CN106478449A - 一种γ‑谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

一种γ‑谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种式(Ⅰ)所示γ‑谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用，本发明选用的四苯乙烯结构是个聚集诱导发光型的荧光团，具有良好的光谱稳定性以及高荧光量子产率，同时在聚集状态下不会引发荧光淬灭效应。更为重要的是是本申请所合成的探针结构更为简单，化学性质更为稳定，制备更为方便，与其它结构相似的探针相比，优选探针对γ‑谷氨酸转移酶具有极高的选择性，为研究细胞中γ‑谷氨酸转移酶的生理作用提供一种有效的研究工具。其中R1为H、 或R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。

Description

一种γ-谷氨酸转移酶荧光探针及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种检测细胞内γ-谷氨酸转移酶的荧光染料，具体涉及基于四苯乙烯的新型γ-谷氨酸转移酶类荧光探针的制备方法及应用。
(二)背景技术
γ-谷氨酸转移酶(γ-GGT；EC 2.3.2.2)广泛分布于人体各种组织细胞中，在某些组织的含量尤为丰富，比如肾小管细胞、肝脏细胞和脑毛细血管细胞中。在血细胞以及内皮细胞中也达到了检测含量。人体血清中的γ-谷氨酸转移酶主要来自肝脏，血清中的γ-谷氨酸转移酶含量可以作为肝脏疾病的诊断参数。越来越多的研究也表明γ-谷氨酸转移酶在某些癌细胞中是过量表达的，如宫颈癌细胞、卵巢癌细胞和肝癌细胞中，因此，γ-谷氨酸转移酶的含量也作为癌症诊断的一项重要的参数。目前报道的γ-谷氨酸转移酶探针大多数是基于谷氨酸或者谷胱甘肽作为反应基团。当谷氨酸或者谷胱甘肽被水解后，荧光探针的性质会发生改变。1996年，White等人报道了一类基于香豆素的荧光探针，7位上的氨基被修饰以后荧光淬灭，酶切作用以后，重新生成氨基，荧光得到释放。2014年，Hou等人利用萘酰亚胺荧光基团设计了机理类似的探针，与香豆素相同，萘酰亚胺也是ICT类的探针，4位上的氨基被修饰后荧光淬灭，与γ-谷氨酸转移酶反应后，谷氨酸与萘酰亚胺之间的酰胺键断裂，荧光得到恢复。基于四苯乙烯类染料高荧光量子产率、低细胞毒性、低淬灭性等优点，特别是具有聚集发光的独特荧光特性，我们设计并合成了一种以四苯乙烯为母核的γ-谷氨酸转移酶类荧光探针，这类探针能够成功用于γ-谷氨酸转移酶的活性检测。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种新型γ-谷氨酸转移酶类荧光探针及其制备方法与其快速、灵敏地检测谷氨酸转移酶活性的用途。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针，
其中R1为H、 R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。
进一步，优选所述γ-谷氨酸转移酶探针为下列之一：
更优选(Ⅰ-1)和(Ⅰ-2)。
本发明还提供一种所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针的制备方法，所述方法为：将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯溶于二氯甲烷中，依次加入1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、三乙胺和式(II)所示化合物，室温下反应12小时，将反应液分离纯化，获得所述式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针；
式(II)中R1为H、-CH2NH2或-NH2，R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。
进一步，优选所述式(II)所示化合物为下列之一：
进一步，式(II)所示化合物与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.25-0.3:1，优选0.25:1，所述二氯甲烷体积用量以式(II)所示化合物物质的量计为35-40mL/mmol，优选35mL/mmol；所述1-羟基苯并三唑与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比为0.6:1，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.6:1，三乙胺与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为1:1。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液，将浓缩液以体积比15:1的二氯甲烷和甲醇混合液为展开剂进行薄层层析分离，收集Rf值为0.5的目标产物；再将目标产物加入无水二氯甲烷a中，静置澄清后加入三氟乙酸，室温搅拌反应4h，反应过程TLC检测式(II)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后，旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸至无液体流出，加无水二氯甲烷b重复旋蒸几次，随后加入甲醇溶解，滴入乙醚中，析出固体，过滤，滤饼烘干，获得式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针；所述无水二氯甲烷a体积用量以目标产物质量计为0.16ml/mg，所述三氟乙酸体积用量以目标产物质量计为0.08ml/mg。
本发明还提供一种所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针在检测γ-谷氨酸转移酶中的应用，所述γ-谷氨酸转移酶为0～1000U/Lγ-谷氨酸转移酶缓冲溶液。所述的γ-谷氨酸转移酶的荧光检测的方法为：以化合物(I)作为荧光探针，与含γ-谷氨酸转移酶的PBS缓冲溶液中的γ-谷氨酸转移酶进行反应，生成荧光物质(II-1)或(II-2)，测定在激发波为360nm下的荧光强度变化，从而实现对γ-谷氨酸转移酶的检测。
本发明荧光探针的结构中以苯环上氨基与酰胺之间的转化，实现推-拉电子能力的变化，从而达到吸收光谱以及发射波谱蓝移的效果。
本发明所述二氯甲烷a和二氯甲烷b均为二氯甲烷，为了便于表述不同步骤用量不同而命名，字母本身没有含义。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明选用的四苯乙烯结构是个聚集诱导发光型的荧光团，具有良好的光谱稳定性以及高荧光量子产率，同时在聚集状态下不会引发荧光淬灭效应。更为重要的是是本申请所合成的探针结构更为简单，化学性质更为稳定，制备更为方便，与其它结构相似的探针相比，优选探针对γ-谷氨酸转移酶具有极高的选择性，为研究细胞中γ-谷氨酸转移酶的生理作用提供一种有效的研究工具。
(四)附图说明
图1为本发明中探针(I-1)的核磁氢谱。
图2为本发明中探针(I-2)的核磁氢谱。
图3为本发明中探针(I-1)的核磁碳谱。
图4为本发明中探针(I-2)的核磁碳谱。
图5为本发明中探针(I)在pH为7.4最佳激发与发射波长的测定光谱，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)，虚线表示最佳激发波长，实线表示最佳发射波长。
图6为本发明中探针(I)在不同溶剂中的荧光光谱，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)。
图7为本发明中探针(I)在不同比例的二氯甲烷和乙醇混合溶液中的荧光光谱，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)。
图8为本发明中探针(I-1-7)在pH为7.4的条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化。
图9为本发明中探针(I)在pH为7.4的条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)。
图10为本发明中探针(I)在pH为7.4的条件下与不同酶作用的荧光光谱变化，a代表探针(I-1)，b代表探针(I-2)，c代表探针(I-1)与探针(I-2)分别与失活酶以及加入抑制剂体系的作用结果。
图11为本发明中探针(I)制备流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述室温是指25℃。
实施例1探针(I-1，I-2和I-5)的合成
(1)探针(I-1)
将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-1)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-1)53mg，产率为80.3％。将化合物(III-1)(50mg，0.075mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-1)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体16mg，即化合物(I-1)，产率48.2％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图3。
化合物(III-1)
化合物(I-1)：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87–7.70(m,5H),7.63–7.45(m,6H),7.44–7.17(m,7H),4.38(qt,J＝8.7,4.0Hz,2H),3.00–2.84(m,4H),2.50(dddd,J＝19.7,15.1,12.3,7.4Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.05,169.98,144.70,143.84,143.71,140.13,138.62,137.58,137.56,131.40,131.03,128.08,127.98,126.68,125.79,119.01,118.76,116.71,114.41,112.11,54.97,51.75,31.78,25.83.
(2)探针(I-2)
将步骤(1)中化合物(II-1)改为化合物(II-2)(27.3mg，0.07mmol)，其它操作同步骤(1)，获得探针(I-2)16mg，产率48.2％。核磁氢谱见图2，核磁碳谱见图4。
化合物(III-2)
化合物(I-2)：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.45–7.23(m,7H),7.08(tdd,J＝9.6,7.4,5.8Hz,6H),7.00–6.92(m,3H),6.87(dd,J＝16.8,8.5Hz,2H),3.95(dtt,J＝19.2,5.9,3.8Hz,2H),2.55–2.43(m,4H),2.08(ddp,J＝28.1,21.0,7.1Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.23,159.36,158.43,140.40,131.61,131.25,128.82,128.64,128.53,128.25,126.83,119.02,118.97,116.68,114.39,112.10,54.57,51.99,31.94,25.96.
(3)探针(I-5)
将步骤(1)中化合物N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯改为化合物N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)，其它操作同步骤(1)，获得探针(I-5)168mg，产率50％。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.42–7.37(m,4H),7.35(dd,J＝8.0,6.7Hz,4H),7.28(ddt,J＝11.5,7.4,2.2Hz,6H),7.14–7.09(m,4H),3.41(t,J＝7.0Hz,1H),3.17–3.10(m,1H),3.07(dd,J＝12.6,3.1Hz,1H),2.80(s,2H),2.78–2.71(m,2H),2.68–2.62(m,1H),2.62–2.55(m,1H),2.49(tdd,J＝12.8,7.0,2.4Hz,1H),2.37(ddt,J＝12.6,6.9,2.9Hz,1H),2.14–2.06(m,1H),1.83(s,2H).
化合物(III-5)。
实施例2探针(I-3和I-4)的合成
(1)探针(I-3)
将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-3)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-3)43mg，产率为76.8％。将化合物(III-3)(80mg，0.1mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-3)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体46mg，即化合物(I-3)，产率80％。
化合物(III-3)
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.50(s,1H),7.41–7.37(m,2H),7.35–7.27(m,8H),7.25(d,J＝4.7Hz,6H),7.11–7.05(m,2H),4.99–4.88(m,1H),4.32–4.20(m,1H),3.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.81(td,J＝12.4,4.1Hz,1H),2.68–2.56(m,1H),2.51(ddd,J＝12.3,4.8,2.0Hz,1H),2.30(d,J＝1.5Hz,3H),2.15(tdd,J＝12.3,7.1,4.9Hz,1H),0.75(s,2H).
(2)探针(I-4)
将步骤(1)中化合物N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯改为化合物N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)，其它操作同步骤(1)，获得探针(I-4)46mg，产率80％。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.50(s,1H),7.41–7.37(m,2H),7.35–7.27(m,8H),7.25(d,J＝4.7Hz,6H),7.11–7.05(m,2H),4.99–4.88(m,1H),4.32–4.20(m,1H),3.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.81(td,J＝12.4,4.1Hz,1H),2.68–2.56(m,1H),2.51(ddd,J＝12.3,4.8,2.0Hz,1H),2.30(d,J＝1.5Hz,3H),2.15(tdd,J＝12.3,7.1,4.9Hz,1H),0.75(s,2H).
化合物(III-4)。
实施例4探针(I-6)的合成
将N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(119.2mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-1)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-6)73mg，产率为85.4％。将化合物(III-6)(70mg，0.075mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-1)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体40.2mg，即化合物(I-6)，产率87％。
化合物(III-6)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87–7.70(m,5H),7.63–7.45(m,6H),7.44–7.17(m,7H),4.38(qt,J＝8.7,4.0Hz,2H),3.00–2.84(m,4H),2.50(dddd,J＝19.7,15.1,12.3,7.4Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.05,169.98,144.70,143.84,143.71,140.13,138.62,137.58,137.56,131.40,131.03,128.08,127.98,126.68,125.79,119.01,118.76,116.71,114.41,112.11,54.97,51.75,31.78,25.83.
实施例4探针(I-7)的合成
将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(119.2mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室温反应1h后，加入化合物(II-4)(27.3mg，0.07mmol)，室温反应过夜，用旋转蒸发仪浓缩溶剂至无液体流出，浓缩液用薄层层析硅胶板(展开剂：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值为0.5的化合物(III-7)73mg，产率为85.4％。将化合物(III-7)(40mg，0.04mmol)加入到装有8mL无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室温搅拌反应4h。反应过程TLC检测式(II-4)所示化合物的含量，茚三酮显色进行追踪，完全反应后旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸，加二氯甲烷重复旋蒸几次，尽量将TFA抽干。随后加入2ml甲醇溶解剩余固体，将溶液滴入20ml乙醚中，有白色固体析出。过滤得白色固体，烘干，得淡黄色固体18mg，即化合物(I-7)，产率54％。
化合物(III-7)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.50(s,2H),7.41–7.32(m,8H),7.29(td,J＝7.2,6.8,1.9Hz,4H),7.25–7.13(m,6H),5.12–5.02(m,1H),4.76(dd,J＝12.4,1.3Hz,1H),4.32–4.25(m,1H),4.23–4.16(m,1H),3.50(t,J＝7.0Hz,1H),3.43(t,J＝7.1Hz,1H),3.39–3.28(m,3H),2.86–2.78(m,1H),2.63–2.51(m,2H),2.47–2.41(m,1H),2.33(s,2H),1.96–1.88(m,1H),1.56–1.42(m,1H).
实施例5探针(I)在pH为7.4条件下最佳激发与发射波长的测定
准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到294μL磷酸缓冲液(10mM、pH＝7.4)，测定两个混合液的激发光谱和发射光谱，结果见图5。
根据图5的结果可知探针(I-1)和(I-2)的最佳激发与发射波长均是360nm/460nm。从结果可推断出化合物(II-1)，(II-2)在与氨基酸发生反应以后会出现50nm的蓝移。
实施例6探针(I)在不同溶剂中的荧光性质
准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取4μL分别加入到294μL的甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙醇和水中，用荧光酶标仪进行荧光扫描，λex＝360nm荧光谱图见图6。
探针(I-1)和(I-2)在二氯甲烷中的荧光强度最高，在四氢呋喃和丙酮中也较强，而在水中强度比在上述非极性溶剂中低很多，说明这些探针的水溶性较好，适合用于生物检测。
实施例7探针(I)聚集诱导发光性质的测定
准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到294μL不同浓度的二氯甲烷和乙醇混合溶液中(混合溶液中二氯甲烷体积浓度分别为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％)，并测定其在360nm激发下的荧光值。荧光强度曲线见图7。
探针(I)在二氯甲烷含量在0-80％变化时，荧光强度基本保持不变，而从80-100％变化时，荧光强度急剧增加。该现象符合聚集诱导发光原理，说明该类探针具有聚集诱导发光性质。
实施例8探针(I-1～I-7)在pH为7.4条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化
为筛选得到可检测γ-谷氨酸转移酶的最佳探针，在微量离心管中分别加入适量的PBS缓冲液(pH＝7.4)，随后加入γ-谷氨酸转移酶酶液(500U/L)，最后分别加入探针I-1～I-7(20μM)，37℃反应1h后用荧光酶标仪在λex＝360nm下进行全波段扫描，荧光谱图见图8。
从图8检测结果可得出，在所有7个探针中，I-1和I-2对γ-谷氨酸转移酶有优异的响应值，而其它5个探针对该酶没有响应，证明了这两个探针具有极高的专一性。
实施例9探针(I)在pH为7.4条件下加入500U/Lγ-谷氨酸转移酶后荧光光谱的变化
准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到284μL磷酸缓冲液(10mM pH＝7.4)，分别加入γ-谷氨酸转移酶至终浓度为500U/L，37℃下反应，在不同时间点(分别为0、2、5、10、20、30、40、50、60、70min)测定其荧光值。激发波长为350nm，荧光谱图见图9。
从图9检测结果得出当γ-谷氨酸转移酶加入以后，在460nm出会迅速出现一个增强峰，这是γ-谷氨酸转移酶与探针的非特异性结合，而随着γ-谷氨酸转移酶催化水解反应的进行，在460nm处的峰下降，510nm出的荧光强度越来越高。反应进行至60min时，反应基本完全，70min时荧光增强不明显。
实施例10探针(I)在pH为7.4条件下的选择性实验
准确称取0.2g实施例1制备的探针(I-1)和(I-2)，分别用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪各吸取6μL加入到284μL磷酸缓冲液(10mM pH＝7.4)，分别加入热失活处理的γ-谷氨酸转移酶、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸失活处理的γ-谷氨酸转移酶以及胃蛋白酶、α-蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、BSA至终浓度均为500U/L。37℃下反应1小时，测定其荧光值，以不加蛋白为对照。激发波长为360nm，荧光谱图见图10。
实验证明，探针(I)的抗干扰能力十分好，即对γ-谷氨酸转移酶的专一性比较好。

Claims (7)

1.一种式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针，
其中R1为H、 R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。
2.如权利要求1所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针，其特征在于所述荧光探针为下列之一：
3.一种权利要求1所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为：将N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯溶于二氯甲烷中，依次加入1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、三乙胺和式(Ⅱ)所示化合物，室温下反应12小时，将反应液分离纯化，获得所述式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针；
式(Ⅱ)中R1为H或-NH2，R2和R3同R1，且R1、R2和R3不同时为H。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于式(Ⅱ)所示化合物与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.25-0.3:1，所述二氯甲烷体积用量以式(Ⅱ)所示化合物物质的量计为35-40mL/mmol；所述1-羟基苯并三唑与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比为0.6:1，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为0.6:1，三乙胺与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物质的量之比均为1:1。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液，将浓缩液以体积比15:1的二氯甲烷和甲醇混合液为展开剂进行薄层层析分离，收集Rf值为0.5的目标产物；再将目标产物加入无水二氯甲烷a中，静置澄清后加入三氟乙酸，室温搅拌反应4h，TLC追踪，完全反应后，旋蒸除尽溶剂和三氟乙酸至无液体流出，加无水二氯甲烷b重复旋蒸几次，随后加入甲醇溶解，滴入乙醚中，析出固体，过滤，滤饼烘干，获得式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸转移酶荧光探针；所述无水二氯甲烷a体积用量以目标产物质量计为0.16ml/mg，所述三氟乙酸体积用量以目标产物质量计为0.08ml/mg。
6.一种权利要求1所述γ-谷氨酸转移酶荧光探针在检测γ-谷氨酸转移酶中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述γ-谷氨酸转移酶为0～1000U/Lγ-谷氨酸转移酶缓冲溶液。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109206374A (zh) * 2017-07-07 2019-01-15 香港科技大学 一种具有聚集诱导发光与超分子聚合性质的四苯乙烯异构体及其制备方法和应用
CN110981742A (zh) * 2019-09-24 2020-04-10 浙江工业大学 具有聚集诱导发光性质的苯丙氨酸衍生物及其制备与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105061557A (zh) * 2015-08-18 2015-11-18 浙江大学 一种用于dpp-4检测的多肽及包含该多肽的荧光探针

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105061557A (zh) * 2015-08-18 2015-11-18 浙江大学 一种用于dpp-4检测的多肽及包含该多肽的荧光探针

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANURADHA ET AL.: "Right handed chiral superstructures from achiral molecules: self-assembly with a twist", 《SCIENTIFICREPORTS》 *
YANG LIU ET AL.: "Simple Biosensor with High Selectivity and Sensitivity: Thiol-Specific Biomolecular Probing and Intracellular Imaging by AIE Fluorogen on a TLC Plate through a Thiol–Ene Click Mechanism", 《CHEMISTRY A EUROPEAN JOURNAL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109206374A (zh) * 2017-07-07 2019-01-15 香港科技大学 一种具有聚集诱导发光与超分子聚合性质的四苯乙烯异构体及其制备方法和应用
CN109206374B (zh) * 2017-07-07 2021-11-16 香港科技大学 一种具有聚集诱导发光与超分子聚合性质的四苯乙烯异构体及其制备方法和应用
CN110981742A (zh) * 2019-09-24 2020-04-10 浙江工业大学 具有聚集诱导发光性质的苯丙氨酸衍生物及其制备与应用

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