CN106442988A - 产肠毒素大肠杆菌etec f4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶n功能结合域 - Google Patents

产肠毒素大肠杆菌etec f4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶n功能结合域 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术和兽医学技术领域。具体涉及产肠毒素大肠杆菌ETEC F4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶N功能结合域，本发明提供能够识别ETEC F4三种血清型主要功能性亚基FaeG的宿主受体蛋白结合结构域的氨基酸序列。本发明确定了APN与FaeG蛋白互作的功能结合域，为进一步探讨APN的作用机理和F4三种血清型的不同致病机制奠定了基础。

Description

产肠毒素大肠杆菌ETEC F4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶N功能 结合域
技术领域
本发明属于分子生物学技术和兽医学技术领域。具体涉及产肠毒素大肠杆菌ETECF4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶N的验证及其功能结合域的确定。更具体地说，本发明提供能够识别ETEC F4三种血清型主要功能性亚基FaeG的宿主受体蛋白结合结构域的氨基酸序列。本发明中的蛋白结合结构域可以用作区别和研究不同血清型ETEC F4感染的依据，以及用作以APN为靶标筛选和研制F4受体模拟类似物和新型多肽疫苗的工具。
背景技术
新生和断奶仔猪腹泻是全球范围内影响养猪业发展最为普遍的胃肠道疾病，主要与产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4(或K88)在仔猪肠道内的黏附、定植和感染有关，该病原不仅能够引发仔猪黄痢、白痢、水肿病和断奶仔猪腹泻等多种疾病，还易混合、并发和继发多种疾病感染。ETEC F4病原菌有ab、ac、ad三种血清型变异株，其中以F4ac最为常见。这三种血清型F4大肠杆菌在肠道细胞黏附力、黏附素faeG基因和致病性上具有一定的差异。研究发现，ETEC F4能否特异性结合猪小肠黏膜上皮细胞，取决于猪小肠黏膜上有无相应的受体，无F4受体的猪表现为抗性，不会感染F4大肠杆菌发病；而有受体的猪则表现为易感，在感染F4大肠杆菌后发病。
自1975年以来，有关F4菌毛受体的相关基因和蛋白陆续被报道：Gibbons等研究发现，F4ac受体由一对等位基因控制，符合孟德尔遗传定律，即呈显隐性遗传模式，其中显性基因S表现为有受体，隐性基因s表现为无受体。Edfors等将F4ac的受体基因准确定位于猪13号染色体q41区域，与Tf基因座仅相差7.4厘米并与F4ab受体基因紧密连锁(θ＝0.01，Z＝41.06)。等采用与Edfors定位F4ac受体基因所用的同一家系的猪进行实验，通过微卫星标记技术将受体基因定位在SSC13q41的SW207、S0075和Sw225之间，并进一步证实黏液素4(MUC4)基因内含子7的一个多态性突变位点(SNP)与大肠杆菌F4ac的易感性呈现表型共分离。2009年1月，Andersson、和Vogeli等带领各自团队联合开展精细定位，将F4ac受体基因所在区域由原来的26Mb缩短至14Mb，即SSC13q41的Sw207-S0075区域，并提出该受体基因最有可能位于Sw207-MUC4区域的设想。因此，MUC4基因很可能是大肠杆菌F4ac黏附易感性的一个极其重要的功能位置候选基因。但是，江西农业大学黄路生研究组发现MUC4基因标记在构建的白色杜洛克×二花脸资源家系始祖动物中没有多态性，而F2家系个体中有着充分分离的F4ac黏附表型，这表明该SNP标记只是与F4ac受体基因因果突变(causative mutation)呈一定连锁不平衡的分子标记，不能解释所有群体的F4ac受体遗传基础。Goetstouwers等和Rasschaert等的研究也发现，MUC4的分型与猪F4ETEC黏附分型结果并不完全一致，并进一步提出了存在其他受体基因或蛋白的假设。
中国农业大学张勤研究组以久仰香猪(抗性猪)、剑白香猪和长白猪为研究材料，采用差异显示技术，通过对比分析抗性个体和易感个体的表达谱带，筛选到了5条抗性相关特异性表达的EST。施启顺研究组则分析了沙子岭猪和约克夏猪对ETEC F4三种抗原型的黏附差异，并对13号染色体与ETEC F4受体基因相连锁的两个微卫星标记S0223和S0068在沙子岭猪和约克夏猪的遗传差异性进行了研究。黄路生研究组根据比较基因组学和生物信息学分析结果，在ETEC F4ac受体基因所在的SSC13q41区域选择了MUC4、MUC13、MUC20和TFRC4个位置候选基因，并完成了对这些基因的染色体定位、多态位点鉴别及其与ETEC F4黏附表型的关联性研究。
但是，选择并鉴别真正的受体基因或候选蛋白仍然是研究的难点和关键，而对于已经发现的受体基因和蛋白，也仍然缺乏直接有效的方法和证据来进行鉴别。以MUC13和MUC20为例，学者们对于这两种基因以及所表达的蛋白在F4ac受体表型分类中所发挥的作用有较大的分歧。Schroyen等研究发现，由于脂肪酸结合蛋白(FABP2)的表达可以反映小肠黏膜上皮的状态，而胰岛调节蛋白(PAP)的表达则可以作为鉴定肠道炎症的标准。利用这两种蛋白对应的基因IFABP和REG3A作为看家基因进行荧光定量PCR，可以同时监测肠道内MUC13和MUC20蛋白的表达。结果表明，MUC13和MUC20两种基因的表达在不同表型猪的个体之间没有明显差异，这说明MUC13和MUC20基因与猪F4ac的黏附表型没有直接的关联。Goetstouwer等也证实，MUC4和MUC13与ETEC F4ab/ac的易感性分型并不相关。而陈一杰等认为，MUC13基因存在两种拷贝类型：MUC13-A和MUC13-B，两者在内含子2上存在突变，而ETEC F4ac与猪小肠的黏附取决于MUC13-B的变异。Ren等研究发现，F4ac黏附表型与MUC13-A和MUC13-B都密切相关，其中MUC13-B含有一个独特的O-糖基化位点可与细菌结合，而所有易感动物至少携带一个MUC13-B等位基因。Zhou等研究表明猪的ITGB-5(integrin beta-5)和MUC13基因在保护肠道黏膜抵抗病原菌ETEC感染中具有重要的作用。
猪源氨肽酶N(APN)是一种含有Zn2+的膜结合型外肽酶，从属于依赖锌离子的金属蛋白酶M1家族，分子量约为150KDa，广泛存在于多种组织和细胞中，尤其在小肠黏膜上可高效表达。该蛋白已被证实是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。Goetstouwers等报道称，猪源APN基因多态性和表达量与F4ETEC的易感性并不完全相关，并提出假设，F4与APN关联的差异性依赖于碳水化合物结构的修饰。Erickson和Melkebeek等的研究发现，APN与菌毛黏附的刷状缘受体之间具有类似的特性，它们都有能够构成糖轭合物特殊的碳水化合物结构。而利用某种特殊的神经氨酸酶处理刷状缘细胞后，受体的α2,3,6,8唾液酸结合位点发生了明显的变化，表现为其与肠道内F4ac菌毛的黏附明显减少。进一步的实验表明，N-糖苷酶F可以去除刷状缘受体N端的糖链，从而减少受体与F4ac菌毛的黏附，而高甘露糖型的内切糖苷酶H仅能去除非唾液酸化的N端糖链，其对受体与F4ac菌毛的黏附没有影响。这一结果表明，APN与F4ac菌毛的黏附是通过唾液酸结合凝集素和APN的唾液酸残基共同作用完成的。Melkebeek等研究证实，APN可以促进小肠上皮细胞内吞F4ac菌毛，并且在没有佐剂或辅助性物质存在的情况下，也可以引起肠道强烈的黏膜免疫反应，并产生数量较多的IgA、IgG抗体，甚至连初次免疫后产生的IgM抗体也可检测到。而即使是远低于可检测水平的APN也可以促进肠上皮细胞的吞噬作用，并能够诱导一定的免疫应答。这一结果表明APN是疫苗抗原靶向穿越上皮屏障的作用靶标。本发明旨在证明APN是ETEC F4菌毛的直接受体蛋白基础上，通过确定APN与F4菌毛发生相互作用的功能结合域，为进一步研究三种血清型F4的致病机制和防治措施提供工具，同时，为开发APN蛋白多肽制品和研制新型疫苗奠定基础和平台。
发明内容
本文申请建立在自主获得APN基因、制备APN多克隆抗体和明晰ETEC F4菌毛特性的基础上，利用蛋白-蛋白互相作用的原理，通过酵母双杂交、Pull-down和Western blot等方法验证APN蛋白和F4菌毛主要亚单位FaeG蛋白间的相互作用，为APN蛋白与菌毛蛋白的直接互作提供证据，同时，探讨并证明APN蛋白能够影响F4大肠杆菌的体外黏附。更重要的是，在确定APN蛋白与F4菌毛蛋白互作的功能性结合域基础上，分析比较不同血清型F4结合结构域的差异，为进一步研究F4三种血清型的致病机制提供佐证；同时，以获得的APN结合结构域对应多肽序列为靶标，进行后续多肽制品和疫苗的开发。
ETEC F4受体基因可被精细定位于猪染色体SSC13q41区域，并与MUC4基因密切相关。根据MUC4基因内含子7在限制性内切酶Xba I作用下所表现出的多态性，可以在基因水平上将所检测的猪分为易感型纯合子SS，易感型杂合子SR和抵抗型RR。结合新鲜屠宰猪肠道刷状缘细胞的黏附表型结果筛选目的样本，选取基因分型结果和细菌黏附实验结果相一致的易感型猪进行后续实验。提取样本猪空肠RNA后PCR获得APN的全长基因，体外表达、纯化APN蛋白，免疫小鼠并制备相应的多克隆抗体。利用Red同源重组的方法构建F4+ETECΔfaeG缺失株，同时构建携带fae全操纵子基因表达的SE5000重组菌，检测APN蛋白与F4三种血清型大肠杆菌不同菌株的凝集反应；并利用细菌黏附、细菌黏附抑制(F4单克隆抗体或APN多克隆抗体预处理细胞)、酵母双杂交、pull-down等实验证明APN能够影响细菌和细胞的黏附，且FaeG亚单位蛋白与APN蛋白之间存在直接的蛋白互作。
在此基础上，以未处理的IPEC-J2/Caco-2细胞作为对照，利用筛选获得的APN过表达细胞系pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2和APN沉默细胞系pcDNATM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2进行细胞黏附实验，证明APN表达量的高低能够直接影响细胞对细菌的黏附。
利用重叠多肽阵列技术高通量筛查APN与F4ab、F4ac、F4ad菌毛FaeG亚单位的互作位点，并结合Pull-down、Western-blot、ELISA等技术手段对多肽进行验证，确定了APN蛋白与菌毛(FaeG蛋白)发生作用的功能性结合域和靶标多肽序列，其中，主要识别F4ab的是TITTTAAITLDQSKPWNRY(SEQ ID NO.1)、ATFNITLIHPNNLTALSNM(SEQ ID NO.2)、VINRAQVIYDSFNLATAHM(SEQ ID NO.3)；主要识别F4ac的是ATFNITLIHPNNLTALSNM(SEQ IDNO.4)、WIVPISSIKNGVMQDHYWL(SEQ ID NO.5)、VINRAQVIYDSFNLATAHM(SEQ ID NO.6)、VLRGVGDSQVPEIDRT(SEQ ID NO.7)和GVTRRFSSEFELQQLE(SEQ ID NO.8)；主要识别F4ad的是TITTTAAITLDQSKPWNRY(SEQ ID NO.9)、ATFNITLIHPNNLTALSNM(SEQ ID NO.10)、VINRAQVIYDSFNLATAHM(SEQ ID NO.11)。
本发明公开了猪源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.1-3所示的多肽作为识别ETECF4ab的功能性结合域和靶标的用途。
公开了猪源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.4-8所示的多肽作为识别ETECF4ac的功能性结合域和靶标的用途。
公开了猪源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.9-11所示的多肽作为识别ETECF4ad的功能性结合域和靶标的用途。
本发明还公开了猪氨肽酶N作为靶标在筛选和研制产肠毒素大肠杆菌ETEC F4受体模拟类似物和多肽疫苗中的应用。
本技术存在以下优势和特点：
1.本研究首次证明猪源氨肽酶N(APN)是大肠杆菌F4菌毛的直接受体蛋白：FaeG不仅是F4菌毛有效的黏附功能亚基，也是候选受体蛋白APN作用的靶点；APN-FaeG蛋白间存在直接的互作，且APN能够影响F4大肠杆菌的黏附。
2.确定了APN与FaeG蛋白互作的功能结合域，为进一步探讨APN的作用机理和F4三种血清型的不同致病机制奠定了基础。同时，考虑到配体-受体的相互作用是阐明疾病发病机制的关键，通过病原菌和宿主受体特异性的相互作用来进行疾病治疗是一个很有前景的抗感染策略。因此，以APN蛋白作为靶标开发F4受体模拟类似物，可以用来减少F4菌与宿主细胞的黏附和定植，预防ETEC F4的感染。
附图说明
图1：不同种类猪MUC4intron 7基因的酶切鉴定结果
M:100bp plusⅡDNA Marker；1-11为不同种类猪DNA样品的酶切产物。
图2：猪的ETEC F4黏附表型结果对比((a)抵抗型；(b)弱黏附型；(c)黏附型)。
图3：不同种类大肠杆菌F4与IPEC-J2和Caco-2细胞黏附实验对比。
图4：不同血清型F4大肠杆菌与猪小肠刷状缘细胞的黏附对比。
图5：不同浓度F4单抗和APN多抗处理后的IPEC-J2、Caco-2细胞与F4+细菌的黏附实验。
图6：酵母双杂交实验验证APN-FaeG相互作用
样品1-3：F4ab FaeG-APN；样品 4-6：F4ac FaeG-APN；7-9：F4ad FaeG-APN；
N＝阴性对照；P＝阳性对照。
图7：Western-blot验证APN-FaeG蛋白的相互作用。
图8：流式细胞术验证不同细胞对ETEC F4细菌的内化作用。
图9：比较IPEC-2和Caco-2不同细胞系与ETEC F4细菌的黏附实验。
图10：FaeG蛋白的多肽阵列膜杂交反应结果。
图11：APN蛋白的多肽阵列膜杂交反应结果。
图12：FaeG蛋白的结合位点分析。
图13：APN蛋白的结合位点分析。
图14：多肽应用的共聚焦检测，图B中每组对应的标号从左至右为：4201、4301、4401、4501、5401、5501、5601、5701、5801、6001、8001、8101、9101、mix、APN。
图15：多肽应用的ELISA检测。其中每组对应的标号从左至右为：4201、4301、4401、4501、5401、5501、5601、5701、5801、6001、8001、8101、9101、mix、APN。
具体实施方式
1、根据NCBI基因库(GenBank)发表的猪MUC4基因参考序列(DQ848681)设计合成一对引物MUC4-N7Up 1/Lo 1(SEQ ID NO.12:5’-GTGCCTTGGGTGAGAGGTTA-3’,SEQ ID NO.13:5’-CACTCTGCCGTTCTCTTTCC-3’,367bp)，以送检的新鲜屠宰猪的小肠提取的DNA样品为模板，扩增猪源MUC4内含子7基因大小为367bp的片段，反应条件为：95℃5min；95℃1min，63℃1min，72℃1min(30cycles)；72℃10min。纯化PCR产物后进行Xba I酶切鉴定，其中抵抗型个体所对应的的基因片段不能被Xba I酶切，如图1中泳道1-4，而易感型个体的基因片段则可以被酶切分为151bp和216bp两个片段，如图1泳道5-11。
2、刷状缘大分子(BBV)细胞的制备：取新鲜屠宰猪的约20cm的小肠放置于PBS(0.05％叠氮钠，0.2mM PMSF，pH 7.5)溶液中(冰上预冷)；用注射器冲洗肠道后，以载玻片刮取肠粘膜；用冰预冷的PBS洗涤刮取的肠粘膜，200g×10min，洗4次(直至肠细胞沉淀干净)；将沉淀重悬于100mL 5mM NaHCO3(0.05％叠氮钠，0.2mM PMSF，pH 8.0-8.2)，使用研磨器上下研磨40次；450g离心12min；沉淀用45mL分离液(0.5mM EDTA，0.05％叠氮钠，0.2mMPMSF)重悬，研磨10-20次；沉淀用30mL相同的buffer重悬，300g离心10min，至少洗涤4次；再用30mL Mg2+buffer(10mM MgCl2，0.05％叠氮钠，0.2mM PMSF)重悬沉淀，研磨10-20次；沉淀加200mL Mg2+buffer重悬，4℃静置30-60min；制作滤器：将羊毛酯(1g/10mL)放入10-30mL漏斗中，用buffer润湿；将上清通过羊毛酯过滤(去除细胞核)；滤液使用450g离心12min；用20μL final buffer(含0.05％叠氮钠)重悬沉淀，小样分装后储存于-80℃。
取上述仔猪空肠BBV细胞悬液，加入等体积的F4菌液和1％D-甘露糖溶液，37℃孵育1h并轻轻摇动；将混合液取出后500rpm离心5min，用PBR缓冲液重新悬浮，离心洗涤4次，再用1mL PBR缓冲液悬浮细胞团块，取50μL悬浮液滴于洁净的玻片上，自然干燥，火焰固定，用美兰染色3-5min，油镜下观察。判型标准：计数5个不同视野中的20个或以上刷状缘，并记下每一个刷状缘结合的细菌个数，再对其判型。若10％以上刷状缘至少有2个细菌粘附，则判为粘附型，如图2(a)所示；若至少有两个细菌粘附的细胞不到10％，但有1-2个细菌的粘附刷状缘多于10％，则判定为弱粘附型，如图2(b)所示，否则则为不粘附型，如图2(c)所示。
3、F4菌毛蛋白的制备：配制MME培养液(MgSO4·7H2O 1g、柠檬酸·H2O 10g、K2HPO4·H2O 65.5g、Na(NH4)HPO4 11.47g，定容至500mL，加NaOH约250μL调至pH7.0)。高压灭菌后，在加入菌液之前，还应在每250mL已配制好的溶液中加入8mL维生素VB1(1mg/mL)、250μL VB5(5mg/mL)、2.5mL20％甘油，充分混匀。由于细菌在该培养液中生长速度较慢，因此可以适当提高所加入的维生素和甘油的比例，促进细菌进一步增殖。取传代后并维持在对数期生长的菌液4mL，加入混匀后的MME培养基中振荡培养72h。取出菌液后8000rpm离心20min，弃上清，保留沉淀；用10mL 0.5mM Tris-HCl+75mM NaCl混合液悬浮沉淀，8000rpm离心20min，弃上清，保留沉淀；加入20mL 0.5mM Tris-HCl，60℃水浴作用1h，8000rpm离心30min，取上清；滴加饱和(NH4)2SO4至终浓度为20％，4℃过夜；取出后10000rpm离心40min后弃去上清，用TBS悬浮沉淀，装入处理好的透析袋中放入TBS缓冲液中透析过夜；PEG 2000浓缩后取出，-20℃保存。
4、细菌黏附实验：调整所培养IPEC-J2、Caco-2细胞的状态，传代3-5次待其进入对数生长期，完全消化后铺96孔板；同时接种细菌于LB培养液中，次日将种子液1:100转接于新鲜的LB培养液中；通过一次或二次转接活化细菌，待其进入对数期生长时(OD600＝3-4)，吸取OD600＝1时对应体积的菌液，4500rpm离心10min；吸净培养基，再用细胞培养液500μL充分悬浮，将对数期生长的细菌按100:1的比例(100μL)加入至96孔板中生长的细胞单层，在37℃，6％CO2细胞培养箱中共孵育1h；然后用PBS将未与细胞黏附的细菌冲洗干净；每孔加入200μL 0.5％TritonX-100溶液，37℃培养30min以裂解细胞；充分吹匀后吸出液体，并取300μL PBS充分冲洗培养孔，然后按1:10的比例进行梯度稀释，选取10-3和10-4稀释度对应的混合液涂布LB平板，37℃培养过夜，次日进行单菌落计数。同时，按照仔猪黏附分型实验的方法进行F4三种血清型大肠杆菌与BBV细胞的黏附实验，包括野生菌，ΔfaeG缺失株，以及体外表达fae操纵子的重组菌，具体见图3、图4。由图中可知，体外表达fae操纵子的重组菌的黏附能力最强，ΔfaeG缺失株的黏附能力最弱。
调整所培养的IPEC-J2、Caco-2以及相应的pcDNATM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2和pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2细胞的状态，传代3-5次待其进入对数生长期，完全消化后铺96孔板；按照前述方法进行操作，最后选取10-3和10-4稀释度对应的混合液涂布LB平板，37℃培养过夜，次日进行单菌落计数，具体见图9。由图中可知，APN蛋白的表达量高低能够显著影响细胞黏附细菌的能力，且pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2细胞的细菌黏附数最高，而pcDNATM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2细胞的细菌黏附数最低。
细菌黏附抑制实验：用F4+单抗、不同稀释度的APN多抗与96孔板上的细胞共孵育1h，然后再按照常规黏附实验步骤进行操作，细菌计数的方法与黏附实验相同，具体见图5。由图中可知，F4单抗和APN多抗的处理均能显著降低细胞对细菌的黏附能力。
5、酵母双杂交实验验证APN-FaeG相互作用：按照MATCHMAKER GAL4Two-HybridSystem 3User Manual(clontech)重组方法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-FaeG及待检测质粒pGADT7-APN共转化酵母AH109菌株，菌液涂布于SD/-Trp/-Leu培养基，30℃暗培养3-5天，待平板上长出直径2mm的酵母菌落，挑取单菌落溶于10μL 0.9％NaCl中，滴加在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+3mM 3’AT平板上培养3-5天，观察生长状况。将阳性克隆挑转移至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal平板上培养3-5天，拍照留存。由图6的结果可知，F4ab对应样品1-3，F4ac对应样品4-6，F4ad对应样品7-9和阳性对照样品P一样均能够在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal平板上生长，而阴性对照样品N和空白对照样品均无法正常生长。
按照PierceTM GST Protein Interaction Pull-Down Kit(Thermo)方法进行操作：25℃条件下，0.1mM IPTG诱导构建获得的pGEX-6p-1-FaeG，待OD600≥1.0时，取5mL菌液到收集管中，5000g离心5min，弃去上清；用1mL/5mL TBS缓冲液重悬沉淀，取1mL混悬液至指形管中，同上离心，弃去上清；再用预冷的200μL TBS重悬沉淀，添加适量的蛋白酶抑制剂；再加200μL Pull-down Lysis buffer至离心管中，混匀后冰上孵育30min，颠倒混匀后12,000g离心5min，吸取上清裂解液备用；同时按照相同的操作收集pET28a(+)-APN蛋白上清液备用；准备1:1混匀的TBS和Pull-down Lysis buffer作为洗液，8mL/次；取50μL/支吸附用填充料填入吸附柱中，再加入400μL/支洗液，上下颠倒几次，放回离心管中，1250g离心30-60s，重复洗5次；将带有GST标签的FaeG蛋白上清加入吸附柱中，4℃轻柔振摇30min，再次转入离心管，同上离心；加入400μL/支洗液，上下颠倒几次，放回离心管中，1250g离心30-60s，重复洗5次；再加入800μL带有His标签的APN蛋白，4℃轻柔振摇1-2h，再次转入离心管，同上离心；加入400μL/支洗液，上下颠倒几次，放回离心管中，1250g离心30-60s，重复洗5次，弃去液体；配制10mM谷胱甘肽洗脱缓冲液(3.1mg谷胱甘肽加入1mL TBS缓冲液中，调pH为8.0)；在吸附柱中加入250μL洗脱液，轻柔振摇5min，1250g离心30-60s收集液体。注意所有操作均在冰上进行。将上步收集的液体经15％SDS-PAGE电泳后，利用湿转法转至NC膜上，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液4℃过夜封闭，用PBST洗涤3次，5min/次；再分别与鼠抗APN多克隆抗体(1:1000)和F4+单抗(1:1000)在4℃共孵育1-2h，同上洗涤后再和HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:5000)4℃共孵育1h，同上洗涤；取出后与ECL发光液共孵育3-5min，取出沥干后，进行曝光扫描，拍照保存，具体见图7。由图中可知，带有GST标签的F4FaeG蛋白能够与APN蛋白发生直接的作用。
6、流式细胞术验证不同细胞对ETEC F4细菌的内化作用：提前一天铺布单层细胞，将荧光标记后的细菌与细胞4℃共孵育1h左右，利用37℃预热的PBS进行洗涤，洗涤4次，除去未结合的细菌；再放入37℃培养箱中作用30min，使细菌胞吞进入细胞，用3％的低聚甲醛固定后，收集细胞(106/mL)；加入PI荧光抗体至终浓度为50μg/mL，冰上避光孵育30min；用染色缓冲液(PBS 900mL，FBS 50mL(终浓度5％)，4％NaNO3 50mL(终浓度0.2％))冲洗2次去除未结合的抗体，300g离心5min，小心弃去上清；用100μL染色缓冲液重悬细胞，铜网过滤后4小时内利用流式细胞仪分析染色结果，具体见图8。由图中可知，APN蛋白的表达量和细胞内化细菌的能力呈现正相关，即pEC129-APN IPEC-J2细胞内化细菌的能力最强，而pcDNATM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2细胞内化细菌的能力最弱。
7、FaeG蛋白和APN蛋白的功能结合位点分析：根据多肽阵列设计原理，选用F4三种血清型的FaeG蛋白序列和APN蛋白序列分别作为靶标，以3个aa的步移，13个aa的多肽长度设计合成多肽阵列。以F4ab FaeG蛋白(长度为286aa)为例，阵列共计包含93个多肽点；取F4ac FaeG蛋白中aa变异区段设计阵列，可得56个多肽点；取F4ad FaeG蛋白中aa变异区段设计阵列，可得56个多肽点；因此，一个FaeG蛋白阵列共计205个多肽点。APN蛋白按照同样的方法设计阵列，可得318个多肽点；分别合成至少三个阵列用于后续实验。将干燥的多肽阵列膜从-20℃取出后，置于无水乙醇中震荡洗涤3次，5min/次，使多肽阵列得以充分活化；将活化后的多肽阵列膜放入洁净的平皿中，使用TBST溶液震荡洗涤3次，10min/次；将平衡后的多肽阵列膜放入洁净的平皿中，加入封闭液，室温震荡封闭4h后，使用TBST溶液震荡洗涤3次，5min/次；用封闭液稀释纯化的诱饵蛋白溶液，获得终浓度1μg/ml的诱饵蛋白反应液，将多肽阵列膜与上述反应液4℃震荡孵育过夜或室温震荡孵育至少2h；使用TBST溶液震荡洗涤3次，10min/次；再用封闭液稀释一抗(针对诱饵蛋白的抗体)溶液，稀释比例为1:500，与多肽阵列膜室温共孵育2h；阴性对照中，多肽阵列膜与封闭液孵育2h；使用TBST溶液震荡洗涤3次，15min/次；用封闭液稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，稀释比例为1:5000-1:10000(可根据抗体说明书推荐使用稀释度调整)，与多肽阵列膜室温共孵育2h；使用TBST溶液震荡洗涤3次，15min/次；弃去多肽阵列膜上多余的缓冲溶液，在膜上滴加ECL化学发光反应液，反应液完全覆盖膜片表面后充分反应2-5min，保持膜片湿润；将膜片放入化学发光检测仪中扫描膜片上发光斑点，扫描保存图片。成像图片使用Total Lab图像分析软件分析显色点光密度值，使用软件中“Spot Edge Average”算法，以每个显色点周边背景值为参照，计算每个显色点的光密度值以辨别阳性显色点。
制备pEC129-APN-IPEC-J2细胞爬片(细胞密度在60％-70％)，次日将细胞爬片分别与基础培养基稀释的1mL多肽溶液(浓度为10-6mol/L)共孵育，37℃孵育30min；用基础培养基轻柔洗涤爬片，2mL/次，洗涤3次；再用4％预冷的多聚甲醛室温固定20min，自然风干；用DAPI染核10-15min，使细胞核染为蓝色，用PBS充分洗涤，封片后进行TCS SP8STED超高分辨率激光共聚焦观察(以与PBS共孵育的细胞爬片作为阴性对照)。按照常规ELISA操作，分别包被表达纯化后的目的蛋白(阳性对照，与多肽阵列为同一蛋白)、合成好的目的蛋白对应多肽以及多肽蛋白的Mix样品(10μg/ml)，100μL/孔，4℃孵育过夜；用含有1％BSA的PBST封闭，4℃孵育过夜；PBST洗涤3次，5min/次，拍干后-20℃保存备用；次日取出，37℃复温30min后，分别加入与多肽互作的诱饵蛋白(10μg/ml)或PBS(阴性对照)，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，5min/次；拍干后，与诱饵蛋白抗体(1:1000)37℃孵育1h后，同上洗涤，拍干后再与HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:10000)孵育，100μL/孔，37℃孵育30min；PBST洗涤同前，拍干；加入新鲜配制的TMB底物显色液，100μL/孔，37℃作用15min后以2mol/L H2SO4终止显色，50μL/孔；酶标仪测定孔内的OD450，比较不同组的显色值。最终将验证的阳性多肽在目的蛋白氨基酸序列上进行标注以进行分析，具体见图12、图13。由图10、11可知，APN-FaeG的互作位点存在于图中以单点形式表现出来的多肽序列中，且生物素标记和抗体标记两种检测方法的结合位点类似(图10)；天然F4菌毛蛋白和重组F4菌毛蛋白的阵列反应结合位点类似(图11)。由图14、15可知，不同FaeG多肽与APN蛋白及其多肽反应孔的显色值存在组间差异，其中标号为1801、1901、2101、3001、3101和3201的FaeG多肽对应孔显色值明显强于标号为2201、2301的FaeG多肽对应孔的显色值。由图15可知，F4ab组(包括F4ab菌毛蛋白，标号为1901、2201、3001的F4ab FaeG多肽)中，标号为4201、4301、4501的APN多肽对应孔的显色值较强；F4ac组(包括F4ac菌毛蛋白，标号为2001、1801、3101的F4ac FaeG多肽)中，标号为4301、4401、4501、5501、5801的APN多肽对应孔的显色值较强；F4ad组(包括F4ad菌毛蛋白，标号为2101、2301、3201的F4ad FaeG多肽)中，标号为4201、4301、4501的APN多肽对应孔的显色值较强。根据各标号对应的多肽可知，也就是说，主要识别F4ab的是TITTTAAITLDQSKPWNRY、ATFNITLIHPNNLTALSNM、VINRAQVIYDSFNLATAHM；主要识别F4ac的是ATFNITLIHPNNLTALSNM、WIVPISSIKNGVMQDHYWL、VINRAQVIYDSFNLATAHM、VLRGVGDSQVPEIDRT和GVTRRFSSEFELQQLE；主要识别F4ad的是TITTTAAITLDQSKPWNRY、ATFNITLIHPNNLTALSNM、VINRAQVIYDSFNLATAHM。

Claims (4)

1.猪源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.1-3所示的多肽作为识别ETECF4ab的功能性结合域和靶标的用途。
2.猪源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.4-8所示的多肽作为识别ETECF4ac的功能性结合域和靶标的用途。
3.猪源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.9-11所示的多肽作为识别ETECF4ad的功能性结合域和靶标的用途。
4.猪氨肽酶N作为靶标在筛选和研制产肠毒素大肠杆菌ETEC F4受体模拟类似物中的应用。
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