CN106442791A - 一种甘蔗叶片中茉莉酸含量的hplc检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC检测方法，包括以下步骤：S1.将待测的甘蔗叶片分离出茉莉酸；S2.茉莉酸甲酯化；S3.采用HPLC进行检测。本发明尤其适用于感染梢腐病的甘蔗叶片中茉莉酸含量的测定，能有效排除梢腐病病原菌对检测结果的干扰，为判断甘蔗品种对梢腐病感抗差异研究提供技术支持，从而为甘蔗抗梢腐病育种和茉莉酸介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答生化机制提供科学有力的技术保证。
Description
技术领域
本发明涉及甘蔗内源激素检测技术领域，特别是一种甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC检测方法。
背景技术
甘蔗（Saccharum officinarum)是我国最重要糖料作物，蔗糖占我国食糖总产92%。甘蔗中含有的植物激素几乎参与了其生长发育所有过程的生理调节，从细胞的生长分裂和分化，到种子的休眠、果实发育、性别分化和衰老过程等。对于甘蔗而言，它有2个非常重要的指标直接影响着甘蔗的经济价值，分别糖分和产量，但如果甘蔗受到病虫害影响而不能及时发现，则会大大影响甘蔗的糖分和产量。如果能够通过研究甘蔗生长过程中内源激素的变化趋势，判断甘蔗品种感染病原后的感抗差异，并建立对应病原菌胁迫应答的生化机制，那么将对甘蔗经济价值的增长具有重大的现实意义。
目前，我国甘蔗梢腐病的发生有逐渐加重的趋势，由于梢腐病逐渐表现出无区域性和无规律性等特点，导致该病对甘蔗产业的危害日趋严重。在巴西、印度、伊朗、马来西亚以及我国等蔗区各类梢腐病症状层出不穷，尤其在高温高湿季节容易暴发此病。据2012-2014年广西甘蔗品种区域试验以及2013-2014年国家甘蔗品种区域试验调查，参试品种发病率达到100%。此病害可导致甘蔗株高显著降低，产量减少5%～20%，糖分降低达3%。甘蔗在受到梢腐病病原侵染时，会产生一系列的防御反应来保护自己，与此同时，病原真菌也会通过改变自身毒性或产生变异，由此影响甘蔗正常生理生化进程，从而感染甘蔗并导致发病。甘蔗在受到梢腐病病原侵染后，整个心叶基部以及生长点会表现出叶片严重病变，明显皱缩、扭曲，感染叶片上的病原菌通过生长点继续向下侵染蔗茎，有时在节间形成黑红色条纹病斑，叶片错乱交织，有些扯破蔗茎表皮引起畸形和扭曲。因此，随着甘蔗梢腐病对甘蔗产业影响日益严重，对感染梢腐病病原后的内源激素变化趋势研究是十分紧迫的问题。
茉莉酸( jasmonic acid，JA) 作为一种基本的植物生长调节物质，在生物或者非生物胁迫下都能够诱导合成，进而通过与其他植物内源激素如生长素、乙烯和 ABA 等互作或者仅通过自身的作用介导植物应对病原菌感染、损伤及其他生理代谢进程。但是，至今尚无建立高效、准确的甘蔗梢腐病叶片茉莉酸含量检测方法。因此，建立一套快速有效的甘蔗叶片茉莉酸含量检测方法，对及时判断甘蔗品种感染病原后的感抗差异，并开拓甘蔗的抗病改良新途径，提高甘蔗抗病性，控制甘蔗病害的流行具有非常重要的意义。
发明内容
针对我国甘蔗叶片茉莉酸含量检测方法的空白，本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方法如下：
一种甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，包括以下步骤：
S1.将丙酮和20~50mmol/L柠檬酸水溶液按体积比5~9:1~5混合制得提取溶剂，冷却至2~5℃，在待测的甘蔗叶片中加入预冷的提取溶剂，再加入液氮，研磨成浆，加入乙酸乙酯，混匀，超声提取20~60min，离心，取上清液，残渣中加入预冷的提取溶剂，超声提取20~60min，离心后取上清液，重复残渣提取和离心操作0~3次，合并上清液，上清液中加入吸附剂，振荡3~10min，离心，取上清液，用氮气吹干水分，获得叶片中的茉莉酸；
S2.将步骤S1中获得的茉莉酸，加入甲酯化试剂，混匀，22~25℃下放置20~40min进行甲酯化反应，然后加入酸，混匀，放置20~40min，终止反应，用氮气吹干水分，定容，过滤，作为样品溶液备用；
S3.采用HPLC检测样品溶液中茉莉酸的含量。
进一步的，所述步骤S3中，HPLC色谱条件为：流动相由甲醇、超纯水和乙酸按体积比200:300:3混合制成，柱温为32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外检测波长 230nm。
进一步的，所述步骤S3中，HPLC色谱条件为：柱温为35℃，流速1ml/min，进样量 10μL。
进一步的，所述步骤S1中，所述吸附剂为石墨化碳黑和PSA硅胶吸附剂。
进一步的，所述步骤S2中，所述甲酯化试剂为乙醚和甲醇混合溶液与三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液，所述乙醚和甲醇混合溶液由乙醚与甲醇按体积比8~10:1混合均匀，三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液的浓度为1.5~2.5mmol/L，乙醚与甲醇混合溶液与三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液的体积比为23~27:1。
进一步的，所述步骤S2中，所述酸为冰乙酸的正己烷溶液，冰乙酸的浓度为1.5~2.5mmol/L，冰乙酸的正己烷溶液与三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液的体积比为1:1。
进一步的，所述步骤S2中，定容采用的溶解试剂为体积分数为0.1%甲酸水溶液与甲醇按3:1的体积比混合制得。
进一步的，所述步骤S2中，过滤采用0.22μm的水相滤膜。
进一步的，所述步骤S1和S2中，所述用氮气吹干水分均在冰水水浴中进行。
本发明还提供了以上所述的检测方法在判断甘蔗品种对梢腐病感性和抗性差异方面的应用。
本发明的有益效果是：
1）样品前处理方法采用超声提取和吸附获得茉莉酸，再将茉莉酸进行甲酯化，与其他方法相比，提取有效成分完全，除杂效果好，待测样品纯净度高。
2）通过本发明HPLC色谱条件测量样品溶液中茉莉酸甲酯的含量，进而或者茉莉酸的含量，茉莉酸甲酯能与其他有效成分较好地进行分离，且本方法速度快，重复性和准确性好，在具备高效液相色谱仪的实验室均能通过此法开展茉莉酸含量检测工作。
3）本发明尤其适用于感染梢腐病的甘蔗叶片中茉莉酸含量的测定，通过上述样品的前处理方法和色谱条件，能排除梢腐病病原菌对检测结果的干扰，为判断甘蔗品种对梢腐病感性和抗性差异研究提供技术支持，从而为甘蔗抗梢腐病育种和茉莉酸介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答生化机制提供科学有力的技术保证；同时，本发明方法的推广使用，对于筛选抗病品种和指导甘蔗抗病育种也具有重要意义和现实作用。
附图说明
图1为茉莉酸的标准工作曲线。
图2a为标准溶液检测得到的色谱图。
图2b为样品溶液检测得到的色谱图。
图3为不同生长阶段甘蔗接种样品和甘蔗对照样品中茉莉酸含量的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法
S1. 将丙酮和50mmol/L柠檬酸水溶液按体积比7:3混合制得提取溶剂，将提取溶剂预冷至4℃，选取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗叶片作为待测样品，取待测样品2g加入10mL预冷的提取溶剂，再加入液氮，研磨成浆，混匀后加入10ml乙酸乙酯，振荡3min混匀后，超声提取30min，8000 r/min离心10min，取上清液，残渣中加入3ml预冷的提取溶剂，超声提取30min，8000 r/min离心10min，取上清液，合并两次上清液于另一个50ml离心管中，分别加入石墨化碳黑和PSA硅胶吸附剂各0.6g，振荡5min，4000r/min离心5min，吸取上清液于10ml带刻度的离心管中，冰水水浴中用氮气吹干，即获得叶片中的茉莉酸。
S2.预先将乙醚和甲醇按体积比为9:1混合均匀，加入1ml乙醚和甲醇的混合溶液与40μL 2mmol/L的三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液溶解，25℃下混匀后放置30min进行甲酯化；加入40μL2mol/L冰乙酸的正己烷溶液，混匀后放置30min，终止反应；冰水水浴中用氮气吹干，加入溶解试剂定容至1ml，溶解试剂由体积分数为0.1%甲酸水溶液与甲醇按3:1的体积比混合制得，定容后过0.22μm的水相滤膜至样瓶中作为样品溶液待测。
S3.采用HPLC检测样品溶液中茉莉酸的含量。
S3-1.色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：由甲醇、超纯水和乙酸按体积比200:300:3混合制成；柱温：35℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：230nm；走样时间为 20min；进样体积：10μL。
S3-2.称取茉莉酸标准品8.0mg，加入10mL水溶解，配置成800μg/mL的标准溶液母液；然后用标准溶液母液再一次稀释成浓度分别为80μg/mL、8μg/mL、0.8μg/mL、0.1μg/mL的标准溶液，采用S3-1的色谱条件检测标准溶液母液和标准溶液，其对应峰面积分别为2353.455、230.265、22.714、3.238、1.341。然后以峰面积为纵坐标、以茉莉酸浓度为横坐标做标准曲线，标准曲线如图1所述，由图1可见，在所检测范围内(0.1μg/mL～800μg/mL) ，回归方程式为y=2.9424x-0.9008，液相色谱峰面积与茉莉酸浓度具有良好的线性关系( R2=1)。
S3-3. 专属性考察：分别取10μL的800μg/mL的标准溶液母液和样品溶液注入液相色谱仪中，采用S3-1的色谱条件检测，茉莉酸的保留时间为12.93min；标准溶液母液检测结果见图2a，样品溶液检测结果见图2b。
S3-4. 加标回收实验：分别向同一样品溶液中添加1mL的浓度为 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL，50μg / mL 的茉莉酸标准溶液，采用S3-1的色谱条件检测，计算回收率，检测结果见表1。
表1 茉莉酸回收率测定结果
S3-5.方法精密度试验
取浓度为 1.25μg/mL 的标准溶液，采用S3-1的色谱条件检测，连续进样 5 针观察保留时间与峰面积，检测结果见表2。
表2 方法精密度实验结果
| 编号 | 保留时间（min） | 峰面积（μv sec） |
| 1 | 12.933 | 9.542 |
| 2 | 12.958 | 9.334 |
| 3 | 12.941 | 9.165 |
| 4 | 12.935 | 9.302 |
| 5 | 12.560 | 9.228 |
| 标准偏差 | 0.171 | 0.143 |
| 相对标准偏差 | 1.329 | 1.538 |
S3-6.S1获得的样品溶液分析
采用S3-1的色谱条件检测，重复测定三次，得样品的中茉莉酸的含量为3.069μg/g。
由本实施例可以看出，本方法的灵敏度、检出限和精密度能够满足甘蔗叶片中茉莉酸含量的测定；尤其适用于感染梢腐病的甘蔗叶片中茉莉酸含量的测定，通过上述样品的前处理方法和色谱条件，能排除梢腐病病原菌对检测结果的干扰。
实施例2判断甘蔗品种感染梢腐病后的感性和抗性差异研究
（1）接种体的制备：将甘蔗梢腐病病原菌接种于PDA培养基上活化3天，挑取PDA培养基边缘菌丝接种在灭菌的马铃薯葡萄糖水培养基中振荡培养3天，离心、用灭菌的脱脂棉过滤、收集所获得的菌体，用无菌水与菌体配制成浓度为1×106 CFU/ml甘蔗梢腐病病原菌孢子悬浮液。
（2）接种材料的处理：选取甘蔗品种YT94-128、甘蔗品种GT37为接种材料，温室条件下每个品种种植30桶，每桶4个芽，下种前用0.3%多菌灵浸种20min，出苗后正常管理，长出5～6片完全叶时进行接种。
（3）注射接种：取长势相同的甘蔗品种YT94-128、甘蔗品种GT37的幼苗各30株，使用1ml医用注射器分别将100 μl甘蔗梢腐病病原菌孢子悬浮液到甘蔗+1叶位，作为甘蔗接种样品；再另外取长势相同的甘蔗品种YT94-128、甘蔗品种GT37的幼苗各30株，以注射无菌水为对照，作为甘蔗对照样品；甘蔗接种结束后保持室内温度28-30℃，湿度80%。
（4）样品选取:选择相同株龄+1叶位上相同位置有近似病症的甘蔗叶片，在冰盒上将其剪成1cm×1cm的叶片进行备样。
（5）检测方法与结果
S1.将丙酮和50mmol/L柠檬酸水溶液按体积比7:3混合制得提取溶剂，将提取溶剂预冷至4℃，取各生长阶段（0、4、8、16d）的甘蔗接种样品YT94-128、GT37和甘蔗对照样品YT94-128、GT37叶片2g，分别加入10mL预冷的提取溶剂，再加入液氮，研磨成浆，混匀后加入10ml乙酸乙酯，振荡3min混匀后，超声提取30min，8000 r/min离心10min，取上清液，残渣中加入3ml预冷的提取溶剂，超声提取30min，8000 r/min离心10min，取上清液，合并两次上清液于另一个50ml离心管中，分别加入石墨化碳黑和PSA硅胶吸附剂各0.6g，振荡5min，4000r/min离心5min，吸取上清液于10ml带刻度的离心管中，冰水水浴中用氮气吹干，即获得叶片中的茉莉酸。
S2.预先将乙醚和甲醇按体积比为9:1混合均匀，加入1ml乙醚和甲醇的混合溶液与40μL 2mmol/L的三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液溶解，25℃下混匀后放置30min进行甲酯化；加入40μL2mol/L冰乙酸的正己烷溶液，混匀后放置30min，终止反应；冰水水浴中用氮气吹干，加入溶解试剂定容至1ml，溶解试剂由体积分数为0.1%甲酸水溶液与甲醇按3:1的体积比混合制得，定容后过0.22μm的水相滤膜至样瓶中作为研究样品溶液待测。
S3.采用HPLC检测样品溶液中茉莉酸的含量。
S3-1色谱条件：色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：由甲醇、超纯水和乙酸按体积比200:300:3混合制成；柱温：35℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：230nm；走样时间为 20min；进样体积：10μL。
S3-2取不同生长阶段（2、4、8、16d）的甘蔗接种样品YT94-128、GT37和甘蔗对照样品YT94-128、GT37制成的研究样品溶液，进行茉莉酸含量的测定，每个样品重复测定3次，结果见表3。
表3不同生长阶段甘蔗接种样品中茉莉酸的含量
S3-3实验结果分析
茉莉酸（JA）在外界机械创伤以及病原菌胁迫等信号转导中起信使作用，可诱导一系列植物防御基因的表达、防御反应化学物质的合成等。经鉴定，YT94-128对梢腐病表现出抗性，GT37对梢腐病表现出感性。
由上述表3获得的数据制得茉莉酸含量的趋势变化图，如图3所示，其中，A为对照样品YT94-128的茉莉酸含量变化趋势，B为接种样品YT94-128的茉莉酸含量变化趋势，C为对照样品GT37的茉莉酸含量变化趋势，D为接种样品GT37的茉莉酸含量变化趋势，结合图3所示，对照样品中的茉莉酸含量随甘蔗生长而逐渐上升，抗病品种YT94-128的茉莉酸含量变化趋势高于感病品种GT37；病原菌接种处理的甘蔗叶片中茉莉酸含量表现出先增长后降低的趋势，感病品种GT37的茉莉酸含量降低的趋势要高于YT94-128；其中，接种后2至4天，蒸馏水接种和病原菌接种处理之间的茉莉酸含量差异并不显著，但接种后一周左右时间，接种处理与对照之间的差异达到极显著。
本试验说明，空白处理下，感病品种GT37叶片合成茉莉酸的速率要低于抗病品种YT94-128；在接种病原菌后，感病品种GT37梢腐病病情指数不断加重，其叶片合成茉莉酸的能力受到显著影响，同时蔗株在受到生物（病原菌）和非生物（针刺）胁迫后发生茉莉酸次生合成反应，但前者大于后者，从而导致GT37叶片中茉莉酸含量呈显著降低趋势。抗病品种YT94-128在接种病原菌后，其叶片能仍能正常合成茉莉酸，尽管在接种后12至16天表现出与GT37叶片茉莉酸含量的相似性变化，但其梢腐病病情指数并不显著。
结论：由试验可看出，同一甘蔗品种在感染梢腐病后其叶片茉莉酸含量与抗梢腐病能力呈显著正相关；同理，茉莉酸含量变化可作为判别不同甘蔗品种对梢腐病感性和抗性差异的一个重要生理指标。这一试验结果为研究茉莉酸抗逆性生理生化机制、筛选抗病品种和指导甘蔗抗病育种提供了重要的技术参考。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (10)
1. 一种甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.将丙酮和20~50mmol/L柠檬酸水溶液按体积比5~9:1~5混合制得提取溶剂，冷却至2~5℃，在待测的甘蔗叶片中加入预冷的提取溶剂，再加入液氮，研磨成浆，加入乙酸乙酯，混匀，超声提取20~60min，离心，取上清液，残渣中加入预冷的提取溶剂，超声提取20~60min，离心后取上清液，重复残渣提取和离心操作0~3次，合并上清液，上清液中加入吸附剂，振荡3~10min，离心，取上清液，用氮气吹干水分，获得叶片中的茉莉酸；
S2.将步骤S1中获得的茉莉酸，加入甲酯化试剂，混匀，22~25℃下放置20~40min进行甲酯化反应，然后加入酸，混匀，放置20~40min，终止反应，用氮气吹干水分，定容，过滤，作为样品溶液备用；
S3.采用HPLC检测样品溶液中茉莉酸的含量。
2.根据权利要求1所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S3中，HPLC色谱条件为：流动相由甲醇、超纯水和乙酸按体积比200:300:3混合制成，柱温为32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外检测波长 230nm。
3.根据权利要求2所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S3中，HPLC色谱条件为：柱温为35℃，流速1ml/min，进样量 10 μL。
4. 根据权利要求1所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S1中，所述吸附剂为石墨化碳黑和PSA硅胶吸附剂。
5. 根据权利要求1所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S2中，所述甲酯化试剂为乙醚和甲醇混合溶液与三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液，所述乙醚和甲醇混合溶液由乙醚与甲醇按体积比8~10:1混合均匀，三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液的浓度为1.5~2.5mmol/L，乙醚与甲醇混合溶液与三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液的体积比为23~27:1。
6. 根据权利要求5所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S2中，所述酸为冰乙酸的正己烷溶液，冰乙酸的浓度为1.5~2.5mmol/L，冰乙酸的正己烷溶液与三甲基硅烷化重氮甲烷的正己烷溶液的体积比为1:1。
7. 根据权利要求1所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S2中，定容采用的溶解试剂为体积分数为0.1%甲酸水溶液与甲醇按3:1的体积比混合制得。
8. 根据权利要求1所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S2中，过滤采用0.22μm的水相滤膜。
9. 根据权利要求1所述的甘蔗叶片中茉莉酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于：
所述步骤S1和S2中，所述用氮气吹干水分均在冰水水浴中进行。
10.如权利要求1~9任一项所述的检测方法在判断甘蔗品种对梢腐病感性和抗性差异方面的应用。
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