CN105002185A

CN105002185A - 一种克隆白洗猪pid1基因cds区序列的方法

Info

Publication number: CN105002185A
Application number: CN201510499060.7A
Authority: CN
Inventors: 陈祥; 冯文武; 孙振梅; 李鹏程; 许厚强; 丁玫; 陈伟
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2015-08-14
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明公开了一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，所述方法通过对白洗猪的组织提取总RNA，逆转录为cDNA后，设计特异性引物，运用Nest-PCR技术对白洗猪PID1进行PCR扩增，PCR扩增目的片段包含白洗猪的PID1基因的完整CDS区序列及部分UTR区，最终构建pMD18-T-PID1-CDS重组质粒，并对其进行测序，测序结果与NCBI数据库中猪的PID1基因完整CDS区序列进行比对验证，为构建白洗猪的PID1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。

Description

一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，尤其是涉及白洗猪的PID1基因CDS区序列克隆技术。

背景技术

磷酸酪氨酸互作结构域1 （Phosphotyrosine interactiondomain containing 1，PID1）是2006年Wang等利用抑制性消减杂交技术从肥胖人群腹膜后脂肪组织中筛选的新基因，命名为NYGGF4，提交NCBI以后统一命名PID1，在脂肪细胞生长中扮演着重要的作用，随着研究的不断深入，已有学者提出将PID1基因作为一个胰岛素抑制导致肥胖治疗的作用靶位点。PID1 基因的结构PID1 基因在不同物种位于不同的染色体上，并且其全长、外显子以及内含子数目、转录的mRNA长度和编码氨基酸的数目都存在不同程度的差异。猪PID1基因位于15号染色体上，其转录产生的mRNA长度654 bp，编码217个氨基酸。PID1基因进化保守主要是由于该基因编码的氨基酸序列中含有一个特殊的PTB 结构域，PTB结构域属于PH结构域超家族成员，该结构域不但影响着PID1 基因的进化，同时也决定PID1 基因的功能。

现研究表明，PID1基因在小鼠中呈多组织表达特征；人的PID1基因还特异性地表达于脂肪、心脏和骨骼肌，在肥胖患儿脂肪组织中PID1的表达量能显著升高；鸡PID1具有多组织广泛表达特征，组织间表达活性差异不明显，而且鸡PID1基因在组织表达分布上比人和鼠更具广泛性；徐洪刚等发现PID1基因的表达量与IMF呈极显著正相关，相关系数为0.943。钱源（2010）对三个猪种多个组织进行了PID1 基因的mRNA表达表明，PID1基因呈多组织表达特点，且瘦肉型猪与脂肉型猪PID1基因表达存在差异，其首次克隆获得了猪PID1基因CDS序列，并对其进行了生物信息学分析，进一步讨论分析了三个猪品种间PIDI基因mRNA表达水平与IMF含量呈显著正相关。覃兆鲜等相继克隆获得了陆川猪的PID1基因CDS全长序列，并对其序列进行了生物信息学分析。崔景香（2011）运用qPCR技术对三个猪种PID1基因mRNA表达水平进行了分析，得到了与钱源相同结论，其首次构建了猪PID1基因真核表达载体，利用脂质体介导转染山羊毛囊细胞，并进行了真核表达载体鉴定。目前研究表明，在3T3-L1前脂肪细胞中，细胞中游离脂肪酸（FFA）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度能上调PID1基因的表达量，而白细胞介素-6（IL-6），瘦素（leptin）和抵抗素（resistin）等对PID1的表达起到抑制的作用，同时在3T3-L1前脂肪细胞转化成脂肪细胞的过程中也会导致PID1的表达量上调。各物种之间PID1基因组织表达研究表明，PID1基因是一个多组织表达的基因，而且不同的物种之间PID1基因的都高表达于肝脏、脂肪等与脂肪代谢有关的组织。

上述研究结果提示，白洗猪PID1基因可能与其生产水平、肉质性状等有关联。国内未见关于白洗猪PID1基因的相关研究报道，NCBI数据库中无白洗猪PID1基因序列及相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，它准确性高，为构建白洗猪的PID1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，对白洗猪的组织提取总RNA，逆转录总RNA为cDNA后，设计特异性引物，P1上游引物：AATCCCTCGGCTGGAAGATGT，P1下游引物：CGGCCAATAATTTGGCAGTCTT；P2上游引物：AAGCTTGGCTGGAAGATGTGGCAG，P2下游引物：TCTAGATCAGCCATCATCRGATTCY；运用Nest-PCR技术对白洗猪PID1进行PCR扩增，扩增产物连接于pMD18-T Vector后，构建pMD18-T-PID1-CDS重组质粒，对重组质粒进行测序，克隆白洗猪PID1基因为675bp，其中包含完整CDS区序列654bp。

由于采用了以上技术方案，与现有技术相比，本发明通过对白洗猪的组织提取总RNA，逆转录为cDNA后，设计特异性引物扩增白洗猪的PID1基因，运用Nest-PCR技术对白洗猪PID1进行PCR扩增，扩增的目的片段包含白洗猪的PID1基因的完整CDS区序列及部分UTR区，最终构建pMD18-T-PID1-CDS重组质粒，并对其进行测序，测序结果与NCBI数据库中预测的PID1基因CDS区序列进行比对验证，为构建白洗猪的PID1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料；本发明先采用Nest-PCR处理后再进行T克隆，获得序列的准确性高。

附图说明

图1为白洗猪cDNA PID1基因CDS区PCR产物电泳图。

图2为pMD18-T-PID1-CDS重组质粒PCR产物电泳图。

具体实施方式

本发明的实施例：克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法

1、白洗猪总RNA的提取及cDNA合成

取白洗猪背最长肌组织进行总RNA提取，提取方法参照Invitrogen公司TRIZOL Reagent试剂盒说明书进行，所得总RNA逆转录合成为cDNA，逆转录方法参照北京康为世纪生物科技有限公司HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。

2、白洗猪PID1基因CDS区序列引物设计

欲扩增包含白洗猪PID1基因完整CDS区654bp的mRNA序列，由于猪PID1基因在GenBank中Sus scrofa mRNA全序列尚未公布，故采用牛的PID1基因各Exon（GenBank登录号：AC_000159.1）与猪PID1基因（GenBank登录号：GU396255）各Exon进行对比拼接后，运用NCBI中Primer-BLAST在线设计引物得到外引物P1，内引物参照猪PID1（GenBank登录号：GU396255）完整CDS区序列设计引物序列P2，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息详见表1。

3、白洗猪PID1基因CDS区序列的Nest-PCR扩增

Nest PCR反应条件为

外引物P1：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，62.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，×40个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。

内引物P2：95 ℃预变性5 min；95℃变性45 s，62.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，×40个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。

PCR扩增标准体系见表2。

4、重组质粒的构建及测序

白洗猪PID1基因CDS区PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后（图1），用上海生工生物工程技术服务有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化产物按照TaKaRa公司pMD18-T Vector试剂盒说明书进行操作，采用蓝白斑法筛选克隆产物，最终提取重组质粒DNA（图2）后送生物公司测序。

5、测序结果比对及验证

重组质粒测序结果如SEQ ID NO： 1所示：

扩增目的片段长度为675bp，其中包含完整CDS区序列654bp及部分UTR区序列，其中加粗标注部分为白洗猪PID1基因完整CDS区序列，所构建的重组质粒序列与NCBI数据库猪PID1基因完整CDS区序列比对相符，说明白洗猪的PID1基因CDS区序列克隆成功。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法

<130> nm:

<160> 5

<170> PatentIn version

<210> SEQ ID NO： 1

<211> 675

<212> DNA

<213> 根据所构建的pMD18-T-PID1-CDS重组质粒测序所得。

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(675)

<223>

<220>

<221> mRNA

<400> 1

AAGCTTGGCT GGAAGATGTG GCAGCCGGCC ACGGAGCGCC TGCAGCACTT TCAGACCATG 60

CTGAAGTCTA AGTTGAATGT CCAAACACTG AAAAAGGAAC CTCTGCCAGC CGTCACCTTC 120

CATGAGCCTG AGGCCATTGA GCTGTGCACC ACCACACCCC TGATGAAGAC CAAGACTCAC 180

AGTGGATGCA AGGTTACCTA TCTGGGTAAA GTCCCCACTA CGGGCATGCA GTTTTTGTCA 240

GGCTGCACAG AAAAGCCAGT CATTGAGCTC TGGAAGAAGC ACACACTAGC CCGGGAAGAT 300

GTCTTTCCAG CCAATGCCCT CCTGGAAATC CGGCCATTCC AAGTGTGGCT CCATCACCTC 360

GACCACAAAG GTGAGGCCAC AGTGCACATG GATACCTTCC AGGTGGCTCG CATCGCCTAC 420

TGCACCGCTG ACCACAACGT GAGCCCCAAC ATCTTTGCCT GGGTTTACAG GGAGATTAAT 480

GATGACCTGT CCTACCAGAT GGACTGCCAC GCTGTTGAGT GCGAGAGCAA GCTGGAGGCC 540

AAGAAGCTGG CCCACGCCAT GATGGAGGCC TTCAAGAAGA CTTTCCACAG TACGAAGAGT 600

GACGGCCGGA TCCACAGGAA CAGCTCCTCT GAAGAGGTGT CCCAGGAGTT GGAATCCGAT 660

GATGGCTGAT CTAGA 675

<210> SEQ ID NO： 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223>根据牛的PID1基因各Exon（GenBank登录号：AC_000159.1）与猪PID1基因（GenBank登录号：GU396255）各Exon进行对比拼接后，运用NCBI中Primer-BLAST在线软件进行设计，以用于PCR扩增。

<400> 2

AATCC CTCGG CTGGA AGATG T 21

<210> SEQ ID NO. 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 3

CGGCC AATAA TTTGG CAGTC TT 22

<210> SEQ ID NO： 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>参照猪PID1基因（GenBank登录号：GU396255），运用NCBI中Primer-BLAST在线软件进行设计，以用于PCR扩增。

<400> 4

AAGCT TGGCT GGAAG ATGTG GCAG 24

<210> SEQ ID NO： 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 5

TCTAG ATCAG CCATC ATCRG ATTCY 25

Claims

1.一种克隆白洗猪PID1基因CDS区序列的方法，其特征在于：对白洗猪的组织提取总RNA，逆转录总RNA为cDNA后，设计特异性引物，P1上游引物：AATCCCTCGGCTGGAAGATGT，P1下游引物：CGGCCAATAATTTGGCAGTCTT；P2上游引物：AAGCTTGGCTGGAAGATGTGGCAG，P2下游引物：TCTAGATCAGCCATCATCRGATTCY；运用Nest-PCR技术对白洗猪PID1进行PCR扩增，扩增产物连接于pMD18-T Vector后，构建pMD18-T-PID1-CDS重组质粒，对重组质粒进行测序，克隆白洗猪PID1基因为675bp，其中包含完整CDS区序列654bp。