CN100563419C - 冠毒素在抑制种子萌发中的应用及其简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法。发明的技术方案为：冠毒素在抑制种子萌发中的应用。简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其中：种子的常规的预处理；在干净的培养器皿底层铺可以保持水份的滤纸；把预处理的种子均匀分散地放在滤纸上，每个培养器皿10～100粒；被检测的冠毒素样品溶液经离心除去干扰检测的杂质，取上清液，向培养器皿中加入10～40mL的上清液于含预处理的种子的培养器皿中；20～35℃暗培养1～7天后，测量种子萌发后根的长度。与高效液相色谱法及酶联免疫ELISA检测法相比，该方法操作简便、经济且易于推广普及，检测灵敏度高。本发明还提供了冠毒素的新用途。
Description
技术领域
本发明涉及冠毒素在抑制种子萌发中的应用及其简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法。
背景技术
我国水稻、小麦播种面积各占2000多万公顷，总产量均为1亿多吨。它们从收获到翌年播种有一段相当长的贮藏期，通常是3-8个月或更长。如何避免贮藏期内种子生活力下降是各种子经营单位关注的焦点。而水稻产区空气湿度较大，种子入库水分过高，或入仓后受潮、淋雨都可使其发芽。另外，水稻、小麦和玉米种子在收获前如遇到高温多湿天气，往往在穗上萌发——穗萌，穗萌是农业生产上常会碰到的问题，它不仅造成减产和种子品质下降，还影响到种子的耐贮性，给农业生产和粮食部门造成巨大的损失。
冠毒素(coronatine，简称COR)是二十世纪七十年代末发现的由微生物产生的生理活性物质。冠毒素具有模拟高等植物十八碳途径信号分子的功能，可诱导植物过度生长、抑制根的伸长；当施于马铃薯块茎切断表面时，可引起块茎的过度肥大。研究显示，冠毒素可诱导水稻及小麦等禾本科作物颖花快速开放，可作为禾本科作物特别是杂交水稻花时调节剂，可使水稻母本或父本成熟颖花提早开放，使父母本花时接近或同步，由此能大幅度提高杂交水稻制种产量。
但目前还没有冠毒素应用于抑制种子萌发的报道，我们分析原因有下列：国内外关于冠毒素的研究都比较少，生理机制的研究多集中在对马铃薯块茎膨大的影响，造成叶绿素减少的机理，以及与其它植物激素之间的比较等。我们根据冠毒素对植物的生理调控机制，将思路由促进颖花开放转向是否抑制种子的萌发，突破了常规的技术思维。
另外应用冠毒素的时候常常需要测量冠毒素的含量来帮助技术人员采取合适的技术方案。
目前关于冠毒素含量的检测方法主要有高效液相色谱法及酶联免疫ELISA检测法。高效液相色谱法对前处理要求高，使用和维护的成本高；ELISA技术灵敏度达纳克级别，但其测量用的抗体未商品化，且使用成本很高。因此上述冠毒素检测方法在工业生产上并不实用。由于发酵产物杂质多、含量低且常含有与目标产物结构相似的类似物存在，因此生物检测法是确定发酵产物活性的有效手段。本发明者又根据冠毒素对禾本科作物种子的抑制效应，获得一种简易的生物测定冠毒素的方法。
冠毒素由于历史的原因，和研究者的不同在命名上稍有不同，例如“产生高组分冠菌素的菌株及其发酵生产冠菌素的方法”(专利号为200410037694.2)所涉及的冠菌素就是本发明所述的冠毒素，冠毒素的来源可以是由研究人员自己在实验室培养也可以按照专利号为200410037694.2的文献提供的方法获得。本发明所述的冠毒素还可用化学合成法或采用其他微生物发酵法获得。例如：利用产冠毒素的菌株，采用固体培养、摇瓶培养或发酵罐深层发酵等，再经提取纯化得到冠毒素。
冠毒素的来源还可以是按照《冠菌素及其生理功能》/2006年42卷3期《植物生理学通讯》第503-510页提供的线索和方法获得。
发明内容
本发明的目的在于提供冠毒素在抑制种子萌发中的应用及其简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法。
本发明的技术方案为：冠毒素在抑制种子萌发中的应用。冠毒素在抑制禾本科种子萌发中的应用。冠毒素在抑制水稻种子萌发中的应用。
简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理；在干净的培养器皿底层铺可以保持水份的滤纸；把预处理的种子均匀分散地放在滤纸上，每个培养器皿10～100粒；被检测的冠毒素样品溶液经离心除去干扰检测的杂质，取上清液，向培养器皿中加入10～40mL的上清液于含预处理的种子的培养器皿中；20～35℃暗培养1～7天后，测量种子萌发后根的长度。
简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其中：种子的常规的预处理具体为选取颗粒饱满、色泽好的种子作为样品种子，20～35℃下浸种12-24h。
浸种可以加快种子萌发的速度，便于更好的提供简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法。
冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.01-50mg/L，溶剂为水。
冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.01-20mg/L，溶剂为水，处理种子的方式是将冠毒素溶液涂抹、喷雾、湿润、浸泡种子。
冠毒素作为种子萌发抑制剂主要是针对禾本科种子，例如水稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦等禾本科种子的处理。
一般而言，在使用时抑制剂的活性成分冠毒素的使用浓度为0.01～100ppm，优选为0.01～50ppm，更优选为0.1～20ppm。施用剂量可根据作物种子的不同而变化。
本发明的抑制剂使用时采用常规的制剂形式，使用在制剂加工中通常采用的辅助剂，加工成如乳剂、可直接喷雾或可稀释溶液、可稀释乳液、可湿性粉剂、粉剂、颗粒剂或微胶囊剂。施用方法根据抑制剂的制剂类型、意欲的目的和环境做选择，如采用撒施或浇泼，喷粉，润湿，喷雾等。
制剂采用已知的方式制备，例如将冠毒素与所述的助剂混合，还可添加表面活性剂来制备制剂。
溶剂和固体载体的实例描述于刘步林主编的《农药剂型加工技术》第二篇中(化工出版社，1998)。
适合的表面活性剂是具有良好乳化，分散和湿润性能的非离子、阳离子、阴离子和/或两性表面活性剂和表面活性剂混合物。实例描述列于刘步林主编的《农药剂型加工技术》第三篇中(化工出版社，1998)。
种子萌发抑制剂中通常含有按重量0.01％至99.0％的活性组份冠毒素，优选按重量计0.01％至80.0％的冠毒素，按重量计1.0％至99.0％固体或液体加工助剂以及按重量计0至25.0％，优选按重量计0.1％至25.0％的表面活性剂。
根据本发明使用的活性化合物，还可将其与其它活性化合物混合，例如与已知的杀菌剂、杀虫剂，由此拓宽作用谱。其它活性化合物如：除虫菊素、鱼藤酮、烟碱、多菌灵、噻菌灵、代森锌、代森锰、代森锰锌、植物油乳剂，大蒜素、印楝素、苯楝、川楝素、芝麻素、井岗霉素、链霉素、多氧霉素、浏阳霉素、可湿性硫、硫悬浮剂、硫酸铜、氢氧化铜、波尔多液等。
一种简易的冠毒素生物检测方法：
即用冠毒素样品浸水稻种子或类似的小麦、大麦、黑麦、燕麦等禾本科种子，20～35℃培养1～7天，测定种子萌发后根的长度，根据冠毒素具有抑制种子萌发的生理特性，且其浓度与种子根萌发的长度之间存在负相关性，由此确定被测样品的冠毒素生物效价。
本发明包括如下实施步骤：
(1)冠毒素对水稻种子或类似的小麦、大麦、黑麦、燕麦等禾本科种子萌发的抑制效应及两者相关性确定：
a选取颗粒饱满、色泽好的某一品种种子作为检测种子，20～35℃下浸种24h；b在干净的培养皿或平底器皿底层铺二层干净的滤纸，以保持水分；把处理好的种子均匀分散地放在滤纸上，每皿10～100粒；c每皿加入系列浓度的冠毒素纯品(纯度99.8％)10～40mL，20～35℃暗培养1～7天后，测定水稻种子的萌发率及种子根的长度；d根据种子萌发率及冠毒素浓度与种子萌发后的根长之间的对应关系，确定在一定浓度范围内，冠毒素对种子萌发的抑制效应，以及冠毒素浓度与根长的相关性，并由此获得两者之间的相关曲线。
(2)冠毒素样品生物效价的测定：
a采用(1)中a和b法对种子进行预处理；b取被测样品离心，上清液适当稀释，加入含预处理的种子的培养皿或平底器皿中，每皿10～40mL稀释液；
c 20～35℃培养1～7天，测定种子的萌发率及水稻根长；d根据种子萌发率，获得被测样品对种子的抑制效应；根据冠毒素浓度与种子萌发根长之间的相关性，确定被测样品冠毒素的生物效价。
本发明的优点在于：提供了冠毒素的新用途，作为种子萌发的抑制剂使用。由于生产和研究需要简易的冠毒素生物检测方法，那么提供一种简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法对于提供简易的冠毒素生物检测方法有很重要的意义，与高效液相色谱法及酶联免疫ELISA检测法相比，可以获得操作简便、经济且易于推广普及的简易的冠毒素生物检测方法。该简易的冠毒素生物检测方法在冠毒素很低的浓度下即可检测，检测浓度≥0.005μg/mL。检测灵敏度高。
具体实施方式
实施例1、冠毒素在抑制种子萌发中的应用。
实施例2、冠毒素在抑制禾本科种子萌发中的应用。
实施例3、冠毒素在抑制水稻种子萌发中的应用。
实施例4、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理；在干净的培养器皿底层铺可以保持水份的滤纸；把预处理的种子均匀分散地放在滤纸上，每个培养器皿10粒；被检测的冠毒素样品溶液经离心除去干扰检测的杂质，取上清液，向培养器皿中加入10mL的上清液于含预处理的种子的培养器皿中；20℃暗培养7天后，测量种子萌发后根的长度。
实施例5、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理；在干净的培养器皿底层铺可以保持水份的滤纸；把预处理的种子均匀分散地放在滤纸上，每个培养器皿100粒；被检测的冠毒素样品溶液经离心除去干扰检测的杂质，取上清液，向培养器皿中加入40mL的上清液于含预处理的种子的培养器皿中；35℃暗培养1天后，测量种子萌发后根的长度。
实施例6、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理；在干净的培养器皿底层铺可以保持水份的滤纸；把预处理的种子均匀分散地放在滤纸上，每个培养器皿80粒；被检测的冠毒素样品溶液经离心除去干扰检测的杂质，取上清液，向培养器皿中加入20mL的上清液于含预处理的种子的培养器皿中；25℃暗培养3天后，测量种子萌发后根的长度。
实施例7、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理具体为选取颗粒饱满、色泽好的种子作为样品种子，35℃下浸种12h。其余分别重复实施例4、5、6。
实施例8、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理具体为选取颗粒饱满、色泽好的种子作为样品种子，20℃下浸种24h。其余分别重复实施例4、5、6。
实施例9、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：种子的常规的预处理具体为选取颗粒饱满、色泽好的种子作为样品种子，25℃下浸种16h。
其余分别重复实施例4、5、6。
实施例10、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.01mg/L，溶剂为水。
实施例11、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为50mg/L，溶剂为水。
实施例12、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.05mg/L，溶剂为水。
实施例13、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.2mg/L，溶剂为水。
实施例14、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.9mg/L，溶剂为水。
实施例15、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为1.8mg/L，溶剂为水。
实施例16、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为3.6mg/L，溶剂为水。
实施例17、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为10.2mg/L，溶剂为水。
实施例18、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为18.8mg/L，溶剂为水。
实施例19、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为29.6mg/L，溶剂为水。
实施例20、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为40.5mg/L，溶剂为水。
实施例21、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为0.01mg/L，溶剂为水。
实施例22、冠毒素在抑制种子萌发中的应用，其中：冠毒素溶液处理种子的浓度为20mg/L，溶剂为水。
以下是试验例
1、种子萌发抑制剂：冠毒素溶液。
采用本发明的种子萌发抑制剂，该制剂为用水稀释的冠毒素溶液，冠毒素浓度为1～20mg/L，溶剂为水，对贮藏的不同品种水稻、小麦等种子喷雾处理后，在空气湿度为85％～90％，30℃的培养箱中分别放置3、6和12个月，测定贮藏种子的萌发情况，以种子破壳/破皮裂嘴为萌发。从实验结果显示(见表1)，经种子抑制剂处理后，贮藏种子的萌发完全被抑制，抑制效果非常明显。
表1喷雾冠毒素后抑制种子萌发的效果比较
种子萌发抑制剂不仅对其中的水稻、小麦、大麦属于禾本科植物的种子，而对棉花、豇豆等其他种类的植物种子都有抑制作用。
2、冠毒素的生物检测方法
(1)以水稻品种赣晚籼115为检测种子为例，选取其颗粒饱满、色泽好的稻谷作为检测种子，25℃下浸种24h；
(2)在干净的直径9cm培养皿或平底器皿底层铺二层干净的滤纸，以保持水分；把处理好的种子均匀分散地放在滤纸上，每皿100粒；
(3)取冠毒素纯品(纯度99.8％)，系列稀释，浓度范围在0.01～5μg/mL；
(4)将不同浓度冠毒素分别加入上述含水稻种子的培养皿或平底器皿中，每皿20mL，置25℃下培养2天；
(5)测定水稻种子的萌发率及水稻根长；
(6)根据水稻种子萌发率，可判断冠毒素的生理活性；
(7)根据处理浓度与种子萌发根长的对应关系，推导两者的相关性，得到直线回归方程为：Y＝-0.0109X+0.1198 R2＝0.992
Y——冠毒素处理浓度μg/mL，X——水稻种子萌发的根长cm。
由此依据水稻种子萌发的根长，可以判别样品冠毒素的生物效价。
以下是采用本发明测定冠毒素的部分实例：
(1)实验样品：
样品150升发酵罐，发酵4天，下罐后，发酵液离心，取上清液，适当稀释；
样品2摇瓶培养4天，发酵液离心，取上清液，适当稀释；
样品3斜面培养基培养4天后，用甲醇提取，离心取上清液，真空干燥后，再适当稀释。
样品4收集接种产冠毒素菌株后的番茄叶片，捣碎后，加入甲醇提取，再用乙酸乙酯萃取，真空干燥，最后适当稀释；
(2)生物检测步骤：
①以水稻品种如赣晚籼115为检测种子，选取其颗粒饱满、色泽好的稻谷，25℃下浸种24h；
②在干净的直径9cm培养皿底层铺二层干净的滤纸，以保持水分；把处理好的种子均匀分散地放在滤纸上，每皿100粒；
③将上述适当稀释的样品分别加入含水稻种子的培养皿中，每皿20mL，置25℃下培养2天；
④测定水稻种子的萌发率及水稻根长；
(3)生物检测结果：
| 样品 | 稀释(倍) | 水稻种子萌发后平均根长(cm) | 生物检测冠毒素产量(μg/mL) | 高效液相测定冠毒素产量(μg/mL) | 与液相的偏差(％) |
| 样品1 | 4000 | 3.2 | 339 | 345 | 1.7 |
| 样品2 | 5000 | 3.8 | 156 | 161 | 3.1 |
| 样品3 | 1000 | 2.6 | 91 | 94 | 3.2 |
| 样品4 | 200 | 3.4 | 16.5 | 17.3 | 4.6 |
注：高效液相测定方法参考文献“Palmer D.A.，Bender C.L.Effects ofEnvironmental and Nutritional Factors on Production of thePolyketide Phytotoxin Coronatine by Pseudomonas syringae pv.Glycinea.Appl Environ Microbiol.1993，59(5)：1619-1626.”
(3)结果分析：
上述生物检测结果显示，不同来源的样品采用水稻种子为检测物，测定样品对其抑制效应，根据水稻萌发后根长与冠毒素含量之间的对应关系，获得样品中冠毒素的生物效价。该种检测方法与高效液相检测方法相比，偏差率小于5％。由于本检测方法简单、经济、易于操作，因而具有推广应用价值。
Claims (4)
1、冠毒素在抑制禾本科种子萌发中的应用。
2、冠毒素在抑制水稻种子萌发中的应用。
3、简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其依次包括下列步骤：
a、种子的常规的预处理；
b、在干净的培养器皿底层铺可以保持水份的滤纸；把预处理的种子均匀分散地放在滤纸上，每个培养器皿10～100粒；
c、被检测的冠毒素样品溶液经离心除去干扰检测的杂质，取上清液，向培养器皿中加入10～40mL的上清液于含预处理的种子的培养器皿中；20～35℃暗培养1～7天后，测量种子萌发后根的长度。
4、根据权利要求3所述的简易的冠毒素生物检测方法的预处理方法，其特征在于：种子的常规的预处理具体为选取颗粒饱满、色泽好的种子作为样品种子，20～35℃下浸种12-24h。
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