CN106467903B - 一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法 - Google Patents

一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106467903B
CN106467903B CN201610828036.8A CN201610828036A CN106467903B CN 106467903 B CN106467903 B CN 106467903B CN 201610828036 A CN201610828036 A CN 201610828036A CN 106467903 B CN106467903 B CN 106467903B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus licheniformis
follows
pcr
application
cellulase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610828036.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106467903A (zh
Inventor
汪俊卿
韩海红
王瑞明
王腾飞
肖静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN201610828036.8A priority Critical patent/CN106467903B/zh
Publication of CN106467903A publication Critical patent/CN106467903A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106467903B publication Critical patent/CN106467903B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法。所述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及该低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法。本发明构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株，既克服了纤维素酶过高表达引起纸浆纤维的破坏，同时一定程度低产的纤维素酶能够保障半纤维素酶和木质素酶纸浆处理效果的发挥，具有广泛的应用前景。

Description

一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
制浆造纸工业是国家支柱性产业之一，但传统的制浆造纸工业也是污染大户。造纸行业的污染主要是在制浆生产过程中产生，目前，传统的制浆方法主要采用化学制浆法，而化学制浆法在制浆过程中产生大量含残余木素和化学物质的废液，正是污染的罪魁祸首。因此，彻底解决制浆造纸工业的废水污染，研制开发无污染或低污染制浆造纸的技术已经迫在眉睫。
现代制浆造纸工业的发展及其出现的一系列问题，使其与生物技术特别是微生物工程的联系日趋紧密。近十几年来，人们对生物技术在制浆造纸工业中的应用进行了大量的研究，其研究内容几乎涉及了制浆造纸工业的各个方面。生物制浆，其原理是利用具有木素降解能力的微生物(主要是白腐菌类)选择性地分解植物纤维原料中的木素。但由于木素不能做为碳源支持微生物的生长而需利用半纤维素和纤维素的分解以获得能量，因此选择无纤维素酶活的菌株就显得非常重要。同时,由于利用白腐菌处理原料的周期太长，难以满足大规模生产的要求，因而有的研究者倾向于“酶法制浆”。利用降解木素酶，在常温和常压条件下可使木片中木素去除率达到75％～80％，纸浆得率高达60％，从而降低纤维原料用量和废水污染负荷，松木和杨木木片都能用于生物制浆，尤其是阔叶材中木素通常易于被酶降解。但由于目前酶的价格昂贵，加上处理时间又长，要利用酶工程的纯生物制浆，尚难以短期内在工业生产上应用。
地衣芽孢杆菌在自然界中分布广泛，较其它木质纤维素降解微生物具有繁殖快、适应性好、木质纤维素降解能力强等特点，在天然木质纤维素降解过程中也发挥重要的作用，但由于天然地衣芽孢杆菌具有较强的纤维素降解能力，因此直接应用在制浆过程中会损伤纤维素组分，降低纤维素回收率，地衣芽孢杆菌基因组中含有十种纤维素降解相关酶，完全敲除该菌纤维素酶基因难以操作，同时考虑到不同酶系之间存在协同降解作用，纤维素酶活性完全丧失会明显抑制该菌对半纤维素和木质素的降解效果。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法。
本发明技术方案如下：
一种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；
所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述编码内切纤维素酶基因celB失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码内切纤维素酶基因celB无法表达。
上述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F1和R1进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；
所述的PCR引物序列如下：
F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG
R1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT
(2)提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cmr片段；
所述的PCR引物序列如下：
F2:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
(3)将步骤(i)制得的celB1片段与步骤(ii)制得的Cmr片段进行重叠PCR，制得celB1-Cmr片段；
(4)将敲除载体用限制性内切酶BamH I酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 20085。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下：
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增体系为：
所述的重叠PCR的补充扩增体系为：
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下：
挑取新鲜的Bacillus licheniformis 20085单菌落，培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌的EP管，制得Bacillus licheniformis 20085电感受态细胞。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，含氯霉素的培养基为含有氯霉素浓度为20～30μmol/mL的L B固体培养基。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，电转化的条件为电压1500～2000V，电击时间4～5ms。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，复苏为在35～38℃条件下于液体复苏培养基中培养3～4h，所述液体复苏培养基每升组分如下：
蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，氯化钠8～10g，山梨醇85～100g，甘露醇60～800g，蒸馏水定容至1000mL。
有益效果
1、本发明构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株，既克服了纤维素酶过高表达引起纸浆纤维的破坏，同时一定程度低产的纤维素酶能够保障半纤维素酶和木质素酶纸浆处理效果的发挥，具有广泛的应用前景；
2、本发明首次在菌株构建过程中选择性从十种纤维素酶中敲除编码内切纤维素酶基因celB，取得了通过传统发酵条件优化预料不到的技术效果——纤维素酶活性及纤维素水解能力显著下降，仅为原菌株的1/10左右，但半纤维素和木质素水解能力保留85％以上。
附图说明
图1为本发明的celB基因敲除转化子的琼脂糖凝胶电泳图；
图中泳道M为DNA分子量标记(DNA marker)，泳道1-4为转化子条带，大小为1834bp。
图2为本发明构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株发酵能力的傅里叶红外光谱分析图；
图中，830cm-1芳香核C-H、1235cm-1愈创木酚与C＝O伸缩振动、1593cm-1C-O伸缩振动、是木质素的特征吸收峰；2916cm-1木聚糖的C-H不对称伸缩振动，是半纤维素的特征吸收峰；3400cm-1为纤维素的特征吸收峰。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)20085保藏于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC20085；
穿梭质粒PHT01购自杭州宝赛生物科技有限公司；
L B固体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0～7.4。
L B培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0～7.4。
实施例1：基因敲除片段构建
1)(i)提取Bacillus licheniformis 20085DNA(采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒)，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂celB1；
所述的PCR引物序列如下：
F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG
R1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT
所述的PCR扩增体系为：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为589bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
(ii)提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cmr片段；
所述的PCR引物序列如下:
F2:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
所述的PCR扩增体系为：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1245bp,使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
(iii)将步骤(i)制得的celB1片段与步骤(ii)制得的Cmr片段进行重叠PCR，制得celB1-Cmr片段；
所述的重叠PCR的扩增体系为：
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1823bp,使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
实施例2：制备地衣芽孢杆菌感受态
(i)挑取新鲜LB固体培养基表面的Bacillus licheniformis 20085单菌落，接种于10mL GM培养基中，37℃、220r/min，过夜培养；
(ii)取1mL上述菌液转接到100mLGM培养基，37℃、220r/min培养至OD600＝0.9；
(iii)将菌液转移至100mL离心管，冰浴15-20min，使菌体停止生长；
(iv)冰浴后4℃、5000g、5min离心，收集菌体；
(v)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤2-3次；
(vi)洗涤结束后，使用1000μL电转缓冲液重悬菌体；
(vii)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。
其中，GM培养基：LB培养基+0.5M山梨醇
ETM：0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油
RM培养基：LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇
实施例3：celB1-Cmr片段电转化Bacillus licheniformis 20085
(i)将celB1-Cmr片段用限制性内切酶BamH I消化；
酶切体系(40μL)如下：
(ii)浓缩纯化酶切产物
(1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；
(2)12000r/min，离心5min得沉淀；
(3)300μL体积百分比浓度为75％的乙醇溶液重悬沉淀；
(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min；
(5)加入15～18μL ddH2O重悬DNA，并置于-20℃保存。
(iii)电转化
首先利用核酸超微量分光光度计测定celB1-Cmr片段浓度，达到349.63ng/μL浓度后进行电转化，电转化条件为电压1800V，电击时间5ms，将得到的细胞经液体复苏培养基在37℃复苏培养4h，取100μL涂布在含浓度25μmol/mL氯霉素的LB固体培养基上，在37℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子；
所述液体复苏培养基每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，山梨醇91g，甘露醇69g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例4：阳性重组菌的培养及鉴定
挑取上述阳性重组菌落，接种到含氯霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA，并以获得的基因组为模板，F1和R2为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；
所述的PCR引物序列如下:
F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG
R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
其中，下划线标识的为酶切位点
所述的PCR扩增体系为20μl：
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存，琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。
实施例5：低产纤维素酶Bacillus licheniformis工程菌在竹粉制浆预处理过程的应用
(1)菌种在35℃的条件下于活化培养基中活化培养3.5h，然后按体积百分比为1％的比例接种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌于装液量为30mL三角瓶，其中抗生素浓度为35mg/mL，培养条件为35℃、220rpm、12h，得到含低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的菌液；
活化培养基配方为(g/L)：蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化钠10，蒸馏水定容，pH7.0～7.4；121℃灭菌20min；
(2)将(1)中得到低产纤维素酶工程菌的菌液按接种量3％接种于100mL含有抗生素浓度为35mg/mL的发酵培养基中，在37℃、220rpm的条件下于摇瓶发酵培养基中摇瓶发酵4d，得到发酵液；
摇瓶发酵培养基为(g/L)：蛋白胨4、硫酸铵4、磷酸二氢钾1、七水合硫酸镁0.4、氯化钠5，蒸馏水定容；121℃灭菌20min；
(3)发酵液酶活测定
发酵24h、48h、72h、96h时取样，15000g、4℃离心10min，小心吸取上清液于预冷的EP管中，即得发酵粗酶液。
采用DNS法以羧甲基纤维素(CMC)为底物测定酶活的具体方法为：
取750μL粗酶液和750μL的CMC溶液在15mL试管中混合均匀后，于30℃反应60min；之后立刻加入3mL的DNS试剂，并将试管置于沸水浴中煮沸5min，煮沸步骤在使DNS和底物结合显色的同时，也能使酶蛋白失活，终止酶反应。之后将试管冰水混合物中冰浴，待其冷却后从反应体系中取200μL反应液，稀释于2.5mL去离子水中，并测量其OD540nm的值。
实验中，以葡萄糖为标准溶液，以每分钟生成1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。得到结果低产纤维素酶工程菌发酵液中内切纤维素酶活较原始菌株Bacilluslicheniformis 20085降低了1.36U/mL。
发酵后竹粉残渣利用傅里叶红外光谱技术检测低产纤维素酶Bacilluslicheniformis工程菌的能力。其中，830cm-1芳香核C-H、1235cm-1愈创木酚与C＝O伸缩振动、1593cm-1C-O伸缩振动、是木质素的特征吸收峰；2916cm-1木聚糖的C-H不对称伸缩振动，是半纤维素的特征吸收峰；3400cm-1为纤维素的特征吸收峰。由图2看出：低产纤维素酶Bacillus licheniformis工程菌纤维素水解能力显著下降，而半纤维素和木质素水解能力保留85％以上。

Claims (11)

1.一种地衣芽孢杆菌工程菌在造纸制浆过程中的应用， 所述地衣芽孢杆菌工程菌为将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
所述地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：
（1）提取地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F1和R1进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；
所述的PCR引物序列如下：
F1: CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG
R1: AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT
（2）提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cmr片段；
所述的PCR引物序列如下：
F2: ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA
R2: CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
（3）将步骤（i）制得的celB1片段与步骤（ii）制得的Cmr片段进行重叠PCR，制得celB1-Cmr片段；
（4）将敲除载体用限制性内切酶BamH I酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌；
所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 20085。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增体系如下：
2×HiFi-PCR master 25μL
浓度10μmol/L的F1 2μL
浓度10μmol/L的R1 2μL
模板 2μL
ddH2O 19μL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增体系如下：
2×HiFi-PCR master 25μL
浓度10μmol/L的F1 2μL
浓度10μmol/L的R1 2μL
模板 2μL
ddH2O 19μL。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，重叠PCR的初次扩增体系为：
2×HiFi-PCR master 12.5μL
celB1 2μL
Cmr 2μL
ddH2O 8.5μL
所述的重叠PCR的补充扩增体系为：
2×HiFi-PCR master 12.5μL
浓度10μmol/L 的F1 2μL
浓度10μmol/L的R2 2μL
ddH2O 8.5μL。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下：
挑取新鲜的地衣芽孢杆菌20085单菌落，培养至菌体浓度OD 600为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌的EP管，制得地衣芽孢杆菌20085电感受态细胞。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，含氯霉素的培养基为含有氯霉素浓度为20～30μmol/ mL的L B固体培养基。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，电转化的条件为电压1500～2000 V，电击时间4～5 ms。
11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，复苏为在35～38℃条件下于液体复苏培养基中培养3～4h，所述液体复苏培养基每升组分如下：
蛋白胨8～10 g，酵母浸粉3～5 g，氯化钠8～10g，山梨醇85～100g，甘露醇60～800g，蒸馏水定容至1000mL。
CN201610828036.8A 2016-09-18 2016-09-18 一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法 Active CN106467903B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610828036.8A CN106467903B (zh) 2016-09-18 2016-09-18 一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610828036.8A CN106467903B (zh) 2016-09-18 2016-09-18 一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106467903A CN106467903A (zh) 2017-03-01
CN106467903B true CN106467903B (zh) 2019-10-08

Family

ID=58230625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610828036.8A Active CN106467903B (zh) 2016-09-18 2016-09-18 一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106467903B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611293B (zh) * 2018-04-24 2021-05-18 上海锴晨实业有限公司 一种生物酶制浆过程中生物酶菌种配方和配制方法
CN111848759B (zh) * 2020-07-27 2022-03-29 齐鲁工业大学 一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1659283A (zh) * 2002-04-10 2005-08-24 诺维信公司 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞
CN103540539A (zh) * 2013-09-27 2014-01-29 中国科学院成都生物研究所 一种微生物除臭菌剂、其制备方法及其应用
CN105802985A (zh) * 2016-04-18 2016-07-27 齐鲁工业大学 一种快速实现地衣芽孢杆菌基因敲除的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1659283A (zh) * 2002-04-10 2005-08-24 诺维信公司 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞
CN103540539A (zh) * 2013-09-27 2014-01-29 中国科学院成都生物研究所 一种微生物除臭菌剂、其制备方法及其应用
CN105802985A (zh) * 2016-04-18 2016-07-27 齐鲁工业大学 一种快速实现地衣芽孢杆菌基因敲除的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION:AM183790.1;Waldeck,J.et al.;《GenBank》;20160714;1-2 *
一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌基因敲除方法及应用;韩海红 等;《中国生物工程杂志》;20161130;第36卷(第11期);63-69 *
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）外切葡聚糖酶CelB基因的发掘及功能鉴定;庞浩 等;《生物技术通报》;20130930(第9期);151-157 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106467903A (zh) 2017-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cao et al. Screening of pectinase producer from alkalophilic bacteria and study on its potential application in degumming of ramie
CN103352013B (zh) 木质纤维素降解复合菌系及其应用
CN105802985B (zh) 一种快速实现地衣芽孢杆菌基因敲除的方法
JP7019926B2 (ja) セルラーゼとキシラナーゼとを生産するための変異株クロストリジウム・サーモセラムおよびその調製方法
CN105567609B (zh) 一株耐高温园林废弃物分解菌st2及其应用
CN106467903B (zh) 一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法
CN102978220B (zh) 环氧化物水解酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用
CN104860401B (zh) 一株米根霉菌株jhsw01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用
CN103911334B (zh) 一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用
Lü et al. Characterization of the effective cellulose degrading strain CTL-6
Kumar et al. Production of Cellulase Enzyme by Trichoderma reesei Cef19 and its Application in tlie Production of Bio-etlıanol
WO2021029828A1 (en) Talaromyces pinophilus strain for producing cellulolytic enzymes
CN108103036A (zh) 一种新型漆酶及其基因、工程菌、制备与应用
CN105176838B (zh) 一株黑曲霉菌株及发酵菌剂及其应用
CN101307295A (zh) 表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌株
CN110527634A (zh) 一株西藏来源生产纤维素酶的哈茨木霉菌株及其应用
Sadhu et al. Characterization of a Bosea sp. strain SF5 (MTCC 10045) isolated from compost soil capable of producing cellulase
Sakka et al. Cloning and expression in Escherichia coli of Clostridium stercorarium strain F-9 genes related to xylan hydrolysis
CN105274112A (zh) 一种在酸性条件下诱导表达的启动子
CN105543250B (zh) 亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用
CN111996123B (zh) 一种内生真菌红绶曲霉及其应用
CN104818220B (zh) 一株从腐烂秸秆中筛选获得的米根霉菌株jhsw01
Wang et al. The FPase properties and morphology changes of a cellulolytic bacterium, Sporocytophaga sp. JL-01, on decomposing filter paper cellulose
LIU et al. The character of normal temperature straw-rotting microbial community
CN115404172B (zh) 塔宾曲霉菌株Yw-4及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant