CN106483289A

CN106483289A - 一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒

Info

Publication number: CN106483289A
Application number: CN201611257340.8A
Authority: CN
Inventors: 魏乃东
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-03-08

Abstract

本发明公开了一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒,其含有能特异性检测人成熟骨髓间充质干细胞的核酸适体。利用本发明的试剂盒，可以特异性的分离人成熟骨髓间充质干细胞，该试剂盒具有操作简单、方便直接用于人成熟骨髓间充质干细胞的分离，节约时间和成本。

Description

一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒

技术领域

本申请涉及生物检测领域，具体涉及人成熟骨髓间充质干细胞的检测。

背景技术

干细胞即为起源细胞。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力(Self-renewing)，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。

干细胞是自我复制还是分化功能细胞，主要由于细胞本身的状态和微环境因素所决定。包括调节细胞周期的各种周期素(Cyclin)和周期素依赖激酶(Cyclin－DependentKinase)、基因转录因子、影响细胞不对称分裂的细胞质因子。微环境因素，包括干细胞与周围细胞，干细胞与外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。人体内的干细胞分两种类型，一种是全功能干细胞，可直接克隆人体；另一种是多功能干细胞，可直接复制各种脏器和修复组织。人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并最终通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗。

最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。

间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

骨髓间充质干细胞是来源于骨髓来源的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新我增殖能力以及向分化潜能。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。

但是在现有技术中，鉴定时候筛选得到性能优良的骨髓间充质干细胞一直是一个难题。现有技术中CN104215773A公开了一种鉴定骨髓间充质干细胞活性的方法，其中首次发现了GAPDH蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达分布水平与骨髓间充质干细胞活性的关系，所提供的方法可以快速地鉴定出对疾病治疗效果好、增殖能力强的骨髓间充质干细胞，从而可用于骨髓间充质干细胞的高通量筛选。

但是所述的鉴定方法需要鉴定GAPDH蛋白的水平，所述的鉴定一般需要制备GAPDH抗体，所述方法还是较为复杂，实际应用中成本很高，仍然不利于推广使用。

发明内容

本发明提供一种用于快速鉴定对疾病治疗效果好、增殖能力强的骨髓间充质干细胞的试剂盒，以及相应的鉴定用的适配子。

按照CN103421740A中公开的人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，获得成熟、活性高的人骨髓间充质干细胞，所述细胞为阳性表达:CD73，CD90，而阴性表达:CD34、CD45。

本发明的目的是提供一种人骨髓间充质干细胞的核酸适配体序列。

本发明中，所述的人骨髓间充质干细胞的核酸适配体(序列1-18)能够特异结合人骨髓间充质干细胞。

本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性分离人骨髓间充质干细胞的试剂盒。

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。中筛选出与人骨髓间充质干细胞特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物F(5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’)和R(5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海生工生物公司)，转化DH5a细菌(购自上海生工生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以人骨髓间充质干细胞为正筛靶标，以人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充质干细胞为反筛靶标，筛选与人骨髓间充质干细胞特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合人骨髓间充质干细胞的序列，本发明中命名为适配体BMMSC-1～18。序列如下：

本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离人成熟的骨髓间充质干细胞，所述方法比采用GAPDH分离的方法具有分离成本低，时间更加简便等优点。

本公开的适配子分子可用作将靶标结合或固定至固相载体的捕获试剂。固相载体可以由具有通常与过滤器、晶片、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组成的基底组成。然而，预期固相载体可由这样的基底组成，其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或任何用于捕获或固定用于诊断、检测或定量研宄的试剂的诊断性检测试剂。

固相载体可以基于所需的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金属表面，以及诸如钢材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的组合。

本发明的有益效果：通过制备特异性的结合人骨髓间充质干细胞的适配体以及相应的试剂盒可以用于实现特异性分离纯化人骨髓间充质干细胞，所述方法制备简单，成本低廉，可以用于批量制备所述的试剂盒。

具体实施方式

实施例1:人骨髓间充质干细胞成熟细胞的制备

按照CN103421740A中公开的人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，获得成熟、活性高的人骨髓间充质干细胞，所述细胞为阳性表达:CD73，CD90，而阴性表达:CD34、CD45。按照CN104215773A一种鉴定骨髓间充质干细胞活性的方法对所述细胞进行鉴定，选择活性高的细胞作为后续使用。

实施例2核酸适配体筛选

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)

TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。

富集所用引物:

F：5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’

R：5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’

将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥；用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl₂,2mg/mL BSA,0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库,取250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速离心。

反筛:将250pmol的文库吸入含有人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充质干细胞的直径6cm培养皿中，细胞浓度为2.0×10⁶个/ml。用结合缓冲液补足到1mL；4℃摇床振荡3h；取上清液。

正筛:将反筛上清液加入到含有实施例1制备的人骨髓间充质干细胞培养皿中，细胞浓度为2.0×10⁶个/ml，4℃摇床振荡1h；弃上清液；用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgC1₂)洗涤人骨髓间充质干细胞细胞三遍；用1mL洗涤缓冲液将人骨髓间充质干细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待变冷后，10000rpm离心5min；上清转移到一干净的EP管中。

富集:配置PCR体系(总体积1000ul):H₂0 740ul，10XPCR缓冲液100ul，dNTP 80ul，引物混合物25ul(F:100uM，100uM),DNA模板(正筛上清)50ul，Taq HS酶5ul。

按如下条件在PCR仪上扩增:94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退火20s，72。。延伸20s,20个循环，72℃延伸4min，4℃保温<lh。

纯化:纯化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗两遍，加入150ul GE的StreptavidinSepharose后PBS洗两遍,加入PCR产物,摇床振荡20min,放出液体,PBS洗两遍后,加0.5mLNaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱盐柱，待液体从脱盐柱几乎流尽时加1mL MilliQ水洗脱，同时开始接洗脱液lmL，该洗脱液即为富集了的寡聚DNA文库。将富集了的寡聚DNA文库进行常规的TA克隆，而后进行菌落PCR与测序。测序结果为SEQ ID NO：1-18所示。

实施例3适配子结合特性验证

取人骨髓间充质干细胞分别与不同浓度0、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、500nM、800nM、1000nM)的适配子BMMSC-(1～18)孵育20min，洗涤后进行流式细胞术实验，结果发现，随着适配子浓度的增加，其对靶细胞的结合力就越强，最终结合趋于饱和。当适配子与细胞结合率达到50％时，此时所需的适配子的浓度就是其平衡解离常数Kd，由此我们可以得到适配子各自与细胞的结合力常数分别如下：

实施例4所述适配子特异性分析

将50nM的FITC标记的适配子BMMSC-1～18分别与成熟的人骨髓间充质干细胞、人脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞、红细胞结合20min，洗涤，4％的多聚甲醛固定后进行共聚焦显微镜实验，结果发现，对于人骨髓间充质干细胞来说，适配子BMMSC-1～18均能很好的与其结合，且在细胞膜上可以看到很明显的荧光，而对于人脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞、红细胞来说，适配子BMMSC-1～18均没有明显地与其结合，所以在荧光场中基本看不到荧光。

通过上述实验得出以下结论:本发明的适配子序列均能很好的与靶细胞结合，而且靶向性也很好。

实施例5分析细胞实验

将本发明的适配子分别偶联磁珠，将培养的成熟人骨髓间充质干细胞到无菌离心管中，取1mL细胞悬浮液经流式细胞仪计数其中的人骨髓间充质干细胞个数，其数量为4.5X10⁵。分别将偶联有磁珠的适配子与等量的细胞悬浮液(每mL中加入1000个人红细胞)混合孵育20分钟，而后磁分离，即可获得相应的分离的细胞，通过检测剩余的细胞个数，按照(4.5X 10⁵-剩余的个数)/4.5X 10⁵*100％得到了相应的分离效率如下。

分别将每一个分离得到的成熟人骨髓间充质干细胞通过流式细胞仪以及电镜分析，发现所述的细胞均为人成熟骨髓间充质干细胞。这说明，本发明的适配子可以用于很好的分离人成熟骨髓间充质干细胞。

实施例6成像效果检测

按照本领域常规的方法将已经标记有磁珠的适配子BMMSC-1与叠氮-荧光量子点复合物相室温孵育偶联2h，形成相应的复合物。其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的20倍。而后，将所述偶联物与混合有人成熟骨髓间充质干细胞、人脂肪来源间充质干细胞、人肌肉来源的间充质干细胞和红细胞的细胞混合液混合1h，进行荧光成像，通过成像发现，所述的人成熟骨髓间充质干细胞分布比较均匀。通过磁性分离，采用细胞标志物鉴定发现，所述的细胞均为人成熟骨髓间充质干细胞。

采用适配子BMMSC-2～18也采用上述的成像效果检测，通过成像发现，其效果与适配子BMMSC-1的效果一致。

实施例7分离的人成熟骨髓间充质干细胞分化研究

步骤1:将实施例5分离得到的人成熟骨髓间充质干细胞培养并传代，细胞数调整为5*10⁵/ml，接种在T25培养瓶中，用含10％FBS的DMEM高糖培养液进行培养；

步骤2:待细胞贴壁后，用DMEM高糖培养液润洗细胞表面残留的培养基，将配置好的软骨细胞诱导分化培养液小心的加入培养瓶中，每瓶5ml，放入37℃、5％C0₂的培养箱内进行培养。

其中，步骤2中所用到的软骨细胞诱导分化培养液的配方如下：

以DMEM高糖培养液为基础，含有10％胎牛血清，lOOμg/ml青霉素，lOOμg/ml链霉素，抗坏血酸50ug/ml、100nmol/L地塞米松、100μg/ml丙酮酸盐、40μg/ml脯氨酸、50mg/mlITS+Premix和TGF-β310ng/ml。

将诱导分化后的细胞采用流式细胞仪检测传代培养后的MSCs细胞表型：常规流式方法测定MSCs特异性表达标记，该流式细胞检测所需试剂为：

Collagenll(abeamab79127)、CD44、CD45、CD29、CD34、CD271。检测的结果为特异性标记物CD44表达率为99.32％，CD29表达率为97.26％，两者的表达量均明显大于90％；其造血细胞标记CD34和CD45表达率分别为2.11％和2.01％，两者表达呈阴性。由此证明了实施例5分离纯化的人骨髓间充质干细胞具有分化特性可以用于相应的特性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉魏乃东

〈120〉一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-1

TGGACAGACGTAAGACGTAAATTCACATCACACATCATTCACACCCCCCCTTCCAATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-2

TGGACAGACGTAAGACGTAACCTACACATCCCTCAACTCACATTAATACATCTTATTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-3

TGGACAGACGTAAGACGTAAATTATTTTACTACTACTATCTTACTAACCCCCTCTTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-4

TGGACAGACGTAAGACGTAACTTTCTTATCAACCATTACTAAACCTATATTAACATTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-5

TGGACAGACGTAAGACGTAACCAACTCCTCCCAATCTACATCTCTCTTAATATTACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-6

TGGACAGACGTAAGACGTAAACAAAACACCCATCCCTACTCAATTTAATACTAATATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-7

TGGACAGACGTAAGACGTAACCCCAACACCCCTAATATTATATCCTCTTCTTCATATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-8

TGGACAGACGTAAGACGTAATTTTAACCTCATCTAATATTACATTCCCAATATTCTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-9

TGGACAGACGTAAGACGTAACTATACATATATACTCTTTTACCAATTTAATCTAAATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-10

TGGACAGACGTAAGACGTAATCTTTTCTCTCCTCATTTCCATATTCTCCTTCCCCATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-11

TGGACAGACGTAAGACGTAAAATTACCTCCATCTATCCTCCATTTCATTTACTAACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-12

TGGACAGACGTAAGACGTAAACCATAACTCTTCCCATCAATCTCACCATAACTTTTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-13

TGGACAGACGTAAGACGTAAAACTCTCCTTATCCCAATTTTCTCTTCAACATAAACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-14

TGGACAGACGTAAGACGTAAATCCTCTCTCAACACTTACTCCCAACCTCACTATCCTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-15

TGGACAGACGTAAGACGTAATTCTTACACTATCTCCCTACTTCCTATTACTTTTCTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉16

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-16

TGGACAGACGTAAGACGTAACTCTCTCATACTCTAACTACAACTCCTCTCTACAACTGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉17

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-17

TGGACAGACGTAAGACGTAACCTATACATACTTCTCCTTAACTCTTCTTCAACTCATGAGATGCCAGTAGTGACGA

〈210〉18

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BMMSC-18

TGGACAGACGTAAGACGTAATATAACTACTAAATCAAAACATCTACTTACCTCACTTGAGATGCCAGTAGTGACGA

Claims

1.一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒，其含有能特异性检测人成熟骨髓间充质干细胞的核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述适体的一端偶联有磁珠，用于富集分离得到的人成熟骨髓间充质干细胞。

3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列如SEQ ID No：1-18任一所示。

4.一种检测人成熟骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于利用权利要求1所述的试剂盒。

5.SEQ ID No：1-18任一所示的适体在制备用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒中的应用。

6.一种核酸适体，其特征在于：序列如SEQ ID No：1-18任一所示。