CN106480096B - 表达载体及重组细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达载体，其是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，包括EF1α‑IDS序列。该表达载体以EF1α为启动子，能够保证真核基因高效表达，为研究IDS基因的功能提供了良好的工具。

Description

表达载体及重组细胞

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种表达载体以及包括该表达载体的重组细胞，特别地，本发明尤其涉及IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体。

背景技术

慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的基因的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒已经成为表达外源基因的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

粘多糖贮积症II型(Mucopo1ysaccharidosis type II，MPS II，MIM309900)，又称Hunter综合征，是一种X连锁隐性遗传病，在人群中的发病率极低，属于一种“罕见病”。由于基因突变导致溶酶体酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在体内大量沉积，尿中大量排出硫酸皮肤素(dermatinsulfate B，DS)、硫酸已酰肝素(heparitin sulfate，HS)。患者出生时表现一般正常，但随着越来越多的粘多糖贮积在体内，MPS II病程进行性加重，症状典型，预后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPS II与IDS基因发生突变高度相关。因此，开发一种可携带IDS基因的慢病毒载体，对于研究IDS基因的功能提供了良好的工具，且为Hunter综合征的慢病毒基因治疗提供了一种较为理想的手段，具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种可携带IDS基因的慢病毒表达载体以及包括该表达载体的重组细胞。

一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括EF1α-IDS序列。

前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；

其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。

前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基因之间的增强子Kozak。

前述的表达载体，所述增强子Kozak的序列是CGCCACC。

前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列是SEQ ID No:1所示的序列。

前述的表达载体，所述表达载体以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列。

另一方面，本发明还提供了包括上述表达载体的重组细胞。

相比于现有技术，本发明的技术方案至少具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一种IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，为研究IDS基因的功能提供了良好的工具。

(2)本发明所述的启动子EF1α，是一种强表达的启动子，可使外源基因在哺乳动物细胞中广泛表达，甚至可在原代细胞和干细胞内表达。

(3)本发明所述的增强子Kozak，是用来增强真核基因的翻译效率的，是最优化的ATG环境，避免核糖体出现leaky scan。

附图说明

图1是pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE载体图谱。

图2是pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体酶切结果。

其中，1#:10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)

2#:载体酶切产物

3#:未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。

图3是EF1α片段胶回收电泳结果。

其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

图4是IDS片段胶回收电泳结果。

其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

图5是EF1α-IDS片段胶回收电泳结果。

其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

图6是转化子PCR产物电泳图。

其中，1#：阴性对照(ddH₂O)；2#：阴性对照(空载自连对照组)；3#：阳性对照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5#-12#：IDS 1-8号转化子。

图7是阳性克隆测序结果。

图8是质粒表达检测流程图。

图9是Real-time PCR实验数据统计结果。

具体实施方式

为充分了解本发明之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本发明做详细说明，但本发明并不仅仅限于此。下述具体实施方式中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述具体实施方式中所涉及的物质均为常规市购得到。

在此应当说明的是，除非另有说明，否则本发明中所涉及的术语具有本领域技术人通常理解的含义。

I.表达载体

本发明的一个方面提供了一种表达载体，该表达载体是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，该表达载体包括EF1α-IDS序列。其中，EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。

在一种具体实施方式中，EF1α-IDS序列包括强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基因之间的增强子Kozak。其中增强子Kozak的序列是CGCCACC。

在另一种具体实施方式中，EF1α-IDS序列是序列表中SEQ ID No:1所示的序列：

在一种特别优选的具体实施方式中，本发明的表达载体是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE，如图1所示，其是以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列(序列表中SEQ ID No:1所示的序列)，即pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中原有的PGK启动子替换为强启动子EF1α，将原有的GFP基因替换为IDS基因，并在强启动子EF1α和目的基因IDS之间插入增强子Kozak(CGCCACC)。

II.表达载体的构建

本发明表达载体的构建方法主要包括骨架载体线性化、EF1α-IDS的获取和重组载体的构建。具体如下：

1.pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体线性化

使用限制性核酸内切酶EcoRV和SalI，对pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体进行双酶切，随后胶回收约6Kb的酶切产物。

2.EF1α-IDS片段的获取

EF1α片段的获取：设计一对引物，以pMD18-EF1α载体为模板，PCR扩增EF1α片段并胶回收。

IDS片段的获取：设计一对引物，以pMD18-IDS载体为模板，PCR扩增IDS片段并胶回收。

EF1α-IDS片段的拼接：以胶回收的EF1α片段和IDS片段为模板，设计一对引物，进行两个片段的重叠PCR，拼接获得EF1α-IDS片段。

3.pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重组质粒的构建

EF1α-IDS片段通过同源重组构建到线性化骨架载体。

在一种具体实施方式中，本发明的IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE的构建方法如下：

1.pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体线性化

将慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(购自美国Addgege公司)进行EcoRV和SalI双酶切，并胶回收约6Kb酶切产物，酶切体系(ThermoScientific公司)如下：

将上述混合液于37℃，反应30min。酶切结果如图2所示。

2.EF1α-IDS片段的获取

A、EF1α片段的获取

以pMD18-EF1α(序列是SEQ ID No:2所示的序列)为模板，PCR扩增EF1α片段，胶回收约1301bp片段。采用IDS-P1和IDS-P2引物对，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下表：

ID	序列
		IDS-P1	GCCTCGAGAAGCTTGATATCAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAG
IDS-P2	TGGCGGCATGGTGGCGTCACGACACCTGAAATGGAAG

PCR反应体系如下：

PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s)，30个循环；72℃延伸10min；产物在4℃保存。扩增片段大小1301bp。用PCR纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化PCR产物。PCR琼脂糖电泳结果如图3所示。

B、IDS片段的获取

以pMD18-IDS(序列是SEQ ID No:3所示的序列)为模板，PCR扩增IDS片段，胶回收约1697bp片段。采用IDS-P3和IDS-P4引物对，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下表：

ID	序列
		IDS-P3	CTTCCATTTCAGGTGTCGTGACGCCACCATGCCGCCA
IDS-P4	TCCAGAGGTTGATTGTCGACGCGGCCGCTTTAAGGCATCAACAACTGGAAAAGATC

PCR反应体系如下：

PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s)，30个循环；72℃延伸10min；产物在4℃保存。扩增片段大小1697bp。用PCR纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化PCR产物。PCR琼脂糖电泳结果如图4所示。

C、EF1α-IDS片段的拼接

以胶回收的EF1α片段和IDS片段为模板，以IDS-P1和IDS-P4为引物进行两个片段的重叠PCR，PCR反应体系如下：

PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s)，30个循环；72℃延伸10min；产物在4℃保存。扩增片段大小2947bp。用PCR纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化PCR产物。PCR琼脂糖电泳结果如图5所示。

3.pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重组质粒的构建

EF1α-IDS片段通过同源重组构建到线性化载体，重组反应体系(购自天根生化科技(北京)有限公司)如下：

EF1α-IDS片段	2ul
		线性化载体	2ul
2×EasyGeno Assembly Mix	5ul
		H<sub>2</sub>O	1ul

将上述混合液于50℃，反应15min。然后42℃热击转化入DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，筛选阳性转化子，对阳性转化子进行PCR鉴定(结果如图6所示)，鉴定引物如下：

ID	序列
		IDS-P5	CTTGAGTGCTTTGGACGAT
IDS-P6	AGCGTAAAAGGAGCAACATAG

阳性转化子PCR产物大小约为798bp，将阳性克隆进行测序(测序结果如图7所示)，通过阳性克隆测序结果及结果分析，证明获得pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重组质粒(质粒图谱如图1所示)。

III.表达检测

以293T为目的细胞(293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制)，以DMEM培养基(含10％胎牛血清)为培养基，具体操作过程参考《质粒转染细胞操作手册》和《Real time PCR操作手册》(上海吉凯基因生物科技有限公司)，其流程如图8所示。引物序列如下：

Real-time PCR实验数据如下：

实验分组	内参基因Ct值	目的基因Ct值	ΔCt	-ΔΔCt	2-ΔΔCt
						CON	14.26	20.53	6.27	0.083	1.059
CON	14.18	20.51	6.33	0.023	1.016
						CON	14.12	20.58	6.46	-0.107	0.929
OE	14.14	10.88	-3.26	9.613	783.252
						OE	13.99	10.91	-3.08	9.433	691.379
OE	14.01	10.85	-3.16	9.513	730.800

Real-time PCR实验数据统计结果如下(如图9所示)：

注：

1、CON：为293T细胞样品(对照组)OE：为目的基因质粒转染293T后样品

2、2^-ΔΔCt法计算说明：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。2^-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平

结论：

经Real time PCR检测，结果说明：从定量PCR结果可以看出，293T细胞中，OE组IDS表达丰度是CON组的735.144倍(p<0.05)。

Claims (2)

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括EF1α-IDS序列；

其中，所述表达载体以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列；

其中，所述EF1α-IDS序列是SEQ ID No:1所示的序列。

2.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求1所述的表达载体。