CN106497818A - 铜绿假单胞菌和菌剂及它们在降解石油和/或石油产品中的应用 - Google Patents

铜绿假单胞菌和菌剂及它们在降解石油和/或石油产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物修复环境领域，具体公开了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其中，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10849，及含有该菌株的菌剂。本发明所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)只需提供无机盐培养基即可在含石油和/或石油产品作为唯一碳源的环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，对石油和/或石油产品有很高的耐受性与降解能力，并且本发明提供的铜绿假单胞菌还能够耐受高盐环境，因此，能够有效地对环境中的石油和/或石油产品进行降解。

Description

铜绿假单胞菌和菌剂及它们在降解石油和/或石油产品中的应用
技术领域
本发明涉及微生物环境修复领域，具体地，涉及一株铜绿假单胞菌，含有该铜绿假单胞菌的菌剂，以及它们在降解石油和/或石油产品中的应用和一种降解石油和/或石油产品的方法。
背景技术
石油污染是耕地污染的重要成因之一。伴随着我国经济的高速发展，石油开采和使用量的日益增加，大量的石油及其加工品进入环境，不可避免地对环境造成了污染。
我国石油企业每年有约7万吨落地原油进入土壤环境，对生态环境造成了严重破坏。石油污染物进入土壤后会破坏土壤结构并影响土壤的通透性，阻碍植物根系的呼吸与吸收功能，甚至导致植物死亡。石油中众多有毒甚至致癌物质可在动植物体内富集，通过食物链危害各类生物以至于人类。因此，这已经成为目前国内外研究的热点。
我国科技部将“油田区域石油污染土壤生态修复技术与示范”列为2007年国家863计划重点项目，项目总投资额1600万元，针对油田区域不同浓度石油污染土壤，开展生态修复技术研究和应用示范。油区的土壤污染通常同时存在石油污染和油田产出水造成的盐污染，这是对于生物修复的最大挑战。一方面，具有高效代谢污染物能力的外源微生物接种入污染土壤中后，其生长和代谢行为不仅受体系水含量、温度、pH、营养物质的匮乏以及土著微生物的竞争作用的影响，而且直接受到环境中盐浓度的影响。
因此，亟需开发出一种能够最低限度受体系环境影响的生物修复石油污染环境的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种便捷有效地且环境友好地对环境中的石油和/或石油产品进行降解的方法。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其中，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10849。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
第三方面，本发明提供了如上所述的铜绿假单胞菌和/或如上所述的菌剂在降解石油和/或石油产品中的应用；其中，所述石油产品包括轻质石油产品和/或重质石油产品。
第四方面，本发明提供了如上所述的铜绿假单胞菌和/或如上所述的菌剂在制备耐盐产品中的应用。
第五方面，本发明提供了一种降解石油和/或石油产品的方法，该方法包括：将如上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，和/或如上所述的菌剂与含有石油和/或石油产品的环境接触，以对环境中的石油和/或石油产品进行降解；其中，所述石油产品包括轻质石油产品和/或重质石油产品。
优选的，该方法还包括，在对所述石油和/或石油产品降解的过程中，向所述含有石油和/或石油产品的环境中添加无机盐。
优选的，所述无机盐选自含氮无机盐、含磷无机盐、镁盐、钙盐和铁盐中的一种或多种。
本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)只需提供无机盐培养基即可在含石油和/或石油产品作为唯一碳源的环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，对石油和/或石油产品有很高的耐受性，并对石油和/或石油产品有很高的降解能力，并且本发明提供的铜绿假单胞菌还能够耐受高盐环境，因此，能够有效地对环境中的石油和/或石油产品进行降解。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的菌株被命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10849。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，其中，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10849。
本发明的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分离自石油污染的土壤样品。
根据本发明，筛选所述铜绿假单胞菌方法可以为本领域常规的筛选新菌种的方法，例如该筛选方法可以包括：将10g采集的石油污染的土壤样品加入到250mL无菌锥形瓶中，用100mL无菌生理盐水充分混匀，静置待固液分离。取上清1mL加入柴油选择性无机盐培养基中，25-35℃和100-150rpm条件下培养。
待培养液浑浊后，吸取1mL培养液注入新的柴油选择性无机盐培养基中，如此转接5次。然后将培养液划线接种于LB固体培养基中，在30-37℃下进行恒温培养3d。挑取单菌落，在LB固体培养基上进行纯化。
取单菌落的液体LB培养液进行接种驯化，驯化方法采取盐度梯度升高法。移液管吸取1mL单菌落培养液接种于100mL盐度为10的柴油选择性无机盐培养基中。25-35℃和100-150rpm条件下摇床培养1周。然后从中取出1mL培养液加入到含有高一盐度梯度的柴油选择性无机盐培养基中，培养1个周期。如此反复培养，盐度逐级增加，直至筛选出的菌株不适应高盐度为止。
经过如上的筛选，得到了本发明的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10849，其16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明提供的铜绿假单胞菌对石油的降解率可高达71％，并可耐受9％的盐浓度。
根据本发明，所述无机盐培养基的组成可以为：以重量计，含有0.8-1.2％的KH2PO4，0.8-1.2％的K2HPO4，1-1.5％的NH4NO3，0.03-0.08％的MgSO4，0.001-0.003％的CaCl2，0.01-0.03％的FeSO4·7H2O，其pH值可以为6.0-7.5。
所述柴油选择性无机盐培养基是在上述的无机盐培养基中添加柴油并使其终浓度为1g/L制备而成的。
本发明提供的铜绿假单胞菌经过培养能够产生大量铜绿假单胞菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述铜绿假单胞菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将铜绿假单胞菌的活菌体接种于LB液体培养基中，并且在好氧条件下，在25-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。
本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以2-5体积％的接种量接种于LB培养基中，在150-240rpm、25-35℃的培养条件下，6h便可进入对数期，18h达到稳定期，菌浓度OD600最高可约达9。
本发明可以进一步分离上述培养液中的铜绿假单胞菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
根据本发明，在所述菌剂中，所述铜绿假单胞菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。
另外，根据预定用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并且添加有相应的不会对所述铜绿假单胞菌的活性造成影响的赋形剂等成分。具体的选择为本领域技术人员所公知，本发明在此不再详细赘述。
第三方面，本发明还提供了如上所述的铜绿假单胞菌和/或如上所述的菌剂在降解石油和/或石油产品中的应用；其中，所述石油产品包括轻质石油产品和/或重质石油产品。
本发明提供的铜绿假单胞菌在只需提供无机盐培养基下即可在含石油和/或石油产品作为唯一碳源的环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，对石油和/或石油产品有很高的耐受性与降解能力。
根据本发明，所述轻质石油产品优选包括石脑油、汽油和柴油中的至少一种。
根据本发明，所述重质石油产品优选包括沥青、蜡和焦炭中的至少一种。
第四方面，本发明还提供了如上所述的铜绿假单胞菌和/或如上所述的菌剂在制备耐盐产品中的应用。
根据本发明，所述耐盐产品例如可以包括通过将本发明提供的铜绿假单胞菌的耐盐基因转入到微生物或植物中所制备的转基因耐盐微生物或转基因耐盐植物。
其中，所述转基因的方法可以为本领域常规的各种方法，本发明在此不再赘述。
所述微生物或植物可以根据具体的需求而进行具体的选择，只要能够赋予所述微生物或植物耐盐性状即可。
第四方面，本发明提供了一种降解石油和/或石油产品的方法，该方法包括：将如上所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和/或如上所述的菌剂与含有石油和/或石油产品的环境接触，以对环境中的石油和/或石油产品进行降解，其中，所述石油产品包括轻质石油产品和/或重质石油产品。
轻质石油产品和重质石油产品的具体选择可以按照如上所述列举的进行选择，为了避免不必要的重复，此处不再进行不必要的赘述，
根据本发明，所述接触优选在所述铜绿假单胞菌能够存活的条件下进行。其中，术语“铜绿假单胞菌能够存活”是指在含有石油和/或石油产品的环境中，至少大约20％，优选至少大于40％，更优选至少大于60％的菌体能够存活。术语“铜绿假单胞菌能够存活的条件”是指至少包括碳源、氮源和无机盐的能够维持菌体生命力的条件。所述碳源例如可以为其降解的石油和/或石油产品。
根据本发明，所述含有石油和/或石油产品污染的环境可以包括任何含有石油和/或石油产品的环境，例如，所述含有石油和/或石油产品污染的环境可以包括含有石油和/或石油产品的土壤或水体。
根据本发明，加入至所述含有石油和/或石油产品污染的环境中的铜绿假单胞菌的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述铜绿假单胞菌能够在所述含有石油和/或石油产品污染的环境中起作用并且对所述石油和/或石油产品有效地降解即可，加入的所述铜绿假单胞菌的形式，例如，可以为培养至对数期的活化菌体(菌悬液或菌体沉淀)，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉，或者经复配后得到的菌剂，优选为培养至对数期的活化菌体。
本发明对加入的铜绿假单胞菌数量也没有特别的限制，这可以根据所述含有石油和/或石油产品污染的环境中的石油和/或石油产品的含量以及菌株在所述环境中的生存能力来决定，例如，当所述环境中的石油和/或石油产品含量较高或所述环境对于所述铜绿假单胞菌的生存较不利时，可以提高所述铜绿假单胞菌的加入量；当所述环境中的石油和/或石油产品含量较低或所述环境对所述铜绿假单胞菌的生存影响较小时，可以减少所述铜绿假单胞菌的加入量。
根据本发明，为了进一步提高本发明提供的铜绿假单胞菌在含有石油和/或石油产品污染的环境中的生存能力以及活性，从而提高对石油和/或石油产品的降解率，本发明的方法还包括向所述环境中提供额外的无机盐。
其中，所述额外的无机盐的种类可以为本领域公知的用于培养铜绿假单胞菌的无机盐的种类。优选的，所述无机盐可以选自含氮无机盐、含磷无机盐、镁盐、钙盐和铁盐中的一种或多种。
优选的，所述含氮无机盐选自(NH4)2SO4、(NH2)2CO3、KNO3和NH4NO3中的至少一种，更优选为(NH2)2CO3；
优选的，所述含磷无机盐选自KH2PO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O中的至少一种，更优选为KH2PO4；
所述镁盐优选为硫酸镁，所述钙盐优选为氯化钙，所述铁盐优选为硫酸铁。
根据本发明一种具体的实施方式，所述无机盐为KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，MgSO4，CaCl2和FeSO4·7H2O。
其中，本发明对加入的所述无机盐的量没有特别的限制，可以根据所述含有石油和/或石油产品污染的环境中无机盐的种类以及含量而定。例如，以KH2PO4(0.8-1.2％)，K2HPO4(0.8-1.2％)，NH4NO3(1-1.5％)，MgSO4(0.03-0.08％)，CaCl2(0.001-0.003％)，FeSO4·7H2O(0.01-0.03％)的混合无机盐溶液为例，基于每千克的所述含有石油和/或石油产品污染的环境，上述无机盐混合液的加入量可以为1-3ml/天。
根据本发明，当所述含有石油和/或石油产品的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的铜绿假单胞菌对石油和/或石油产品的降解效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中：
LB液体培养基：0.9重量％蛋白胨，0.7重量％酵母粉，1.2重量％氯化钠，pH＝6.8-7.0。
无机盐培养基：KH2PO4(1.0重量％)，K2HPO4(1.0重量％)，NH4NO3(1.2重量％)，MgSO4(0.05重量％)，CaCl2(0.002重量％)，FeSO4·7H2O(0.02重量％)，pH＝7。
本发明的菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，以下简称为菌株P9，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10849。
参比菌株为脱氮假单胞菌，以下简称菌株D，分离自同批的石油污染土壤。
土壤中总石油烃污染(TPH)含量的测定方法：采用微波萃取法测定土壤中总石油烃含量，称取2g干土放入CEM萃取灌中(CEM MARSX微波化学工作站)，加入25mL正己烷和丙酮的混合液(1:1，体积比)后拧紧罐体，设定CEM操作参数为功率1200W，升温5min至120℃，保温30min。待冷却到40℃后，取出罐体。将萃取液过滤，置于已称重的烘干三角瓶中，放入通风橱中蒸干萃取液至恒重，称重后按重量法计算土壤中的TPH含量。
其中，石油的降解率(％)＝(土壤中初始TPH含量-处理后土壤中初始TPH含量)/土壤中初始TPH含量×100％。
制备例
将本发明的菌株P9和参比菌株D分别在LB培养基中以1体积％的接种量接种后，30±1℃、150rpm的条件下培养18小时备用。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的菌株P9在含石油环境中的耐盐特性
在三角瓶中分别加入50g原始石油含量为1.5重量％的石油污染土壤样品、200mL无机盐培养基及玻璃珠若干，另外，同时在玻璃瓶中加入氯化钠，以分别使得氯化钠浓度为0、3重量％、5重量％、7.5重量％、9重量％，每个盐浓度三个重复，于121℃下湿热灭菌15min。经测定，灭菌过程中会损失5％的石油烃。
在以上含有不同氯化钠浓度的三角瓶中接种本发明的菌株P9，接种量为1.25mL。将各三角瓶置于30℃，160rpm恒温摇床中培养12d，测定体系中的TPH的含量，并计算降解率，结果见表1。
对比例1
本对比例用于说明参比的菌株D在含石油环境中的耐盐特性
按照实施例1中的方法进行样品的处理和测定，不同的是，本对比例中接种的为参比菌株D。结果见表1。
对比例2
本对比例用于说明自然状态下含石油样品中石油的降解率
按照实施例1中的方法进行样品的处理和测定，不同的是，本对比例中不接种任何菌株。结果见表1。
表1
由表1可以看出，相比于参比菌株D，本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有更好的耐盐性以及石油降解特性。
实施例2
本实施例用于说明不同N形态对降解效果的影响
在灭菌的三角瓶中分别加入石油底物(浓度为2000mg/L)和不同N形态(NH4)2SO4、(NH2)2CO3、KNO3、NH4NO3的无机盐培养液(将原无机盐培养基中的含氮无机盐等摩尔量的替换为如上的含氮无机盐)，调节pH＝9，接种3％菌液至上述三角瓶中，于30℃、150r/min条件下振荡培养7d后测定TPH含量，并计算去除率；同时每个不同N形态处理设置不加菌液的空白对照实验。
结果显示，添加(NH2)2CO氮源时，降解率达71％。添加NH4NO3氮源时，降解率达60％。添加KNO3氮源时，降解率达57％。添加(NH4)2SO4氮源时，降解率达52％。因此，本发明的菌株P9在(NH2)2CO作为氮源时具有更高的石油降解率。
实施例3
本实施例用于说明不同P形态对降解效果的影响
在灭菌的三角瓶中分别加入石油底物(浓度为2000mg/L)和不同P形态(KH2PO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4与K2HPO4·3H2O(质量比为1:1))的无机盐培养液(将原无机盐培养基中的含磷无机盐等摩尔量的替换为如上的含磷无机盐)，调节pH＝9，接种3％菌液至上述三角瓶中，于30℃、150r/min条件下振荡培养7d后测定石油含量；同时每个不同P形态处理设置不加菌液的空白对照实验。
结果显示，添加KH2PO4磷源时，降解率达62％。添加K2HPO4·3H2O磷源时，降解率达57％。添加KH2PO4与K2HPO4·3H2O磷源时，降解率达56％。因此，本发明的菌株P9在KH2PO4作为磷源时具有更高的石油降解率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其特征在于，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10849。
2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或权利要求2所述的菌剂在降解石油和/或石油产品中的应用；其中，所述石油产品包括轻质石油产品和/或重质石油产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述轻质石油产品选自石脑油、汽油和柴油中的至少一种；所述重质石油产品选自沥青、蜡和焦炭中的至少一种。
5.权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或权利要求2所述的菌剂在制备耐盐产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述耐盐产品包括耐盐微生物和/或耐盐植物。
7.一种降解石油和/或石油产品的方法，该方法包括：将权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，和/或权利要求2所述的菌剂与含有石油和/或石油产品的环境接触，以对环境中的石油和/或石油产品进行降解；其中，所述石油产品包括轻质石油产品和/或重质石油产品。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述轻质石油产品选自石脑油、汽油和柴油中的至少一种；所述重质石油产品选自沥青、蜡和焦炭中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，该方法还包括，在对所述石油和/或石油产品降解的过程中，向所述含有石油和/或石油产品的环境中添加无机盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述无机盐选自含氮无机盐、含磷无机盐、镁盐、钙盐和铁盐中的一种或多种；
优选的，所述含氮无机盐选自(NH4)2SO4、(NH2)2CO3、KNO3和NH4NO3中的至少一种，更优选为(NH2)2CO3；
优选的，所述含磷无机盐选自KH2PO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4和K2HPO4·3H2O中的至少一种，更优选为KH2PO4；
所述镁盐优选为硫酸镁，所述钙盐优选为氯化钙，所述铁盐优选为硫酸铁。
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