CN106495902A - 一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料及其制备，本发明涉及一种生物肥料。一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述重量份数组成为:预处理蟹味菇废弃培养料30‑40,发酵牛粪6‑10；植物乳杆菌1‑3，枯草芽孢杆菌培养物1‑2，苦参碱1‑3，泡盛曲霉培养物2‑4。本发明的肥料能够增强作物的抗旱能力，特别适合在盐碱地使用本发明的肥料，能够改良土壤。生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。

Description

一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料及其制备

技术领域

本发明涉及一种生物肥料。

背景技术

现有的生物肥料大多是单一性的生物肥料。如：固氮菌肥，主要由具有固氮作用的细菌和真菌组成；又如：磷细菌，其功能是分解土壤中的有机磷，使之变为易于被植物吸收的磷素；再如：细菌，其功能是分解土壤中的钾化合物，使之成为能被植物吸收利用的速效钾。这些肥料在单独使用时均能发挥各自作用，部分满足植物对氮，磷，钾三要素的需要。它们不会产生长期使用化肥所造成的土壤板结现象。但其不足在于：单独使用上述三类生物肥料只能解决植物所需营养的一个方面，且成本较高，用量大，同时，将三者配合使用，又因难于做到比例适当而造成施肥量的不足或浪费。长期使用单一的或复合的生物肥料的实践证明，它们只能替代化肥的30％以下。

食用菌栽培用培养料在栽培使用后仍含有一定比例可以利用物质,如何高效利用食用菌栽培料,使其得到充分利用对于食用菌栽培产业的发展具有重要的推动作用,也对环境和资源的保护和利用是一个利好因素.蟹味菇和杏鲍菇是两个个产量较大的食用菌品种,蟹味菇的培养基配方:棉籽壳40千克，木屑38千克，麸皮10千克，玉米粉10千克，碳酸钙或硫酸钙1千克，石灰1千克，PH值7.5—8，含水量65％。一种可以提高蘑菇钙含量的栽培基质,申请号：201410403374.8,发明公开一种可以提高蘑菇钙含量的栽培基质，涉及栽培基质技术领域，其特征在于，由以下重量份数的组份组成：骨粉8-12份、秸秆20-40份、沼渣1-2份、木炭灰2-4份、苔藓1-2份、荔枝壳1-2份、豆秸灰1-2份、松球1-2份、抹茶1-2份、富硒酵母0.5-1份、鱼骨粉1-2份、红曲米1-2份、窖泥4-6份、草炭土3-5份、锯末4-6份、竹粉1-2份、龙虾壳1-2份、鱼鳞1-2份及杀菌剂1-2份。本发明基质产出的蘑菇可以补充机体所需多重营养，调节肠胃功能，调节微循环，提高免疫力，特别适合骨质疏松、骨质增生、易骨折的人士，提高资源利用率，产生较高的经济效益。

微生物肥是一种以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品，它在培肥地力、提高化肥利用率、抑制农作物对重金属及农 药等有害物质的吸收、净化和修复土壤、促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用、提高农产品品质等方面有着不可替代的作用。微生物肥料的功效发挥主要是通过对传统化肥、有机肥的增效作用，对土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式来实现的。

因此，微生物肥料就有了化肥、有机肥、有益生物菌的多种肥力和功效，是活化肥料养分、提高肥料效果、改良作物品质、促进农业增产增效的理想肥料。微生物肥料是活体肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活动来完成。只有当这些有益微生物处于旺盛的繁殖和新陈代谢的情况下，物质转化和有益代谢产物才能不断形成。因此，微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料是以氮、磷、钾等主要元素的形式和多少为基础。正因为微生物肥料是活制剂，所以其肥效与活菌数量、强度及周围环境条件密切相关，包括温度、水分、酸碱度、营养条件及原生活在土壤中土著微生物排斥作用都有一定影响。

而且目前市场上的农用微生物菌剂主要为单一的微生物菌种，难以还原微生态结构，同时普通菌种和农作物的协同作用弱，不利如提高植物抗逆性和根系营养吸收，例如公布号为CN102888356A的专利申请，公开了一种利用枯草芽孢杆菌制备微生物肥料的方法及其应用。虽然目前市场上已出现一些复合微生物菌剂，但其或者功能单一，或者其使用方法受到限制，使用后的作物增产效果还不能达到令人满意，所以目前仍需要开发适用于多种施用途径、具有综合功能和良好增产效果的复合微生物菌剂或肥料。

由于我国长期在生物肥料方面研究缺乏投入，使得我国的生物肥料产业依然存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述重量份数组成为:

预处理蟹味菇废弃培养料30-40,发酵牛粪6-10；植物乳杆菌1-3，枯草芽孢杆菌培养物1-2，苦参碱1-3，泡盛曲霉培养物2-4；

预处理蟹味菇废弃培养料的制备方法如下：

栽培后蟹味菇废弃培养料粉碎后添加粉碎玉米芯粉和秸秆粉，控制水分含量 在10-30％，添加黑曲霉培养物，控制温度在26-35℃通风培养10-20小时调整温度5-12℃保持2-5小时后调整温度到20-28℃，喷洒酵母菌液培养10-20小时即得。

发酵牛粪的制备方法如下：包括如下步骤：

牛粪与粉碎秸秆和粉碎的苦豆子按照比例混合后添加黑曲霉培养物调节水分建堆发酵，温度达到65-70℃后保持3-5小时，保持翻拌间隔为每3-4小时一次，待温度达到20-32℃添加酵母菌液发酵15-20小时后结束发酵处理；

所述牛粪、粉碎秸秆、苦豆子和黑曲霉培养物重量份数组成:牛粪10-20份、粉碎秸秆5-10份，苦豆子2-5；黑曲霉培养物3-8份；

发酵牛粪的水分含量应控制在40～65％。

酵母菌液的制备方法：酵母菌菌种接入试管斜面活化，接种液体培养基培养15-25小时添加L半胱氨酸后制得；

所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。

泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。

所述生物肥制备方法如下：按照上述物质比例混合后制粒。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484

上述菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市中关村北一条13号中科院微生物研究所；邮编：100080。

有益效果

本发明的肥料能够增强作物的抗旱能力，特别适合在盐碱地使用本发明的肥料，能够改良土壤。肥料中有益微生物能产生谷胱甘肽与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起，可以改善土壤团粒结构，增强土壤的物理性能和减少土壤颗粒的损失，在一定的条件下，还能参与腐殖质形成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。

本产品使用方法简单，每亩地使用量0.3-1公斤，成本仅为80-100元/亩， 拌种或生长期灌水前地表喷洒。降低农业生产成本、减少化肥的使用、恢复土壤生态地力和有效提高农作物产量等方面均能起到显著的作用，充分发挥土壤的有机质效能。

具体实施方式

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

所述酿酒酵母菌株保藏编号为CGMCC No.12789具体为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)tlj2016，该菌株已保藏于2016年7月15日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12789，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述酿酒酵母tlj2016的最适生长pH为6.0-6.5,最适生长温度为28-35℃；

所述酿酒酵母tlj2016是从一株宁夏果园中分离得到的酿酒酵母出发菌株经以下步骤得到：

原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→高渗平板筛选→亚硝基胍(NTG)诱变筛选→高渗平板初筛→摇瓶筛选→发酵复筛(产GSH能力)→传代稳定性试验。

1、本发明所提供的酿酒酵母对葡萄糖的耐受能力达到300g/L，利于其在高浓度葡萄糖条件下生产GSH；

2、本发明所提供的酿酒酵母在5L发酵罐中发酵生产GSH终浓度达到3308mg/L；

3、本发明所提供的酿酒酵母耐受L-半胱氨酸的能力远高于出发菌株，在5mmol/LL-半胱氨酸作用下仍能缓慢生长，在40mmol/LL-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成；

4、本发明所提供的酿酒酵母耐盐能力达到18％，有利于扩展其应用领域。

高糖条件下tlj2016发酵产GSH能力实验

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖100、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0；

发酵结束后，测定发酵液中GSH的含量为3308mg/L.

L-半胱氨酸耐受力实验

将出发菌株以及tlj2016斜面菌种各一环，分别接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养进行培养，在培养至12h时，向摇瓶中加入不同终浓度的L-半胱氨酸，再培养10h，测定细胞干重，结果见表1、2；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖20、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

表1：出发菌株L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸浓度mmol/L	0	5	10	15	20	40
							出发菌株干重g/L	22.6	15.7	10.2	4.3	2.2	0.8
GSH浓度(mg/L)	35.6	46.7	43.2	40.7	37.9	25.3

表2：tlj2016L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸浓度mmol/L	0	5	10	15	20	40
							tlj2016干重g/L	25.7	28.5	23.6	21.2	20.6	18.7
GSH浓度(mg/L)	73.2	98.3	113.5	121.7	127.5	135.8

从表1、2的结果可以看出，对于出发菌株，培养基中添加L-半胱氨酸，细胞停止生长，并且开始自溶，导致GSH增长率随着L-半胱氨酸浓度的升高而降低；而低浓度L-半胱氨酸下，tlj2016仍能够缓慢生长，随着L-半胱氨酸浓度的提高，tlj2016菌株的细胞干重缓慢下降，而GSH浓度持续增长，这一结果将有利于GSH生产过程中通过添加前体氨基酸-L-半胱氨酸提促进GSH的生产。

耐盐能力实验

取tlj2016菌液1mL接种菌种于含有不同NaCl浓度的(含量梯度为0％、2％、5％、10％、15％、18％)的10mL YPD液体培养基(pH＝6.5)，置于30℃下分别培养24h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于YPD固体平板中涂布，于30℃生化培养箱中倒置培养36小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表3，可知该菌的耐盐浓度为18％，说明tlj2016不仅可以在常规环境中生存，在高盐条件下依然具有活力，可应用于酱油、腌制品等高盐食品加工过程中耗糖产谷胱甘肽。

表3：耐盐能力检测(×10⁷cfu/ml)

NaCl含量

0％

2％

5％

10％

15％

18％

原始菌株

5.16±0.42

4.38±0.42

2.15±0.21

0.12±0.11

0

0

tlj2016

5.33±0.28

5.10±0.71

4.83±0.42

3.98±0.33

2.57±0.48

0.83±0.15

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02，该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.7926。

所述菌株特性是产耐高温α-淀粉酶的酶活力高，耐热、耐酸性强。

所述菌株制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000u/ml；适用温度范围为105-115℃，最适反应温度110℃，在110℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2。

所述菌株特点如下：

所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下：

(1)菌悬液的制备

将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40℃培养12h后，取1mL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。

(2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变

将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。

(3)高产菌种的初筛

将上述涂布均匀的平板，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03。

(4)摇瓶发酵复筛

将获得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，40℃、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。

(5)酶活测定

酶活单位的定义：1mL粗酶液，于105℃、pH 4.2条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，

即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL。

所述氯化锂平板：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)₂SO₄ 0.4％，K₂HPO₄ 0.8％，CaCl₂0.2％，氯化锂0.9％，琼脂2％。

所述的种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％。

所述的发酵培养基：玉米粉5％-15％，豆饼粉4％-10％，(NH)₂SO₄ 0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂ 0.2％。

所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种 量10％(V/V)，100r/min、40℃发酵培养72h。

所述耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：

(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在100-110℃之间，且在110℃以下保存的，温度稳定性较好，而110℃以上保存长时间温度稳定性较差。

(2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。

(3)酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000U/ml。

泡盛曲霉菌剂的制备方法：

斜面菌种活化培养：将泡盛曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27℃培养3天。

固体一级种子培养：挑取泡盛曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30℃培养3天即可。

固体二级种子培养：将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件：30℃培养3天即可。

固体发酵培养：将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35℃，湿度80-90％，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121℃，时间1小时。

干燥粉碎：发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10％以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。

培养基组成：固体原料：麸皮80,豆饼粉10％,玉米淀粉10％，添加等量自来水；初始pH自然。

枯草芽孢杆菌培养物的制备方法：

发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；

(1)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1:0.5,罐压0.05MPa,培养时间24小时；

(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1:0.5,罐压0.05MPa,培养时间24小时。发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得含枯草芽孢杆菌剂在内的枯草芽孢杆菌培养物。

培养基组成：葡萄糖6％,酵母提取物1％,蛋白胨0.2％，CaCO₃ 1％,pH6.8。

实施例1：

预处理蟹味菇废弃培养料35,发酵牛粪8；植物乳杆菌1-3，2，枯草芽孢杆菌培养物1，苦参碱1，泡盛曲霉培养物3；

预处理蟹味菇废弃培养料的制备方法如下：

栽培后蟹味菇废弃培养料粉碎后添加粉碎玉米芯粉和秸秆粉，控制水分含量在20％，添加黑曲霉培养物，控制温度在30℃通风培养15小时调整温度8℃保持4小时后调整温度到25℃，喷洒酵母菌液培养15小时即得。

发酵牛粪的制备方法如下：包括如下步骤：

牛粪与粉碎秸秆和粉碎的苦豆子按照比例混合后添加黑曲霉培养物调节水分建堆发酵，温度达到68℃后保持4小时，保持翻拌间隔为每3小时一次，待温度达到26℃添加酵母菌液发酵18小时后结束发酵处理；

所述牛粪、粉碎秸秆、苦豆子和黑曲霉培养物重量份数组成:牛粪18份、粉碎秸秆8份，苦豆子3，黑曲霉培养物5份；

发酵牛粪的水分含量应控制在55％。黑曲霉为CICC2103。

酵母菌液的制备方法：酵母菌菌种接入试管斜面活化，接种液体培养基培养15-25小时添加L半胱氨酸后制得；

所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。

泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，30℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。

所述生物肥制备方法如下：按照上述物质比例混合后制粒。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484

苦参碱制备工艺如下:

1、粉粹：将苦豆子粉粹至粗细度40目。

2、浸泡：按料液比1:10(m：V)的重量在碳酸钠和乙醇的混合溶液中浸泡3h，浸泡温度控制在65℃；碳酸钠和乙醇的质量比为1：8。

3、提取：将浸泡好的苦豆子混合物置于超声波提取罐中提取苦参碱，超声波频率60-80kHz，提取时间35min，提取次数2次，温度控制在65℃；

4、提取液过滤浓缩：

将提取好的苦参碱提取液经真空浓缩设备浓缩至Brix15-16，PH6.5-7.0。苦参碱含量7.6％；苦参碱的提取率达93％以上。

所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。

泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。

所述生物肥制备方法如下：按照上述比例将各种菌剂混合，或混合后制粒。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484

上述菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市中 关村北一条13号中科院微生物研究所；邮编：100080。

酵母菌CGMCC No.12789发酵液培养制备

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至14-15h时，一次性添加终浓度为16mmol/L的L-半胱氨酸得到酵母菌发酵液；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖50、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0；

实施例2本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述重量份数组成为:

预处理蟹味菇废弃培养料30,发酵牛粪10；植物乳杆菌1，枯草芽孢杆菌培养物2，苦参碱3，泡盛曲霉培养物2；

预处理蟹味菇废弃培养料的制备方法如下：

栽培后蟹味菇废弃培养料粉碎后添加粉碎玉米芯粉和秸秆粉，控制水分含量在30％，添加黑曲霉培养物，控制温度在26℃通风培养10小时调整温度5℃保持2小时后调整温度到28℃，喷洒酵母菌液培养20小时即得。

发酵牛粪的制备方法如下：包括如下步骤：

牛粪与粉碎秸秆和粉碎的苦豆子按照比例混合后添加黑曲霉培养物调节水分建堆发酵，温度达到65℃后保持3小时，保持翻拌间隔为每4小时一次，待温度达到32℃添加酵母菌液发酵20小时后结束发酵处理；

所述牛粪、粉碎秸秆和苦豆子重量份数组成:牛粪10份、粉碎秸秆5份，苦豆子2；黑曲霉培养物3份；

发酵牛粪的水分含量应控制在40％。

酵母菌液的制备方法：酵母菌菌种接入试管斜面活化，接种液体培养基培养15小时添加L半胱氨酸后制得；所述酿酒酵母菌株保藏编号为CGMCC No.12789。

所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。

泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。

所述生物肥制备方法如下：按照上述物质比例混合后制粒。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484

实施例3

产品效果实验

试验地的选择与试验设计：试验于2015年4月27日—2016年8月30日在天津静海县盐碱地进行。

试验田达到田种植玉米5亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.4公斤，出苗1个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.5公斤，对照组使用市售有机肥料。

发明产品使用玉米地玉米产量达到500公斤，试验组发苗期病虫害明显减少，杀虫药物是对照组的48％；对照组达到265公斤；该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了420公斤，比对照组单产提高了58％。且试验田土壤结构良好，无板结。

Claims (8)

1.一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述重量份数组成为:

预处理蟹味菇废弃培养料30-40,发酵牛粪6-10；植物乳杆菌1-3，枯草芽孢杆菌培养物1-2，苦参碱1-3，泡盛曲霉培养物2-4。

2.根据权利要求1所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述预处理蟹味菇废弃培养料的制备方法如下：栽培后蟹味菇废弃培养料粉碎后添加粉碎玉米芯粉和秸秆粉，控制水分含量在10-30％，添加黑曲霉培养物，控制温度在26-35℃通风培养10-20小时调整温度5-12℃保持2-5小时后调整温度到20-28℃，喷洒酵母菌液培养10-20小时即得。

3.根据权利要求1所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述发酵牛粪的制备方法如下：包括如下步骤：牛粪与粉碎秸秆和粉碎的苦豆子按照比例混合后添加黑曲霉培养物调节水分建堆发酵，温度达到65-70℃后保持3-5小时，保持翻拌间隔为每3-4小时一次，待温度达到20-32℃添加酵母菌液发酵15-20小时后结束发酵处理。

4.根据权利要求3所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述牛粪、粉碎秸秆、苦豆子和黑曲霉培养物重量份数组成:牛粪10-20份、粉碎秸秆5-10份，苦豆子2-5；黑曲霉培养物3-8份。

5.根据权利要求1所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，酵母菌液的制备方法：所述酵母菌培养物的的制备方法包括如下步骤:酵母菌菌种接种液体培养基培养15-25小时添加L半胱氨酸后制得。

6.根据权利要求1所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)为CGMCC 7926，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)为CGMCC3.6484。

7.根据权利要求1所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，所述酿酒酵母菌株保藏编号为CGMCC No.12789，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016。

8.根据权利要求1所述的一种利用食用菌废弃培养料的生物肥料，其特征在于，重量份数组成为：预处理蟹味菇废弃培养料35,发酵牛粪8；植物乳杆菌1-3，2，枯草芽孢杆菌培养物1，苦参碱1，泡盛曲霉培养物3；

预处理蟹味菇废弃培养料的制备方法如下：栽培后蟹味菇废弃培养料粉碎后添加粉碎玉米芯粉和秸秆粉，控制水分含量在20％，添加黑曲霉培养物，控制温度在30℃通风培养15小时调整温度8℃保持4小时后调整温度到25℃，喷洒酵母菌液培养15小时即得；

发酵牛粪的制备方法如下：包括如下步骤：牛粪与粉碎秸秆和粉碎的苦豆子按照比例混合后添加黑曲霉培养物调节水分建堆发酵，温度达到68℃后保持4小时，保持翻拌间隔为每3小时一次，待温度达到26℃添加酵母菌液发酵18小时后结束发酵处理；

所述牛粪、粉碎秸秆、苦豆子和黑曲霉培养物重量份数组成:牛粪18份、粉碎秸秆8份，苦豆子3，黑曲霉培养物5份；

苦参碱制备工艺如下:粉粹：将苦豆子粉粹至粗细度40目；浸泡：按料液比1:10(m：V)的重量在碳酸钠和乙醇的混合溶液中浸泡3h，浸泡温度控制在65℃；碳酸钠和乙醇的质量比为1：8；提取：将浸泡好的苦豆子混合物置于超声波提取罐中提取苦参碱，超声波频率60-80kHz，提取时间35min，提取次数2次，温度控制在65℃；提取液过滤浓缩：

将提取好的苦参碱提取液经真空浓缩设备浓缩至Brix15-16，PH6.5-7.0；苦参碱含量7.6％；苦参碱的提取率达93％以上；

酵母菌发酵液培养制备

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖35、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至14-15h时，一次性添加终浓度为16mmol/L的L-半胱氨酸得到酵母菌发酵液；

发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10、葡萄糖50、K₂HPO₄·3H₂O 8、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1,pH6.0。