制备方法使生物实体包含在固体聚合物的特有结构中，同时能够保持所述生物实体的酶活性。

不希望受理论约束，当所述生物实体是一种酶时，本发明人提出一种假说：温度的升高伴随着聚合物中羟基的气化，从而激活了酶。这种酶的激活引起聚合物的开始水解并因此玻璃化覆盖酶表面。酶然后得以保护。

本发明人也已表明生物实体的存在实质上提高了所述合金的可降解性且没有影响聚合物的机械性能。因此，所述合金的机械性能与单独聚合物的机械性能非常类似，甚至完全相同。通过测定弹性、熔体流动指数、拉伸参数(如最大拉伸应力、断裂伸长率、拉伸杨氏弹性模量)可以确定这些机械性能。因此，根据本发明的制备方法获得的合金非常适合塑料加工的标准操作。

本发明人已表明，令人惊奇的是，生物实体在本发明的合金中保持酶活性。此外，所述合金不在溶液中时，保持稳定。只有当本发明的合金置于溶液中时，生物实体才被激活。因此，这些生物实体的存在使得可以控制本发明的合金的降解条件和降解率。

因此，本发明的合金具有不在溶液中时稳定的优点，一方面，这便于材料的储存和运输，另一方面，这表明存在一个生物实体的活化的“释放”效果(或延迟效应)。这种释放效果非常有利，因为这使得可以控制酶活性的激活和本发明合金的降解。

术语“聚合物/生物实体合金”和“本发明的合金”是指一种在其组成中含有使其能够降解的生物实体的聚合物。因此这样的表述包含聚合物/酶合金和聚合物/微生物合金。

术语“生物实体”是指一种酶或一种微生物。在本法明的上下文中，所述生物实体具有能够降解目标聚合物的特点。

术语“聚合物/酶合金”是指一种在其组成中含有使其能够降解的酶的聚合物。优选地，所述聚合物是可生物降解聚合物。使用可生物降解聚合物作为完成制备的起始材料能够获得具有更有利的降解性能的聚合物/酶合金。

术语“聚合物/微生物合金”是指一种在其组成中含有使其能够降解的微生物的聚合物。通常，这些微生物产生降解所述聚合物的酶。

术语“热处理”是指在所述聚合物温度升高的过程中，全部聚合物的转化操作，优选地，温度高于室温，更优选地，温度高于50℃。优选地，所述热处理允许包含生物实体。更优选地，所述热处理由一种操作构成，所述操作选自挤出、注射成型、热成型、旋转成型、压缩、压延、熨烫、涂覆、分层、膨胀、拉挤、挤出吹塑、挤出膨胀和压缩制粒。这些操作可以在聚合物液态或固态的形式下进行。在一个优选实施方案中，聚合物是固态形式。在另一个实施方案中，所述聚合物是浆的形式。

术语“室温”通常的是指20℃到30℃之间的温度，更优选的温度为约25℃。

术语“挤出”是指使用挤出机将颗粒或粉末形式的材料制成所需形式的聚合物。此术语包含型材挤出、挤出吹塑，挤出膨胀和挤出压延。

挤出步骤在所述聚合物的熔点下进行。该聚合物此时处于部分或完全熔融状态。温度因此取决于所述聚合物的性质和目标生物实体的性质。本领域技术人根据其常识，可以容易地确定此温度。在温度和压力的作用下，处于部分或完全熔融状态的所述可生物降解聚合物与其它起始材料混合，特别是降解其的生物实体。优选地，所述温度T在所述聚合物的玻璃体转化温度和熔点之间。更优选地，所述温度T是所述聚合物的熔点。通常，所述温度T取决于所述聚合物的性质和目标生物实体的性质，且其大于50℃,优选地大于60℃,优选地大于70℃,优选地大于80℃,优选地大于90℃,优选地大于100,优选地大于120℃,优选地大于140℃,优选地大于150℃。通常，此温度T不超过300℃。

挤出机的主要功能是通过温度和压力的作用使聚合物能够通过位于其末端的模具。通常，挤出机由一个或多个具有不同温度水平的加热护套、一个或两个将材料沿加热护套输送的阿基米德螺杆、一个用于使颗粒或粉形式的待挤出材料进料到不同点的料斗、一个位于加热护套末端并赋予连续涌出的塑料材料所需的形状和尺寸的更复杂或更不复杂的模具。优选地，挤出步骤在以名称为Clextral出售的BC21双螺杆挤出机上进行。

挤出步骤的运用属于本领域技术人员的正常能力范围内。通常按以下步骤进行：

-加入聚合物和降解其的生物实体的混合物；

-所述混合物通过挤出机；

-通过模具输出杆状物；

-冷却所述杆状物，可选择性地后续加以干燥；

-切割成作为所需形式的函数的规则颗粒形式；和

-干燥，优选地，在回转炉中，在约40℃和约60℃的温度间干燥，更优选地，在约50℃的温度干燥。

通常，生物实体/聚合物的重量比在约0.1％至约10％之间，优选地在约0.5％至约8％之间，优选地在约1％至约6％之间，优选地在约1％至约5％之间，优选地在约1％至约4％之间，优选地在约1％至约3％之间，优选地在约1.5％至约3％之间，甚至更优选地，这一比率约为2％。本领域技术人员可采用作为生物降解聚合物的性质、所用生物实体的性质和所需结果，特别是通过本制备方法所获得的合金的降解能力的函数的比率。

优选地，本发明方法还包括添加一种可以优化所述生物实体的降解能力的物质。通常，当所述生物实体是酶时，这些物质可以是所述酶的辅助因子，如二价阳离子。

在本发明的上下文中，术语“聚合物”包括来源于石化工业的聚合物、生物来源的聚合物和生物基聚合物。

在一个具体实施方案中，在本发明的上下文中相关的聚合物来源于石化工业。这些聚合物的优点是聚合过程和基本成分可控，其可确保容易转化。通常，它们含有包含可水解键的单体单元，如酯或酰胺。

这些单体的非限制性列表包括己内酯、四亚甲基琥珀酸酯、酯、酯酰胺、丙烯，C₁-C₆的羟基链烷酸酯和己二酸-对苯二甲酸-丁二醇酯。

与实施本发明有关的聚合物的非限制性列表包括聚己内酯、聚四亚甲基琥珀酸酯、共聚酯、聚酯酰胺、聚丙烯、乙烯聚合物、聚(C₁-C₆羟基链烷酸酯)和聚(己二酸共-苯二甲酸-丁二醇酯)、醋酸纤维素、聚(琥珀酸丁二醇酯)和聚酰胺以及它们的混合物。

通常，所述聚酰胺是脂肪族聚酰胺，其选自：

聚己内酰胺(PA6),

通过月桂内酰胺的开环制得的聚月桂酰胺(PA12)，

从氨基十一烷酸制得的聚十一酰胺(PA11)，

从四亚甲基乙二胺和己二酸制得的聚己二酰丁二胺(PA 4-6),

聚己二酰己二胺(PA6-6),

从己二胺和1,9-壬二酸制得的聚壬二酰己二胺(PA 6-9),

从己二胺和癸二酸制得的聚酰胺6.6,癸二酸–1,6-己二胺(PA6-10)，和

从己二胺和1,12-十二烷二酸制得的聚十二碳二酰己二胺(PA6-12)。

优选地，所述聚酰胺是从氨基十一烷酸制得的聚十一酰胺(PA11)。

在本发明的另一个模式中，在本发明的上下文中有关的聚合物是生物来源聚合物。

术语“生物来源聚合物”是指来源于可再生资源的聚合物。这类生物来源聚合物偶尔与添加剂(如塑化剂)混合使用。在这类生物来源聚合物中，可生物降解的生物来源聚合物与不可生物降解的生物来源聚合物是有区别的，如：

聚酰胺，特别是聚酰胺PA11；

聚氯乙烯；

聚乙烯；和

聚丙烯。

优选地，所述聚合物选自聚己内酯(或CAPA)、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(对苯二甲酸丙二醇酯)、C₁-C₆的聚羟基链烷酸酯、醋酸纤维素，聚(己二酸-对苯二甲酸-丁二醇酯)、聚(琥珀酸丁二醇酯)和聚酰胺PA11以及它们的混合物。

更优选地，所述聚合物是聚乳酸或PLA。PLA具有与某些石化热塑料(如聚丙烯)类似的机械性能。

甚至更优选地，所述聚合物是聚己内酯或CAPA。

在另一实施方案中，所述聚合物是生物基聚合物。术语“生物基聚合物”是指使用天然来源的，最好是非石化来源的化合物制造的聚合物。

在本发明的上下文中，生物实体应优选一种酶，其能够耐受根据本发明方法的挤出步骤的操作温度。本领域技术人员具有能够确定此温度并鉴别能够耐受此温度的生物实体的常识。

术语“可生物降解聚合物”是指能够被生物实体降解的材料。这类材料的降解结果是形成水、二氧化碳和甲烷以及选择性的副产物。所述聚合物降解过程中产生的副产物是无毒的。

标准NE 13432:2000陈述了可通过堆肥和生物降解升级的包装相关的要求。标准设定了材料应具备哪些特征才能被定义为可堆肥。它基于下述标准：

可生物降解性：这通过材料代谢转化为二氧化碳测定。使用标准方法EN 14046测定该性能。在少于6个月内分解程度达到90％。

崩解：这是指材料分裂且在最终堆肥中无法目视识别。这通过堆肥方法EN14045测定。材料应在有机废物的存在下，在少于3个月内崩解。此后，堆肥用2mm的筛子过筛。尺寸大于2mm的材料残留物被认为是未崩解的。这部分物质的份额应少于初始质量的10％。

低含量重金属且并对堆肥无负作用：根据OECD测试208的方法，对堆肥样品进行植物生长测试。不应调整堆肥物的其他物化参数(相对于不含聚合物的堆肥)：盐度以及氮、磷、镁和钾的％。

在第一个优选实施方案中，所述生物实体是酶，优选对挤出温度耐受的酶。

术语“对挤出温度耐受的酶”是指那些蛋白质结构和/或酶活性不受根据本发明方法的挤出步骤中的操作温度影响的酶。因此这些酶非常适合在高于室温的温度下使用。

优选地，所述酶选自耐热酶和热稳定化的酶。

术语“耐热酶”是指那些固有性质提供了对高温的耐受性的酶，特别是根据本发明方法的挤出步骤中的操作温度。

优选地，所述耐热酶选自来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS、来自荧光假单胞菌的脂肪酶AK、来自南极念珠菌的脂肪酶B、蛋白酶K、C₁-C₆聚羟基链烷酸酯解聚酶和它们的混合物。

术语“热稳定化的”或“热保护的”酶是指那些酶，其不是天然耐热的，但是以给予他们对根据本发明方法的挤出步骤中的操作温度的耐受性的特定形式存在。优选地，热稳定化的酶通过化学或物理过程获得。

优选地，所述热稳定化的酶选自封装在与所述聚合物相同的材料所组成的纳米胶囊中的酶、封装在笼型分子中的酶和聚集在一起的酶。

这些热稳定化的酶可以通过将非耐热的酶封装在纳米胶囊中，优选地，封装在与所述聚合物相同的材料所组成的胶囊中获得。封装技术是本领域技术人员熟知的。通常，采用纳米乳液进行封装。这种酶的封装使控制酶活性成为可能。本发明的该实施方案对于将本发明的合金用于食品包装中特别有利。

热稳定化的酶也可以通过将酶封装到笼型分子中获得。这种封装使得可以保护所述酶免遭温度相关的降解。

术语“笼型分子”是指一种分子，其能够插入所述酶的结构中使酶稳定并使酶能够耐受高于室温的温度。

这些热稳定化的酶也可以通过将非耐热酶聚集在一起获得。本领域技术人员有足够的技术知识来进行这种聚集。

在一个具体实施方案中，所述酶的形式是脱辅基酶且在辅助因子的存在下激活。

在第二种实施方案中，所述生物实体是微生物。

通常情况下，这些微生物是可能会或可能不会形成孢子并产生降解目标聚合物的酶的微生物。优选地，这些微生物是细菌、真菌或酵母。

在一个实施方案中，本发明的合金是一种聚合物/微生物合金，优选地，是聚乳酸/微生物合金。

优选地，所述微生物选自苍白杆菌属的细菌、属于厚壁菌门(Firmus cutis)的细菌、芽孢杆菌纲的细菌，特别是芽孢杆菌属菌株，尤其是蜡样芽胞杆菌G9241，和克劳氏芽孢杆菌属菌株。

更优选地，所述微生物是一种称为苍白杆菌37S且根据布达佩斯条约于2009年7月23日以CNCM I-4212的编号保藏在以the Centre National de la RechercheScientifique at the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes的名义，以CNCM I-4212的编号保藏的苍白杆菌属菌株或者其变种，所述变种可降解聚乳酸。

优选地，所述聚合物是聚乳酸且所述生物实体是苍白杆菌37S细菌，所述细菌降解聚乳酸。

术语“变种”是指：

根据本发明的菌株的自然变种，即根据本发明的菌株在选择性培养基上孵育后自发获得的变种。自然变种是不通过操作者的任何遗传操作下，只通过菌株的自然突变和在合适培养基上选择这种突变的菌株而获得，或者

根据本发明的菌株变种，其基因组中包含至少一个突变，所述突变是遗传工程诱导的，例如通过定点突变或随机突变。例如，随机突变可以通过使用诱变剂进行，如辐射(紫外线、电离辐射、热)或化合物(氮酸、甲烷磺酸乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、吖啶橙、原黄素等)。

术语“突变”是指根据本发明的菌株的基因组中增加、去除或取代至少一个核苷酸。

因此，本发明涉及聚合物/生物实体合金的制备方法，其包含下述步骤：

i)选择聚合物，优选一种可生物降解聚合物；

ii)选择能够降解所述聚合物以及能够耐受高于室温的温度T的生物实体；

iii)在温度T下进行的热处理过程中，混合所述聚合物和所述生物实体，

其特征在于所述生物实体选自能够降解所述聚合物的酶和能够降解所述聚合物的微生物。

所有前面描述过的特征都适用本制备方法。

本制备方法的优点是与塑料加工工业中使用的标准设备兼容，这使专业人员能迅速而直接地实施此方法而不必对常规使用的生产工具做重大修改，尤其是那些通常保留用于石化来源塑料生产的工具。

此外，本发明方法不需要使用对人体健康或环境有潜在害处的产品。该方法也不产生任何有这些害处的副产物。

本发明方法通过包含生物实体，特别是酶与聚合物，特别是可生物降解聚合物结合在一起(这决定由此获得的合金的降解)，使获得一种“定制的”聚合物/生物实体成为可能。

本发明因此能够获得一种聚合物/生物实体合金，为能控制降解速率而优选单一聚合物/酶合金。

这些聚合物/酶合金的非限制性列表包括聚己内酯/来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS；聚己内酯/来自南极念珠菌的脂肪酶B；聚乳酸/蛋白酶K；C₁-C₆聚羟基链烷酸酯/C₁-C₆聚羟基链烷酸酯解聚酶配对物。

优选地，本发明涉及聚合物/酶合金的制备方法，其包括，在聚己内酯的熔点下，以2％的酶/聚合物重量比，聚己内酯和脂肪酶(优选来自洋葱假单胞菌的阿马诺脂肪酶PS)的挤出。具体而言，本发明人已证实由此获得的合金在水介质中经过4个月完全降解，然而不添加脂肪酶的聚己内酯在此时间段内没有降解。

本发明人也表明并例证了这种合金在挤出温度为80℃、100℃、120℃和140℃时降解。

在一个优选实施方案中，本发明还涉及一种聚合物/酶合金，其特征在于所述酶降解所述聚合物且是热稳定化的。

这些合金是非常有利的，这是因为，首先，当它们置于水溶液中时，具有改进的降解性。其次，它们具有适用于工业的机械性能。将酶包含在合金中没有损害聚合物本身的性能。因此，所述合金的机械性能与聚合物本身的机械性能很相似，甚至是完全一样的。

优选地，所述热稳定化的酶选自封装在由与所述聚合物相同的材料所组成的纳米胶囊中的酶、封装在笼型分子中的酶和聚集在一起的酶。

所有前面提到的有关所述聚合物和热稳定化的酶的技术特征都适用于此合金。

或者，本发明涉及一种聚合物/生物实体合金，其特征在于所述聚合物是聚乳酸且所述生物实体是苍白杆菌37S，所述细菌降解聚乳酸。

另一方面，本发明涉及本发明的聚合物/生物实体合金在农业、园艺、包装、建筑修缮、环境、交通、纺织、电子和医药行业领域的用途。在下文中，术语“本发明的合金”和“根据本发明方法的聚合物/生物实体合金”无差别地使用。

优选地，本发明涉及本发明的合金在包装行业的用途，更优选地用于食品特别是水果和蔬菜的包装，以及烘培行业。因此，本发明涉及将本发明的合金用作具有较长保质期的食品包装。具体而言，本发明的合金非常适合与食品接触，因为它没有任何有害的影响，它可容易降解并构成了阻止二氧化碳、氧气和水通过的屏障从而使食品免受损害。

本发明还涉及本发明的合金在农业领域的用途，特别是用于制备包含植物保护产品的小颗粒、覆盖膜、隧道膜和捆绑材料。

本发明还涉及将所述合金用于生产瓶子的用途。

最后，本发明涉及本发明的合金在医疗领域的用途，特别是用于生产可吸收缝合线以及作为治疗活性分子载体。优选地，这些合金以含有治疗活性分子的纳米粒子形式使用。本领域技术人员具有能够从根据本发明的合金制备纳米粒子的技术常识。

在治疗中使用本发明的合金具有优势，显而易见地体现在几个方面。首先，纳米颗粒的降解使得可将药物逐渐递送到靶细胞。此外，它可以限制在某些组织(如诸如肝和肾之类的解毒器官)中治疗分子积聚相关的副作用。最后，这种纳米颗粒的可生物降解性限制了潜在的环境影响，这与纳米粒子通过病人的自然分泌物而铺展到外部介质有关。

根据本发明制备合金的方法能够获得具有适合所需用途的降解性的合金。因此，在治疗的上下文中，本领域的技术人员将能够使此方法适于获得一种合金，它不会在治疗的病人的某些器官中引起任何纳米粒子的积聚，从而能够避免可能与所述纳米粒子的存在相关的副作用。

本领域技术人员还需要使治疗活性分子适合作为待治疗的病理学类型和纳米粒子本身性质的函数被本发明的纳米颗粒包封。具体而言，取决于所述纳米粒子的物化性质(特别是它的重量、尺寸、亲脂性、亲水性和离子化的状态)，它可能或可能无法跨越跨膜屏障。因此，对于给予了由本发明合金组成的纳米粒子的个体而言，纳米粒子的性质会影响治疗活性分子在个体内的分布。

实施例:

实施例1:制备根据本发明的聚合物/酶合金

材料和方法

1.在挤出步骤期间酶包含到起始材料中

在“挤出”步骤期间将酶引入起始的可生物降解聚合物。

挤出步骤在Clextral牌BC21双螺杆型挤出机(电机功率9kW，最大螺杆速度600rpm，最大电流18.9A)上进行。螺杆直径d为25mm，两螺杆间距离为21mm。护套的长度为600mm，即L/d的比率为24。

挤出步骤分5步：

1.引入可生物降解的聚合物/酶混合物，

2.所述混合物通过挤出机，

3.通过直径为3米的圆形模具输出杆状物，

4.在冷水浴中冷却3米长的杆状物，后续用脉冲冷空气“干燥”，

5.由装有旋转刀片的系统切割成规则的颗粒状。

材料配方随可生物降解聚合物/酶比例的函数而变化。在本专利申请的实施例中，结果相应于材料中2％(m/m)酶的比例。

由挤出获得的颗粒在50℃回转炉中干燥15小时(装配有具有循环油的夹套的旋转混合器)以去除由于经过水箱而残留的水分。通过装配有红外电阻的湿度分析仪在干燥过程中监测水分含量。

2)制备试样-注射成型

为了评估所得聚合物/酶合金的机械性能以及其降解能力，被称为“试样”的标准形式的成型件通过注射成型制得。

注射成型是用于赋予颗粒以三维成品形状的一个批量过程。其原理在于，在进料护套中加热塑料材料，以将熔融状态的材料提供给检测和压缩区，以便通过活塞将其注射到模具中。成型件在模具中冷却，然后喷出。

所用注射压机为Arburg牌，Allrounder 1000-420C-250型。

注射成型试样符合标准ISO 3167中的类型1。

结果

1.选择液态介质中的酶

为了实施本制备方法，应该识别能够降解可生物降解聚合物的酶，从而确定将在挤出步骤中使用的合适的酶/材料“配对物”。

我们开发了两个简单的测试来识别目标酶。这些测试分别在试样中纯材料或颗粒状纯材料的样品上进行。

下面提出的测试在聚己内酯或CAPA(Perstorp；编号6506；50 000g/mol)的试样或颗粒上进行。本发明人评价了两种以其降解CAPA的能力而已知的商业酶：来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS和来自荧光假单胞菌的脂肪酶AK(Amano，日本)。

a)试样的测试

置于生物降解条件下的未加工聚合物试样来自CAPA颗粒的注射成型。全部生物降解测试在温度调节为30℃的炉子内进行。

本研究所提出的测试在营养液中进行，根据标准ISO 14852:1999规定营养液的组成。或者，降解也可以在Fontaine Cristalline牌水中评估，即一种具有恒定组成的矿物质水，从而可以具有相同的介质条件。

在这些测试中，试样保持完全浸泡在所述溶液中，所述溶液中选择性地以最终浓度为200mg/L添加酶。

在介质中经过一段规定时间后，通过计算样品质量的损失来检测材料的降解。

本方法使用一系列13个相同的试样，其中5个试样用炉子在103℃处理48小时以确定样品中水的损失量。这一步使得可以对置于生物降解中的样品的质量损失的计算进行校正。其它8个试样浸泡在降解介质中并置于温度调节为30℃的炉子内。在规定时间之后将试样取出以监测材料随时间推移的行为。每次取出试样后，试样在103℃炉子内干燥48小时并称重。

根据下述公式计算质量的损失：

在室温和103℃之间

其中m_i:试样的初始质量

m_f:试样的最终质量

结果显示来自荧光假单胞菌的脂肪酶的存在不能提高聚己内酯的可生物降解性，因为降解程度基本上与不加酶时的一样。

另一方面，对于来自洋葱假单胞菌的脂肪酶，在与介质接触7天后第一组取出的试样中，可以观察到显著的差异。具体而言，获得了5％的降解率，然而经过相同时间没有添加酶的试样只损失了0.2％的质量。

然而，很快观察到一个稳定的阶段，生物降解率不再改变。所以决定改变添加酶的营养液(还是在200mg/L的营养液)。在降解开始44天后进行这个改变。这使得可以观察到70天内，降解重新达到约9％。

b)颗粒的测试

本方法的优点是能够在小反应体积进行，使得试验较不昂贵。此外，能够同时测试几个酶和几个浓度。最后，使用高浓度酶的可能性使得可以在短时间内获得高的降解率。

在该试验中，CAPA颗粒(近似体积：50mm³；近似质量：40mg)在1.9ml的缓冲液(25mM磷酸盐缓冲液,pH 7,叠氮化钠2g/L)中孵育，选择性地以最终浓度为20mg/ml添加来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS。在28℃进行孵育。规则的时间间隔后，取出颗粒，用水彻底冲洗，然后在28℃孵育24小时用以干燥。测定质量并与初始质量(即在反应介质中孵育之前)相比。

结果显示在所述条件下，使用来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS，CAPA的降解率超过50％，这证实了用所述试样获得的结果。

本实验方案可以用来确定随后加入给定的聚合物中的最相关的酶。

此外，该试验也使得可以识别某些具有优化降解活性的性能的“添加剂”。这类添加剂可以与酶一起在挤出步骤中加入材料中以加快其降解。

2.评估酶的耐热性以确定最佳挤出温度

在挤出步骤中，聚合物/酶混合物要经受相应于聚合物熔点的高温。在CAPA的情形，我们将温度设定在80℃。根据供应商的技术表，来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS的粉末形式在100℃保持稳定达几个小时。

然而，这些数据指酶的脂肪酶活性，并没有评估其CAPA解聚酶活性的耐热性。

因此，我们对上述颗粒进行试验，但是在80℃处理酶溶液(20mg/ml的酶)5分钟。所选时间和温度与挤出步骤中遇到的热条件接近。

结果显示该处理对酶的CAPA解聚酶活性影响小。具体而言，本发明人表明7天时仅有10％的活性损失。因此，来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS是制备CAPA/酶合金的极好的候选物。

3.在聚己内酯的实施过程中，引入来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS

本发明人进行聚己内酯的挤出时，引入所述酶。为此，将粉末形式的聚合物和粉末形式的酶的混合物置于计量装置上。

这里提出的试验中，调整两个计量装置的流量以获得酶占材料的百分比为2％(m/m)。也制备了不含酶的配方(对照)(表1)。

表1:本研究中制备的配方

挤出在80℃进行,以便具有高于CAPA的熔点(60℃)的温度，但不是很高以避免使酶变性的风险。

挤出的精确参数在表2列出，两组配方在相同条件下进行。

表2:本研究中进行的挤出的参数

表2中引用的术语“扭矩”对应于相对电机强度并代表由挤出机向挤出材料提供的机械能。

所得颗粒在回转炉内干燥以去除残留水分。

两组配方然后进行注射成型步骤以获得规范化试样。两种材料的注射成型条件相同。

表3显示本研究中使用的注射压机的设定

表3:Arburg 100/420C/250注射压机的注射成型参数

在Cristalline矿物质水中评估降解功效。简而言之，对于每组配方，将四个规范化样品(事先测定其质量)浸泡在水箱中(Cristalline参照矿物质水)。水箱然后置于温度调节为32℃并通风的室中。

在1、2、3和6个月后取出试样并称重(在103℃的炉子内处理48小时)。通过如前所述计算的质量损失的方式确定材料的降解性。

所得结果显示，当将酶引入材料时，试样在水中孵育102天或以上后，CAPA的完全生物降解，这表明酶承受了在挤出和注射成型步骤中所施加的热处理。

本发明人因此表明酶能够有效地从挤出阶段将酶引入聚合物中，同时保持聚合物的降解性能。

这种方法因此构成了一种容易实施并能方便地将其采用于其它用于控制材料在自然介质内降解的聚合物/酶配对物的简单的方法。

实施例2:本发明合金的表征

本发明人比较了单独的CAPA、与植物基进料混合的CAPA以及根据本发明方法制备的由CAPA和来自洋葱假单胞菌的脂肪酶组成的合金的机械性能。

材料和方法

1.合金的制备

使用下面的起始材料制备CAPA/来自洋葱假单胞菌的脂肪酶合金：

表4:用于合金的配方的起始材料

挤出粒化步骤

挤出步骤使用Clextral BC21共旋转双螺杆挤出机分5步进行

-通过重量计量装置和体积计量装置加入设想比例的各种元素；

-在压力下将材料熔化、揉捏、脱气、混合并放置在挤出机的连续部分；

-通过直径为3米的圆形模具输出杆状物；

-在冷水箱中冷却3米长的杆状物，然后用脉冲冷空气“干燥”，

-通过装配有旋转刀片的系统切割成规则颗粒形式。

制备了四组配方(百分比对应质量百分比)：

-100％CAPA；

-98％CAPA+2％脂肪酶；

-80％CAPA+20％小麦；

-55％CAPA+45％小麦。

植物进料(小麦粉)的添加是提高聚合物降解程度的标准替代方法。具体而言，最大降解程度对应于植物基进料的降解，聚合物作为粘合剂事实上并不被降解(见下文)。

通过挤出获得的颗粒在40℃回转炉中干燥12小时以去除由于经过水箱而残留的水分。干燥的颗粒接着能被注射成型和表征。

注射成型步骤

注射成型步骤能够将挤出获得的颗粒转化成表征试样。注射成型的原理在于在护套中加热塑料材料以使材料熔化(塑化阶段)，并在压力下通过活塞注射到模具中。使材料在模具中固化并部分冷却，然后喷出。所用压机为Arburg牌，Allrounder 1000-420C-250型的压机。

注射成型试样符合标准ISO 3167中的类型1。

注射成型获得的“97％CAPA+2％脂肪酶”试样在表征前经过后处理，包括在一个置于封闭纸箱内的拉链锁密封的袋子中室温下储存一个月，这一步骤的目的是从机械性能和降解能力的角度评估储存对材料稳定性的影响。

2.机械性能的测定

拉伸测试

根据国际标准ISO/R 527(拉伸性能的测定)中所述的建议测定拉伸性能。在恰当限定的关于温度、湿度和钳口的分离速度的条件下进行这些测试。

拉伸测试是使具有初始横截面So和有用长度Lo的试样伸长。将试样的两端安装到钳口里。钳口中的可移动的一个与按线性速度移动的驱动系统相连。使用电子力传感器(10kN)进行功的测量。

测试中注意三点信息：

-最大拉伸应力(Cmax TR；MPa)，

-断裂伸长率(％),

-拉伸杨氏模量(MPa).

如标准所表明的，对每批材料的五个试样进行测试，显示的结果是这五个测定的平均值。位移速度设定为50mm/min并计算拉伸模量，数值在最大应力值的10％到50％之间。使用Zwick销售的拉伸测试机。

夏比冲击

本方法使得可以研究受到冲击力的规定试样的行为以估计试样的脆弱性或强度。对于这些测试，本发明人使用了前面描述过的类型1的无缺口试样。

使用的装置是Zwick牌，能量为15焦耳的冲击摆。该单元由记录测量数值并分析的软件驱动。在测试过程中，试样在支撑物前水平放置并用冲击摆击打其中心。夏比冲击阻力对应于试样断裂时吸收的能量与测试前横截面的比(弹力)。

3.流变性能：熔体流动速率(MFR)

标准ISO 1133规定了在规定温度和压力条件下，测定热塑性塑料的熔体流动速率(或MFR)的方法。这个测试使得可以测定所测试聚合物的级别以及给出对于给定温度聚合物流过模具的能力(一个注射成型的重要参数)的相关信息。

所用设备是与精密天平相连并由能够测定MFR(用g/10分钟表示)的特定软件驱动的Zwick牌挤出塑性计。

测试过程中，使用与活塞相连的进料斗使在立筒内加热的混合物通过模具而挤出。以规则的时间间隔切割五个挤出物，回收并称重。设定的参数为筒温、进料的重量和两次切割之间的时间。

4.水降解测试

对于每个配方，将四个规范化试样(预先测定103℃干燥的质量)浸泡在水箱(Leclerc，参照Cristalline的矿物质水，)内。水箱放置在温度调节为32℃并通风的室内。在1、2、3和4个月后取出试样并称重(在103℃炉子内处理48小时后)。通过按下面方式计算质量损失确定材料的降解能力。

损失(％)＝总质量损失—水分损失103℃)x 100

结果

1.机械和流变性能

所得结果示于下表：

表5：材料的性能

此表格表明酶的加入没有改进在此所测CAPA的机械性能，也就是弹性、MFR或拉伸参数组。这与由55％CAPA+45％小麦组成的聚合物是非常显著的对比，后者与单独CAPA相比，所有机械性能都降低了。80％CAPA+20％小麦混合物本身可以保留与单独CAPA相似的性能。

因此，本发明的合金非常适合提高CAPA的降解，同时保留其性能。

2.在水性介质中的降解

结果表明当浸泡在水环境中时，单独的CAPA不降解。如果添加20％的植物基进料能够提高该合金的降解，然而所达到的最大降解率小于20％。如所表明的，降解对应于小麦粉的降解，而材料本身保持不变。

生物降解的改善直接与合金中植物基进料的百分比增加相关，这必然导致机械性能的损伤。

结果也表明添加酶比添加植物基进料更加有利，因为它诱导了CAPA的降解(水中3个月后约70％)，同时保留纯材料的机械性能。

本发明人已成功显示所得组合物具有比用植物基进料更好的降解性，同时保留了聚合物的机械性能。

最后，将聚合物98％CAPA+2％脂肪酶储存在黑暗中和密封袋中既不损伤其机械性能也不损伤其降解能力(选择性地后处理后，比较聚合物98％CAPA+2％脂肪酶的行为)。当不在溶液中时，本发明的合金稳定且不降解，因此适合储存。

总之，整个结果表明根据本发明的聚合物/酶的制备方法是用于开发短寿命材料的一种特别有吸引力的工业解决方案，同时减少对环境的负面影响，这对于残渣散播到自然介质中是固有的。

实施例3.温度对聚己内酯(CAPA)生物降解的影响

为了说明聚己内酯的转化温度对聚己内酯的生物降解没有影响，在170℃挤出聚己内酯，并评价其生物降解性。

3.1.聚己内酯在170℃的挤出粒化步骤

如实施例1所限定的进行挤出步骤(见材料和方法部分1)，除了本实施例中的挤出温度是170℃以及配方由100％CAPA(没有酶)组成以外。挤出参数示于表6。

表6.本研究中进行的挤出的参数

3.2.注射成型

100％CAPA(cf.100m％CAPA 6506)颗粒进行注射成型步骤以获得规范化试样。如实施例1所述进行注射成型步骤。

表7示出本研究中所使用的注射压机的设定。

表7.Arburg 100/420C/250压机的注射成型参数

3.3.降解性的测定

在30℃水中降解：监测质量损失

在Cristalline矿物质水中评估降解性。四个规范化样品(事先测定质量)浸泡在水箱中。然后将水箱置于温度调节为32℃并通风的室内。

在15天、1、2和3个月后取出试样并称重(在103℃的炉子内处理48小时后)。通过如实施例1所述计算质量损失的方式来确定材料的降解能力。

对于配方100m％CAPA 6506(参见实施例2.),配方100m％CAPA 6506-170制备的试样的“质量损失”2个月后没有显示任何降解。监测32℃水中的降解可以说明当CAPA在80℃到170℃的温度挤出时，单独的CAPA在水中不会随时间推移而降解。

实施例4.在100℃将2％来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS引入98％CAPA中

4.1.包含酶

本发明人对引入所述酶的聚己内酯进行了挤出。为此，98％(质量)的聚合物和2％(质量)的酶混合物置于计量装置中。混合物中所用的量示于下表(见表8)。

表8.本研究中制备的配方

4.1.a.挤出

挤出在100℃进行。如实施例1所述完成挤出步骤。(参见材料和方法部分1)。

挤出参数示于表9。

表9.本研究中进行的挤出的参数

4.2.注射成型

配方进行注射成型步骤以获得规范化试样。本研究中注射成型压机的设置与实施例3相同(参见表7)。

4.3.生物降解测定

通过在水中降解评估降解功效。

在30℃水中降解：监测质量损失

如实施例3(参见3.3部分)在Cristalline矿物质水中评估降解。

在15天、1、2和3个月后取出试样并称重(在103℃炉子内处理48小时后)。通过如实施例1所述计算质量损失的方式来测定材料的降解能力。

所得结果显示2个月后的质量损失为54％的生物降解能力。这说明酶经受了在挤出和注射成型步骤中承受的热处理。

本发明人因此表明能够将酶有效地从100℃的挤出阶段引入聚合物中，同时保持聚合物的降解性能。

实施例5.在120℃将2％脂肪酶PS引入98％CAPA

5.1.包含酶

本发明人对引入所述酶的聚己内酯进行了挤出。为此，聚合物置于一个计量装置中，酶置于另一个计量装置中，两者都是粉末形式。

这里所示的试验中，设定两个计量装置的流速以获得酶占材料的百分比为2％(m/m)(参见表10)。

表10.本研究中制备的配方

5.1.a.挤出

通过在120℃挤出制备聚合物与酶之间的合金。如实施例1所述完成挤出步骤(参见材料和方法部分1)。

挤出参数示于表11。

表11.本研究中进行的挤出的参数

5.2.注射成型

配方进行注射成型以获得规范化试样。注射成型的条件与实施例3的相同(参见表7)。

5.3.生物降解测定

通过在水中降解评估降解功效。

在30℃水中降解：监测质量损失

如实施例3所述的相同条件下在水中评估降解。

所得结果显示2个月后质量损失为27.5％的降解能力。这说明酶经受了在挤出和注射成型步骤中承受的热处理。

本发明人因此表明能够将酶有效地从120℃的挤出阶段引入聚合物中，同时保持聚合物的降解性能。

实施例6.在140℃将2％脂肪酶PS引入98％CAPA

这里示出的试验中，设定两个计量装置的流速以获得酶占材料的百分比为2％(m/m)(见表12)。

表12.本研究中制备的配方

6.1.a.挤出

挤出参数示于表13。

表13.本研究中进行的挤出的参数

6.2.注射成型

配方进行注射成型以获得规范化试样。本研究中所用的注射成型压机的设置与实施例3，3.2部分中所用的相同(参见表7)。

6.3.生物降解测定

通过在水中降解评估降解功效。

在30℃水中降解：监测质量损失

如实施例3(参见3.3部分)在Cristalline矿物质水中评估降解。

在15天、1、2和3个月后取出试样并称重(在103℃炉子内处理48小时后)。通过如实施例1所述计算质量损失的方式来测定材料的降解能力(参见结论1.a部分)。

所得结果显示2个月后质量损失为4.5％的降解力。这说明酶经受了在挤出和注射成型步骤中承受的热处理。

本发明人因此表明能够将酶有效地从140℃的挤出阶段引入聚合物中，同时保持聚合物的降解性能。

结论是，本发明人已举例说明本发明的制备方法，能够获得在各种挤出温度下降解的合金，特别是80℃、100℃、120℃和140℃。

实施例7:引入脂肪酶的方法

为了说明通过挤出包含脂肪酶对相应材料的生物降解的重要性，进行了各种在聚己内酯中引入脂肪酶的方法。

1.通过挤出引入脂肪酶(测试7a)

如实施例1所述的条件下(参见材料和方法部分)，在65℃挤出98m％聚己内酯(CAPA 6506)和2m％脂肪酶PS的混合物

挤出参数示于表14。

表14.本研究中进行的挤出的参数

配方进行注射成型步骤以获得规范化试样。注射成型压机的设置与实施例3中所用的相同(参见表7)。

根据实施例3所述方法，通过在水中降解的方式评估所述注射成型件的降解功效。

2.通过在注射成型的聚己内酯件表面喷雾来引入脂肪酶(测试7b)

非挤出聚己内酯CAPA6506进行注射成型步骤以获得规范化试样。注射成型压机的设置与实施例3中所用的相同(参见表7)。

然后将脂肪酶PS的水溶液喷到注射成型的聚己内酯件表面以获得相当于98m％聚己内酯和2m％脂肪酶的混合物。

根据实施例3所述方法，通过在水中降解的方式评估所述注射成型件降解功效。

3.在水中降解的测试中所用水中引入脂肪酶(测试7c)

根据实施例3所述方法，通过在接种有脂肪酶PS的水中降解的方式评估所述注射成型件编号7a的降解功效。加入的脂肪酶的量相当于98m％聚己内酯和2m％脂肪酶PS的混合物。

配方7a、7b和7c的质量损失整理于下表：

表15.样品7a、7b和7c的水中的质量损失

这些结果显示当脂肪酶通过喷雾或引入降解溶液中时，降解比脂肪酶包含在合金中时要明显低。

换句话说，本发明人已显示挤出步骤可以比脂肪酶的分散/溶液步骤获得具有更好降解性的合金。

实施例8:其他测试

用于其他测试的起始材料如下：

-聚己内酯CAPA 6506；

-Rettenmaier提供的木粉Arbocel C320；和

-AMO提供的La Dorée小麦粉。

在实施例1(参见材料方法部分)所述的条件下，通过挤出制备聚己内酯、脂肪酶PS和/或植物基进料(小麦粉或木粉)的多种合金：

表16.本研究中通过挤出获得的多种合金的组成

挤出参数示于表17：

表17.本研究的挤出参数

所得多种合金进行注射成型步骤以获得规范化试样。注射成型压机的设置与实施例3中所用的相同(参见表7)。

根据实施例3所述方法，通过在水中降解的方式评估所述注射成型件编号7a、8、9、10和11的降解功效。这些功效示于下表：

表18.样品7a、8、9、10和11的质量损失

本发明人因此显示为了获得高的生物降解性，添加酶比添加植物基进料明显更有利。

Claims

1.一种制备聚合物/生物实体合金的方法，其包括

-选择来自石化工业聚合物和生物源聚合物的聚合物，其中所述聚合物选自聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(对苯二甲酸丙二醇酯)、聚(己二酸-对苯二甲酸-丁二醇酯)、聚乙烯、聚丙烯及其混合物；

-选择降解所述聚合物的生物实体，所述生物实体选自降解所述聚合物的酶和微生物，

其中所述合金在高于室温的温度T下用所述生物实体挤出所述聚合物的过程中获得，在该温度下所述聚合物是部分或全部融化的状态且其中所述生物实体能够降解所述合金中的所述聚合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物和所述生物实体在挤出前混合。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物和所述生物实体在高于室温的温度T下进行的挤出过程中混合。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述温度T在所述聚合物的玻璃体转化温度和熔点之间。

5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述温度T是所述聚合物的熔点。

6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于生物实体/聚合物的重量比在约0.1％至约10％之间。

7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述生物实体是耐热酶。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物实体选自来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS、来自荧光假单胞菌的脂肪酶AK、来自南极念珠菌的脂肪酶B、蛋白酶K和C₁-C₆聚羟基链烷酸酯解聚酶以及它们的混合物。

9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述生物实体是热稳定化的酶。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述热稳定化的酶选自封装在由与所述聚合物相同的材料所组成的纳米胶囊中的酶、封装在笼型分子中的酶和聚集在一起的酶。

11.一种制备聚合物/生物实体合金的方法，其包括(i)选择来自石化工业聚合物和生物源聚合物的聚合物，(ii)选择降解(i)所述选择的聚合物的来自酶和微生物的生物实体，和(iii)进行所述聚合物与所述生物实体的挤出以形成所述合金，其中所述生物实体/聚合物的重量比为约1％和5％之间，和所述挤出在所述聚合物为部分或全部为熔融状态的温度下进行。

12.一种能够通过如权利要求1至11中任一项所述的方法制备的聚合物/生物实体合金。

13.一种聚合物/生物实体合金，其特征在于所述生物实体是降解所述聚合物的热稳定化的酶。

14.如权利要求13所述的聚合物/生物实体合金，其中所述热稳定化的酶选自封装在由与所述聚合物相同的材料所组成的纳米胶囊中的酶、封装在笼型分子中的酶和聚集在一起的酶。

15.如权利要求12至14中任一项所述的聚合物/生物实体合金在农业、园艺、包装、建筑修缮、环境、交通、纺织、电子和医药行业的用途。