CN106508758A - 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法 - Google Patents

一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106508758A
CN106508758A CN201610913925.4A CN201610913925A CN106508758A CN 106508758 A CN106508758 A CN 106508758A CN 201610913925 A CN201610913925 A CN 201610913925A CN 106508758 A CN106508758 A CN 106508758A
Authority
CN
China
Prior art keywords
larva
culture
freshwater mussel
vitro culture
hook jie
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610913925.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106508758B (zh
Inventor
闻海波
徐跑
郑金良
马学艳
华丹
顾若波
邹军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGYIN SHENGANG SANXIAN CULTIVATION CO Ltd
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
JIANGYIN SHENGANG SANXIAN CULTIVATION CO Ltd
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGYIN SHENGANG SANXIAN CULTIVATION CO Ltd, Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical JIANGYIN SHENGANG SANXIAN CULTIVATION CO Ltd
Priority to CN201610913925.4A priority Critical patent/CN106508758B/zh
Publication of CN106508758A publication Critical patent/CN106508758A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106508758B publication Critical patent/CN106508758B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，属于淡水蚌类繁育技术领域。其包括选择成熟且活力好的紫黑翼蚌钩介幼虫，通过悬浮快速沉降法清洗幼虫，制备特定鱼血浆，配置特定幼虫体外培养液配方，在无二氧化碳的控温培养条件下实现钩介幼虫的变态发育，最后采用自来水逐步稀释替换培养液，唤醒变态稚蚌。本发明采用改进的体外培养方法和特定培养液配方首次实现了蚌类斧头型钩介幼虫的非寄生变态发育，在没有特定寄主鱼的限制条件下，突破了我国紫黑翼蚌人工繁育关键技术瓶颈，不仅使蚌类钩介幼虫体外培养技术和理论得到了完善和提高，对蚌类人工繁育及增殖保护具有重要应用价值。

Description

一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法
技术领域
本发明涉及一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，属于淡水蚌类繁育技术领域。
背景技术
大多数蚌类钩介幼虫需要短暂地寄生在特定的鱼类或蝾螈上，才能完成变态发育从而实现自然繁衍。自Isom & Hudson（1982）创建钩介幼虫体外培养技术以来，在幼虫清洗、抗生素使用、血浆（或血清）种类及换液频率等方面不断改进和完善，形成了经典的体外培养技术，为世界蚌类人工繁育保护与变态发育基础研究提供了重要技术途径。与寄主鱼寄生方法相比，钩介幼虫体外培养技术具有培养数量大、成本低、繁殖成功率高等优势，尤其对于缺乏寄主鱼及信息的蚌类人工繁育具有重要应用价值。
紫黑翼蚌（Potamilus alatus），原产于北美洲，属大型淡水贝类，成蚌个体达20cm以上，珍珠层厚实，呈紫黑色，光泽好，在自然水域中能产生天然的紫黑珍珠，进一步的人工育珠试验结果表明：紫黑翼蚌具有培育高值紫黑珍珠的良好前景。为发展紫黑珍珠养殖，我国2012年从美国引进一批紫黑翼蚌幼蚌在国内开展人工驯养，通过2年多驯养研究，首次人工培育出一批亲蚌，初步建立了我国紫黑翼蚌人工繁育基础种群。近百年的研究结果表明：紫黑翼蚌钩介幼虫对寄主鱼具有高度选择性，淡水石首鱼是目前发现唯一的特定寄主鱼。由于国内没有淡水石首鱼，严重制约了我国紫黑翼蚌苗种的规模化繁育。因此，体外培养技术成为实现紫黑翼蚌变态发育的首选技术途径。
经典的蚌类钩介幼虫体外培养采用M199或MEM为基础培养液，需要在1～5%的二氧化碳条件下调节维持稳定的pH，实现钩介幼虫的非寄生变态发育。蚌类钩介幼虫主要分为有钩型、无钩型和斧头型3种类型。目前，通过经典的体外培养方法已实现了41种蚌类钩介幼虫的非寄生变态发育，这些幼虫都为无钩或有钩型，具有较大的双壳，在变态发育过程中仅内脏完成组织分化而外壳几乎不生长。紫黑翼蚌钩介幼虫为斧头型，双壳无法完全闭合，外壳与内脏器官需同时生长才能完成变态发育，且变态发育周期较长。目前，以经典的体外培养技术和理论，对于紫黑翼蚌这类内脏和外壳同时生长发育类型的钩介幼虫体外培养一直未能取得突破。因此，在我国没有特定寄主鱼的重大限制条件下，研制出适宜于紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的配方及方法是突破我国紫黑翼蚌人工繁育的重要技术途径之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法。
按照本发明提供的技术方案，一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，步骤为：
（1）选种：检查紫黑翼蚌孕育蚌育儿囊发育情况，选择成熟且活力良好钩介幼虫用于体外培养。钩介幼虫成熟和活力鉴定标准：幼虫为淡黄色、黄色或褐色，取少量显微镜下检查，外膜破裂，双壳做5～12次/min的开合运动，加入L-15培养液双壳立即并一直保持关闭状态。
（2）幼虫获取：采用18号注射器从孕育蚌育儿囊后端中部垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃间隔中的钩介幼虫冲出，流入500ml烧杯中，用吸管吹打使幼虫分散，加入300～500ml L-15培养液清洗幼虫，通过悬浮快速沉降3～5次，完全去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。
（3）特定鱼血浆制备：取500～800g健康瓜子斑，采用10ml无菌注射器，用肝素钠溶液润湿注射器，尾静脉无菌采血，4℃条件下3000转/min离心10min，取上清液0.45µm无菌膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌膜过滤2次。
（4）混合抗生素溶液配置：每100ml无菌纯水溶液中加入50～100 µg羧苄青霉素二钠、50～100 µg硫酸庆大霉素、50～100 µg发霉素和2.5～5µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。
（5）幼虫培养液的配置：按L-15基础培养液：步骤（3）制备的特定鱼血浆：步骤（4）制备的混合抗生素溶液体积比2:0.8～1.5:0.5取液混合，配置得到幼虫培养液。
（6）培养：在无菌操作台中，将步骤（5）制备所得3.5mL幼虫培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量控制在100～400只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在23～25℃；每3d更换一次步骤（5）制备所得新鲜的幼虫培养液。
在培养20～24d后幼虫完成变态发育，每小时向培养皿中按培养液与充分曝气的自来水体积比1:1逐步加入充分曝气的自来水，水温保持在23～25℃；6～8h内稀释替换至自来水含量大于95%，幼虫变态率可达到90%以上，即完成培养。
本发明的有益效果：
1、采用L-15作为基础培养液，在培养箱中无需提供二氧化碳来维持培养液的pH，降低了对培养设施的要求，简化了培养方法，减少了换液频率，显著降低了培养成本，使蚌类钩介幼虫体外培养技术和理论得到了进一步完善和提高。
2、采用特定鱼类血浆和适宜的抗生素浓度，首次实现了斧头型钩介幼虫的非寄生变态发育，突破了我国紫黑翼蚌人工繁育关键技术，对蚌类人工繁育和增殖保护具有重要应用价值。
具体实施方式
以下实施例中L-15培养液购自生工生物工程股份有限公司。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
（1）选种：2014年11月21日，取N1紫黑翼蚌孕育蚌，检查育儿囊内幼虫为黄色，幼虫能做开合运动，加L-15培养液后幼虫双壳立即并一直保持闭合。
（2）幼虫获取：用18号注射器从育儿囊后端垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃丝中成熟钩介幼虫冲出，流入500mL烧杯中，用吸管吹打幼虫使分散，加入400mL L-15培养液，并通过5次快速悬浮沉降，尽量去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。
（3）特定鱼血浆的制备：取体重500～600g健康的斜带髭鲷，采用10mL注射器尾静脉无菌采集血液，每尾可采集8～10mL，4℃条件下3000r/min离心10min，取上清液0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌过滤膜过滤2次。
（4）混合抗生素溶液配置：每100mL无菌纯水溶液中加入50 µg羧苄青霉素二钠、50µg硫酸庆大霉素、50µg发霉素和2.5µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。
（5）幼虫培养液的配置：按体积比2:0.8:0.5比例混合L-15基础培养液、特定鱼血浆及混合抗生素溶液，配置幼虫培养液。
（6）培养：在无菌操作台中，将上述3.5mL混合培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量300±10只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在24 ± 0.5℃；每3d更换一次新鲜的培养液。
在培养20d后，向培养皿逐步加入充分爆气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃，8h内稀释替换直至自来水含量大于95%，幼虫变态率为92.9 ± 3.1%。
实施例2
（1）选种：2014年12月06日，取N23紫黑翼蚌孕育蚌，检查育儿囊内幼虫为黄色，幼虫能做开合运动，加L-15培养液后幼虫双壳立即并一直保持闭合。
（2）幼虫获取：用18号注射器从育儿囊后端垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃丝中成熟钩介幼虫冲出，流入500mL烧杯中，用吸管吹打幼虫使分散，加入500mL L-15培养液，并通过4次快速悬浮沉降，尽量去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。
（3）特定鱼血浆的制备：取体重500～600g 健康的斜带髭鲷，采用10mL注射器尾静脉无菌采集血液，每尾可采集8～10mL，4℃条件下2000转/min离心20min，取上清液0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌过滤膜过滤2次。
（4）混合抗生素溶液配置：每100mL无菌纯水溶液中加入100µg羧苄青霉素二钠、100µg硫酸庆大霉素、100µg发霉素和5µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。
（5）幼虫培养液的配置：按体积比2:1:0.5比例混合L-15基础培养液、特定鱼血浆及混合抗生素溶液，配置幼虫培养液。
（6）培养：在无菌操作台中，将上述3.5mL混合培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量390±10只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在24 ± 0.5℃；每3d更换一次新鲜的培养液。
在培养24d后，向培养皿逐步加入充分爆气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃，8h内稀释替换直至全部为自来水，幼虫变态率在90.6 ± 3.7%。
实施例3
（1）选种：2015年10月21日，取N12紫黑翼蚌孕育蚌，检查育儿囊内幼虫为黄色，幼虫能做开合运动，加L-15培养液后幼虫双壳立即并一直保持闭合。
（2）幼虫获取：用18号注射器从育儿囊后端垂直刺入，将L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃丝中成熟钩介幼虫冲出，流入500mL烧杯中，用吸管吹打幼虫使分散，加入400mL L-15培养液，并通过5次快速悬浮沉降，尽量去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物等。
（3）特定鱼血浆的制备：取体重650～800g 健康的斜带髭鲷，采用10mL注射器尾静脉无菌采集血液，每尾可采集10～12mL，4℃条件下2500r/min离心15min，取上清液0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前0.22µm无菌过滤膜过滤2次。
（4）混合抗生素溶液配置：每100mL无菌纯水溶液中加入75µg羧苄青霉素二钠、75µg硫酸庆大霉素、75µg发霉素和3µg两性霉素B，充分溶液后0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用。
（5）幼虫培养液的配置：按体积比2:1.5:0.5比例混合L-15基础培养液、特定鱼血浆及混合抗生素溶液，配置幼虫培养液。
（6）培养：在无菌操作台中，将上述3.5mL混合培养液加入无菌培养皿中，培养皿直径为6cm，加入清洗好的钩介幼虫，数量250 ± 10只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在24 ± 0.5℃；每3d更换一次新鲜的培养液。
在培养20d后，向培养皿逐步加入充分爆气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃，6h内稀释替换直至全部为自来水，幼虫变态率在95.2±2.4%。

Claims (8)

1.一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是步骤为：
（1）选种：检查紫黑翼蚌孕育蚌育儿囊发育情况，选择成熟且活力良好钩介幼虫用于体外培养；
（2）幼虫获取：采用注射器从孕育蚌育儿囊后端中部垂直刺入，将5～10mL L-15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃间隔中的钩介幼虫冲出，流入容器中，用吸管吹打使幼虫分散；再加入300～500mL L-15培养液清洗幼虫，通过悬浮快速沉降3～5次，完全去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物；
（3）特定鱼血浆的制备：取500～800g健康的斜带髭鲷，采用肝素钠溶液润湿无菌注射器，对斜带髭鲷尾静脉无菌采血，将采得的血样在0～4℃条件下以2000～3000r/min转速离心10～20min；取上清液，用0.45µm无菌过滤膜过滤1次，-80℃冻存，使用前再采用0.22µm无菌过滤膜过滤2次，得到特定鱼血浆；
（4）混合抗生素溶液配置：在每100mL无菌纯水中加入50～100µg羧苄青霉素二钠、50～100µg硫酸庆大霉素、50～100µg发霉素和2.5～5µg两性霉素B，充分溶解后采用0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用；
（5）幼虫培养液的配置：按L-15基础培养液：步骤（3）制备的特定鱼血浆：步骤（4）制备的混合抗生素溶液体积比2:0.8-1.5:0.5取液混合，配置得到幼虫培养液；
（6）培养：在无菌操作台中，将步骤（5）制备所得3.5mL幼虫培养液加入无菌培养皿中，加入清洗好的钩介幼虫，数量控制在100～400只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在23～25℃；每3d更换一次步骤（5）制备所得新鲜的幼虫培养液；
在培养20～24d后幼虫完成变态发育，向培养皿中逐步加入充分曝气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃；6～8h内稀释替换至自来水含量大于95%，即完成培养。
2.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：步骤（1）中所述钩介幼虫成熟和活力鉴定标准：幼虫为淡黄色、黄色或褐色，取少量显微镜下检查，外膜破裂，双壳做5～12次/min的开合运动，加入L-15培养液双壳立即闭合并一直保持闭合状态。
3.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：步骤（2）中采用18号注射器从孕育蚌育儿囊后端中部垂直刺入。
4.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：步骤（3）采用10mL的无菌注射器，采用50～100µL浓度为2800单位/mL的肝素钠溶液润湿无菌注射器。
5.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：步骤（5）中L-15基础培养液：步骤（3）制备的特定鱼血浆：步骤（4）制备的混合抗生素溶液体积比为2:1:0.5。
6.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：步骤（6）中培养皿直径为6cm。
7.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：步骤（6）中每小时向培养皿中按培养液与充分曝气的自来水体积比1:1逐步加入充分曝气的自来水。
8.如权利要求1所述紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是：完成培养后，幼虫变态率在90%以上。
CN201610913925.4A 2016-10-20 2016-10-20 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法 Active CN106508758B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610913925.4A CN106508758B (zh) 2016-10-20 2016-10-20 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610913925.4A CN106508758B (zh) 2016-10-20 2016-10-20 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106508758A true CN106508758A (zh) 2017-03-22
CN106508758B CN106508758B (zh) 2019-05-03

Family

ID=58332668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610913925.4A Active CN106508758B (zh) 2016-10-20 2016-10-20 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106508758B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112616735A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 安徽水韵环保股份有限公司 一种洞穴丽蚌的人工繁育技术

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103766269A (zh) * 2014-01-21 2014-05-07 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 紫黑翼蚌早期幼蚌的双循环养殖系统
CN104365519A (zh) * 2014-12-01 2015-02-25 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103766269A (zh) * 2014-01-21 2014-05-07 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 紫黑翼蚌早期幼蚌的双循环养殖系统
CN104365519A (zh) * 2014-12-01 2015-02-25 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
闻海波等: "三角帆蚌钩介幼虫体外培养及变态稚贝的形态变化", 《武汉大学学报（理学版）》 *
闻海波等: "三角帆蚌钩介幼虫在两种寄主鱼上的寄生效果及其对寄主鱼血浆生化指标的影响", 《动物学杂志》 *
马学艳等: "温度对紫黑翼蚌耗氧率和排氨率及其昼夜变化的影响", 《上海海洋大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112616735A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 安徽水韵环保股份有限公司 一种洞穴丽蚌的人工繁育技术

Also Published As

Publication number Publication date
CN106508758B (zh) 2019-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101491228B (zh) 一种培育海水无核珍珠的方法
CN101979518B (zh) 一种制备伪狂犬病病毒的方法
CN103667187B (zh) 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法
CN101491229B (zh) 珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及培养基
CN102154176B (zh) 一种大菱鲆致病菌株及腹水病灭活疫苗
CN102732482B (zh) 骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法
CN103232969B (zh) 一种对虾细胞培养基
CN104293731A (zh) 建鲤原代肝细胞的分离培养方法
CN102988972A (zh) 一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法
CN102002481B (zh) 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法
CN109971700A (zh) 一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法
CN106508758B (zh) 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法
CN108865985A (zh) 一种干细胞源外泌体干预上皮-间质转化的方法
CN104630158A (zh) 低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法
CN105039241B (zh) 中华鳖心脏细胞连续细胞系及其构建方法和超低温冷冻保存方法
CN101451121B (zh) 褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法
CN107129962A (zh) 一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法
CN103484425B (zh) 一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法
CN109295136A (zh) 一种大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法
CN102057883A (zh) 蛭弧菌游泳体菌液在海参育苗中的应用
CN101451122B (zh) 褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法
CN102038714B (zh) 蛭弧菌蛭质体在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用
CN104593334A (zh) 低血清培养pk-15细胞生产猪圆环ⅱ型dbn-sx07株病毒的方法
CN104630159A (zh) 低血清培养st细胞生产猪瘟c株病毒的方法
CN101732709B (zh) 一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant