CN106434594A - 一种n‑乙酰谷氨酸激酶突变体及其应用 - Google Patents

一种n‑乙酰谷氨酸激酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种既解除了L‑精氨酸对其的反馈抑制作用又显著提高了催化活性与热稳定性的N‑乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物工程领域。首先采用分子对接技术和对来源于钝齿棒杆菌CGMCC NO:0890的N‑乙酰谷氨酸激酶(CcNAGK)的结构分析，确定了E19位点对精氨酸的反馈抑制具有重要作用和位于底物结合口袋的三个关键氨基酸残基位点I74、F91与K234对酶的催化活性与热稳定性有着重大影响。然后，对其编码的氨基酸进行取代，将复合突变后基因argB4通过pDXW10引入高产精氨酸的钝齿棒杆菌中，可显著提高了钝齿棒杆菌中精氨酸的合成速率。最终在5L发酵罐中发酵96h后精氨酸产量由原来的43.2g/L提高至61.2g/L，L‑精氨酸产量提高了41.8％。

Description

一种N-乙酰谷氨酸激酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种完全解除L-精氨酸的反馈抑制作用并显著提高催化活性和热稳定性的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-精氨酸是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，具有多种独特的生理和药理作用。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。
N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl glutamate kinase)简称NAGK，是L-精氨酸合成途径的第二个酶和关键限速酶，同时它受终产物L-精氨酸的反馈抑制。在ATP的作用下，它催化N-乙酰谷氨酸的λ-COO-磷酸化从而生成L-精氨酸合成的中间体N-乙酰谷氨酸磷酸。
L-精氨酸生产方法有水解法和发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。因此，实现发酵法生产L-精氨酸成为国内外氨基酸工业的一个十分迫切的问题。目前，用来产L-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒杆菌与钝齿棒杆菌，为提高精氨酸产量，研究者们利用DNA重组技术结合代谢工程技术调控合成精氨酸的代谢途径，这使得精氨酸的产量大有提高。为进一步提高生产量研究者渐渐开始将研究重点转向L-精氨酸限速酶－－N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)，通过克隆N-乙酰谷氨酸激酶基因并导入其它菌株来表达，但其受到终产物L-精氨酸的严重反馈抑制，尽管一些研究者们运用定点突变技术缓解了精氨酸对其的反馈抑制，但仍然不能完全解除，导致提高发酵产L-精氨酸的能力较弱，因此若要进一步提高L-精氨酸产量，需进一步的解除NAGK受精氨酸的反馈抑制作用；另外，虽然通过克隆N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)并导入钝齿棒杆菌获得了CcNAGK的过量表达，但是CcNAGK的比酶活并不高即CcNAGK的催化活性较弱，且热稳定性不好即在30℃下CcNAGK的半衰期为36h，而L-精氨酸的发酵周期是96h。因此，在保持N-乙酰谷氨酸激酶过量表达的基础上，提高其催化活性与热稳定性成为工业生产的迫切需要。
因此，本发明提供了一种既完全解除了L-精氨酸对其的反馈抑制作用又显著提高了催化活性与热稳定性的N-乙酰谷氨酸激酶突变体。采用分子对接技术和对来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum CGMCC NO:0890)N-乙酰谷氨酸激酶(CcNAGK)的结构分析，确定了L-精氨酸结合域入口处E19位点对精氨酸的反馈抑制具有重要作用，利用重叠PCR技术对E19位点进行定点突变，获得能完全解除L-精氨酸反馈抑制的突变体E19Y；同时确定了位于底物结合口袋的三个关键氨基酸残基位点I74、F91与K234对酶的催化活性与热稳定性有着重大影响，因此在中国专利CN201610286036.X中公布的argBF91H基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，将这四个位点复合突变后获得既能制解反馈抑除又显著提高催化活性和热稳定性的CcNAGK突变体。将复合突变后基因argB4通过pDXW10引入高产精氨酸的钝齿棒杆菌CGMCC NO:0890中，可显著提高了钝齿棒杆菌中精氨酸的合成速率。最终在5L发酵罐中发酵96h后精氨酸产量由原来的43.2g/L提高至61.2g/L，L-精氨酸产量提高了41.8％。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种既完全解除了L-精氨酸对其的反馈抑制作用又显著提高了催化活性与热稳定性的N-乙酰谷氨酸激酶突变体。将在中国专利CN201610286036.X中公布的argBF91H基因序列进行复合突变(E19Y/I74V/K234T)，将含复合的突变后基因argB4在钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum CGMCC NO:0890)中进行表达，蛋白纯化后得到解除反馈抑制并显著提高催化活性和热稳定性的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，即半抑制常数(I0.5 R＝148.5mM)提高了382倍，酶活比野生型(CcNAGK)提高了1.73倍，在30℃的半衰期也由突变前36h延伸到120h。将复合突变后基因argB4通过pDXW10引入高产精氨酸的钝齿棒杆菌中，可显著提高了钝齿棒杆菌中精氨酸的合成速率。最终在5L发酵罐中发酵96h后精氨酸产量由原来的43.2g/L提高至61.2g/L，L-精氨酸产量提高了41.8％。本发明所得N-乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L-精氨酸奠定了基础。
编码所述突变后N-乙酰谷氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ NO.2所示所示。
获得所述突变体的方法，是在中国专利CN201610286036.X中公布的argBF91H基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第19位的谷氨酸、第74位的缬氨酸和第234位的赖氨酸，获得既解除反馈抑制又显著提高催化活性和热稳定性的N-乙酰谷氨酸激酶复合突变体NAGK-4(E19Y/I74V/F91H/K234T)。将含复合突变后基因的重组质粒pDXW10-argB4电转至高产精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum CGMCC NO:0890)中，发酵生产L-精氨酸。
获得所述突变体的方法，具体地是：
(1)突变表达载体的构建
通过分子对接技术和对来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum CGMCCNO:0890)N-乙酰谷氨酸激酶(CcNAGK)的结构分析，确定了L-精氨酸结合域入口处E19位点为目标位点，将其突变为His；同时通过同源序列的比对将位于底物结合口袋的三个关键氨基酸残基位点I74、F91与K234分别突变为Val，His与Thr。以pDXW10-argBF91H质粒为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行复合突变得到的复合突变基因argB4，将复合突变基因argB4连接至穿梭载体pDXW10上构建重组质粒pDXW10-argB4，提取重组质粒进行测序。
(2)含突变体的基因工程菌的获得
将测序正确的重组质粒pDXW10-argB4电转至钝齿棒杆菌中获得能进一步提高精氨酸产量的重组菌SYPA-4。
(3)N-乙酰谷氨酸激酶活力测定
酶活测定方法：3mL反应液中含595mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷氨酸，20mmol/L MgCl2，20mmol/L ATP二钠盐，149mmol/L NH20H·HCI及适量粗酶液。于37℃反应1h后，加入lmL反应终止液(1.0mol/L HCI含5％FeCl3·6H20，4％三氯乙酸)终止反应。离心，取上清测定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸收值A540。
酶活力单位定义为1个国际单位(U)等于每分钟内生成1μmol产物N-乙酰谷氨酸氧肟酸所需要的酶量。
(4)野生型和突变体的动力学参数与热稳定性的测定
将重组钝齿棒杆菌培养后破细胞，取上清即为粗酶液，将野生型和突变体经Ni柱纯化后测定酶活力与蛋白浓度得到比酶活，通过改变底物N-乙酰谷氨酸(NAG)与ATP的浓度以及运用双倒数法测得Km，Vm与kcat的值，以及将野生型和突变体放置30℃水浴不同的时间得到热稳定性曲线。
(5)重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的研究
将重组钝齿棒杆菌SYPA-4活化后制备种子液，以8％的接种量转接入5L发酵罐中进行发酵，每间隔12取样分别测OD，残糖量，L-精氨酸产量与产率。
种子培养基(g/L)：葡萄糖150，酵母浸出液20，(NH4)2SO4 20，KH2PO4 1.5，KCl 1，MgSO4·7H2O0.5。
发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖150，酵母浸出液12，(NH4)2SO4 20，KH2PO4 1.5，KCl 1，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O；
重组钝齿棒杆菌的发酵条件为：温度设为30℃，转速设为600rpm，发酵时间96h，pH7.0。
具体实施方式
实施例1 突变表达质粒的构建及重组钝齿棒杆菌的获得
根据在中国专利CN201610286036.X中公布的argBF91H基因序列基础上，设计N-乙酰谷氨酸激酶编码基因的两头引物，再根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变中间引物：
利用重叠延伸PCR体外扩增获得突变基因。
用于定点突变的引物为：
PSD-argB F：5'-CGCGAATTCAAAGGAGGGAAATCTTTTATGAATGACTTGAT
CAAAG(EcoR I)-3'
PargB R：5'-CCAAGCTTTTACAGTTCCCCATCCTTG(Hind III)-3'
PargBE19Y Rm：5'-CATGGCAACGCNNNAGCGAGGACATTT-3'
PargBI74V Fm：5'-CGGTGGTGGACCTCAGGTTTCTGAGATGC-3'
PargBI74V Rm：5'-GCATCTCAGAAACCTGAGGTCCACCACCG-3'
PargBK234T Fm：5'-GTG TCCAAGATCA CTGCCACCGA GCTG-3'
PargBK234T Rm：5'-CAGCTCGGTG GCAGTGATCT TGGACAC-3'
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s,30个循环；72℃延伸5min，。将所得突变基因片段与克隆载体pDXW10分别用EcoR I与Hind III核酸内切酶进行双酶切，胶回收后将两者混合，加入T4连接酶，于16℃过夜连接，电转化至钝齿棒杆菌中，经过卡那霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子，进行双酶切验证，将重组质粒命名为pDXW10-argB4，将其电转至钝齿棒杆菌CGMCC NO:0890中获得重组菌SYPA-4。
实施例2 突变体N-乙酰谷氨酸激酶的表达及Ni-NTA纯化
取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LBG培养基中，30℃振荡培养过夜，按1％接种量转接，30℃培养至OD约0.6-0.8，加人IPTG至终浓度为1mmol/L，过夜诱导表达。将过夜诱导表达的菌液于10000r/min，4℃离心15min，收集菌体，用Tris-HCI(pH8.0)缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0.45μm滤膜过滤，选用表达载体pET-28a中含有6His-Tag，过Ni-NTA纯化NAGK，将获得纯的NAGK酶蛋白经SDS-PAGE分析，检测到一条分子量约为33kDa的特异性条带，纯的NAGK酶用于蛋白浓度与酶活的测定，得到比酶活。
实施例3 终产物L-精氨酸对CcNAGK野生型和突变体反馈抑制作用的研究
为了L-精氨酸的添加对CcNAGK酶活性的影响，在酶促反应体系中加入不同浓度(0-50mM)的L-精氨酸，之后测残余酶活力。我们以添加的L-精氨酸浓度为0时测得的酶活为100％，随着添加的L-精氨酸浓度升高，酶活会随之下降，当酶活降至初始酶活的一半时，我们称此时添加的L-精氨酸浓度为半抑制常数，符号是I0.5 R(R代表的是L-精氨酸)。结果发现：突变体E19Y的I0.5 R值的提高了约380倍。分析CcNAGK三维结构发现E19位点位于L-精氨酸结合口袋(Arginine-ring包括E19、H26R、209与H268)入口处。可能是由于突变体E19Y酪氨酸侧链的芳香环不仅不带电荷无法与精氨酸上的胍基结合，而且庞大的环状侧链还能有效地阻止精氨酸进入Arginine-ring从而使得其无法与其他位点(H26/R209/H268)的结合，所以解除精氨酸反馈抑制的效果很好。
实施例4 野生型和突变体催化活性的比较
将上一步得到的纯酶液进行酶促反应：酶促反应总体积为3mL，含595mmol/LTris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷氨酸，20mmol/L MgCl2，20mmol/L ATP二钠盐，149mmol/L NH20H·HCI及适量粗酶液；于37℃反应1h后，加入lmL反应终止液(1.0mol/LHCI含5％FeCl3·6H20，4％三氯乙酸)终止反应；离心，取上清测定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸收值A540。通过改变底物N-乙酰谷氨酸(NAG)与ATP的浓度以及运用双倒数法测得Km，Vm与kcat的值，得到的结果如表1所示：N-乙酰谷氨酸激酶复合突变体NAGK-4的酶活相比野生型(CcNAGK)提高了1.73倍，因此复合突变体的催化活性得到显著提高，更利于精氨酸的合成。
实施例5 野生型和突变体的热稳定性比较
为了测定野生酶和突变酶对温度的耐受性，将已经纯化的酶于30℃水浴不同的时间后按上述方法测残余酶活力，考察其热稳定性。将未经30℃水浴的酶活设为100％，得到酶的热稳定性曲线。结果如表1所示：N-乙酰谷氨酸激酶复合突变体NAGK-4的热稳定性明显比野生型(CcNAGK)的好，其在30℃下的半衰期由野生型的36h延长到120h。因此具有更好热稳定性的突变体酶在发酵周期较长的精氨酸合成中更有利的。
实施例6 重组钝齿棒杆菌的构建及其发酵L-精氨酸的研究
将复合突变基因argB4连接至穿梭载体pDXW10上构建重组质粒pDXW10-argB4，将重组质粒pDXW10-argB4电转至钝齿棒杆菌中获得能进一步提高精氨酸产量的重组菌SYPA-4。将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml)种子培养基中，于旋转式摇床中30℃、180r/min培养18h进行活化，再以5％的接种量接入500ml摇瓶(装液量为150ml)种子培养基中培养24h得到种子液，按10％的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为2.5L)，于30℃、600r/min、通气量为1vvm的条件下进行发酵，每间隔12取样分别测OD，残糖量，L-精氨酸产量与产率。最终钝齿棒杆菌重组菌SYPA-4在5L发酵罐中发酵96h后精氨酸产量由原来的43.2g/L提高至61.2g/L，L-精氨酸产量提高了41.8％。本发明所得的既解除了精氨酸对其的反馈抑制又显著提高了催化活性和热稳定性的N-乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L-精氨酸奠定了基础。
表1野生型和突变体的动力学参数、半抑制常数及其半衰期
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种N-乙酰谷氨酸激酶突变体
<160> 2
<211> 317aa
<212> AA
<213> Corynebacterium crenatum CGMCC NO: 0890
<222> (1)..(317)
<223> N-乙酰谷氨酸激酶突变体
<400> 1
1 MNDLIKDLGS EVRANVLAYA LPWLQHFRDK IVVVKYGGNA MVDDDLKAAF AADMVFLRTV
61 GAKPVVVHGG GPQVSEMLNR VGLQGEFKGG HRVTTPEVMD IVRMVLFGQV GRDLVGLINS
121 HGPYAVGTSG EDAGLFTAQK RMVNIDGVPT DIGLVGDIIN VDASSLMDII EAGRIPVVST
181 IAPGEDGQIY NINADTAAGA LAAAIGAERL LVLTNVEGLY TDWPDKSSLV SKITATELEA
241 ILPGLDSGMI PKMESCLNAV RGGVSAAHVI DGRIAHSVLL ELLTMGGIGT MVLPDVFDRN
301 YPEGTVFRKD DKDGEL
<211> 954 bp
<212> DNA
<213> Corynebacterium crenatum CGMCC NO: 0890
<222> (1)..(954)
<223> N-乙酰谷氨酸激酶突变体
<400> 2
1 ATGAATGACT TGATCAAAGA TTTAGGCTCT GAGGTGCGCG CAAATGTCCT CGCTTATGCG
61 TTGCCATGGT TGCAGCACTT CCGCGACAAG ATTGTTGTCG TGAAATATGG CGGAAACGCC
121 ATGGTGGATG ATGATCTCAA GGCTGCTTTT GCTGCCGACA TGGTCTTCTT GCGCACCGTG
181 GGCGCAAAAC CAGTGGTGGT GCACGGTGGT GGACCTCAGG TTTCTGAGAT GCTAAACCGT
241 GTGGGTCTCC AGGGCGAGTT CAAGGGTGGT CACCGTGTGA CCACTCCTGA GGTCATGGAC
301 ATTGTGCGCA TGGTGCTCTT TGGTCAGGTC GGTCGCGATT TAGTTGGTTT GATCAACTCT
361 CATGGCCCTT ACGCTGTGGG AACCTCCGGT GAGGATGCCG GCCTGTTTAC CGCGCAGAAG
421 CGCATGGTCA ACATCGATGG CGTACCCACT GATATTGGTT TGGTCGGAGA CATCATTAAT
481 GTCGATGCCT CTTCCTTGAT GGATATCATC GAGGCCGGTC GCATTCCTGT GGTCTCTACG
541 ATTGCTCCAG GCGAAGACGG CCAGATTTAC AACATTAACG CCGATACCGC AGCAGGTGCT
601 TTGGCTGCAG CGATTGGTGC AGAACGCCTG CTGGTTCTCA CCAATGTGGA AGGTCTGTAC
661 ACCGATTGGC CTGATAAGAG CTCACTGGTG TCCAAGATCA CTGCCACCGA GCTGGAGGCC
721 ATTCTTCCGG GACTTGATTC CGGCATGATT CCAAAGATGG AGTCTTGCTT GAACGCGGTG
781 CGTGGGGGAG TAAGTGCTGC TCATGTCATT GACGGCCGCA TCGCGCACTC GGTGTTGCTG
841 GAGCTTTTGA CCATGGGTGG AATTGGCACG ATGGTGCTGC CGGATGTTTT TGATCGGGAG
901 AATTATCCTG AAGGCACCGT TTTTAGAAAA GACGACAAGG ATGGGGAACT GTAA

Claims (7)

1.一种N-乙酰谷氨酸激酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.获得权利要求1所述N-乙酰谷氨酸激酶突变体的方法，其特征在于：在中国专利CN201610286036.X中公布的argBF91H基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第19位的谷氨酸、第74位的缬氨酸和第234位的赖氨酸。
4.一种钝齿棒杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求1所述N-乙酰谷氨酸激酶突变体在钝齿棒杆菌CGMCC NO:0890中克隆表达得到的。
5.根据权利要求4所述的钝齿棒杆菌重组菌，其特征在于，所述N-乙酰谷氨酸激酶突变体的核苷酸序列分别如SEQ NO.2所示。
6.一种合成L-精氨酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求4-5任一所述的钝齿棒杆菌重组菌为生产菌株进行发酵培养。
7.权利要求4-5任一所述的钝齿棒杆菌重组菌在医药、食品或者饲料工业上的应用。
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