CN106432512A - 一种增强多糖抗原免疫原性蛋白载体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种增强多糖抗原免疫原性蛋白载体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体及其制备方法与应用。由CRM197A基因序列和Hin47基因序列作为模板，通过over‑lap PCR扩增出融合基因；融合基因和pET 9a表达载体均经BamHI和NdeI双酶切后通过T4连接酶进行连接；通过酶切鉴定表明成功连接后，经IPTG诱导表达，经纯化获得CRM197A‑Hin47融合蛋白。通过CDAP/CNBr或者还原胺法将b型流感嗜血杆菌加膜多糖PRP和融合蛋白偶联，制备得到PRP与融合蛋白的结合物，可用于制备预防b型流感嗜血杆菌的结合疫苗。实验证明，将融合蛋白作为多糖结合疫苗的蛋白载体，可突出地增强多糖抗原的免疫原性，而且基于该蛋白载体开发的疫苗可以有效降低目前大量使用同种蛋白载体引起的免疫干扰，易于联合疫苗及多价疫苗的开发。

Description

一种增强多糖抗原免疫原性蛋白载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及多糖蛋白结合疫苗开发技术领域，具体而言，本发明通过构建CRM197A-Hin47融合蛋白，开发了一种新型的结合疫苗蛋白载体，进而开发新型多糖蛋白结合疫苗。
背景技术
CRM197为白喉毒素的无毒突变体，经研究证明其免疫原性与白喉毒素几乎无差别，是近几年国际上多糖蛋白疫苗普遍采用的蛋白载体。CRM197由A和B两个亚基组成，其中B亚基，无酶活性，但能与宿主易感细胞表面特异性受体结合，并通过易位作用使A亚基进入细胞。野生型的白喉毒素A亚基具有酶活性，能将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷水解为烟酰胺和腺嘌呤二磷酸核糖两部分。CRM197为A亚基中的谷氨酸突变为甘氨酸，因此失去酶活性。以CRM197作为载体蛋白具有分子量均一，质量易于控制，而且无毒性逆转等风险；研究证实，CRM197的CTL表位主要在A亚基中。
Hin47(又称HtrA)是流感嗜血杆菌在环境压力条件下表达的热休克蛋白，具丝氨酸蛋白酶活性。Hin47是重要的免疫抗原，实验证明其可刺激机体产生B细胞和T细胞反应，可预防不分型流感嗜血杆菌引起的中耳炎。
目前，常用于结合疫苗的蛋白载体有破伤风类毒素TT、白喉类毒素DT和白喉毒素突变体CRM197，此外也有部分产品以不分型嗜 血杆菌D蛋白HiD和外膜蛋白OMP作为结合疫苗的蛋白载体。中国上市的结合疫苗主要以TT作为蛋白载体，尽管以TT作为蛋白载体开发的结合疫苗表现出较好的免疫效果，但是TT分子量较大，致敏性较强，单聚体和多聚体共存，质量难以控制，而且脱毒后的类毒素存在残留毒性和毒性逆转的风险，此外，载体的单一和重复接种可能会影响疫苗的免疫学效果，或导致载体引发的免疫抑制。
因此，开发质量可控、能够有效增强多糖抗原免疫原性的载体蛋白是新一代结合疫苗研发的关键。尤其是随着大量同种蛋白载体的接种而引起免疫干扰风险急剧上升之际，开发新型的结合疫苗蛋白载体更为迫切。
发明内容
本发明目的是提供一种融合蛋白，并作为结合疫苗的蛋白载体；本发明的另一目的在于基于该新型蛋白载体所开发的新型结合疫苗。
本发明的核心目的是解决以白喉类毒素，破伤风类毒素作为结合疫苗载体蛋白，质量控制较难(脱毒后的类毒素为混合物)；而常规的Hin47等蛋白作为结合疫苗载体蛋白，难以增强多糖抗原的免疫原性。
本发明公开了一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体，所述蛋白载体为白喉毒素突变体CRM197的A亚基与流感嗜血杆菌热休克蛋白Hin47的融合蛋白，即CRM197A-Hin47，选自：
(n)CRM197A-linker-(n)Hin47，
(n)Hin47-linker-(n)CRM197A，
(Hin47-linker-CRM197A)n，
(CRM197A-linker-Hin47)n，
其中，n为该单体基因的分子数，n＝1、2或3，linker选自：G4S、DL或EL。
优选的，一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体，n为1。
优选的，一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体，CRM197A-G4S-Hin47。
另一方面，本发明公开了一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体的制备方法，由CRM197A基因序列和Hin47基因序列作为模板，通过over-lap PCR扩增出融合基因；所述融合基因和pET 9a表达载体均经BamHI和NdeI双酶切后通过T4连接酶进行连接；通过酶切鉴定表明成功连接后，经IPTG诱导后进行表达；从发酵液中分离纯化获得所述CRM197A-Hin47融合蛋白。
优选的，上述一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体的制备方法，所述CRM197A基因序列和所述Hin47基因序列按照1:1的比例通过over-lap PCR扩增得到融合基因。
优选的，上述一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体的制备方法的上述实施例中，对所述CRM197A-Hin47融合蛋白进行表达的方式包括原核表达、酵母表达或真核表达。
另一方面，本发明公开了一种结合疫苗，所述结合疫苗为权利要求1所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体与夹膜多糖抗原的结合物。
优选的，上述一种结合疫苗的上述实施例中，所述抗原为多糖抗原，选自b型流感嗜血杆菌荚膜多糖PRP或a型流感嗜血杆菌荚膜多糖Hia。
另一方面，本发明公开了一种结合疫苗的制备方法，通过CDAP/CNBr或者还原胺法将多糖抗原和权利要求1所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体偶联，经CL-4B纯化制备得到。
优选的，一种结合疫苗的制备方法，所述多糖抗原与所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体的比例为1:1。
有益效果：
本发明开发的新型蛋白载体CRM197A-Hin47，为白喉毒素的无毒突变体CRM197的A亚基和流感嗜血杆菌热休克蛋白Hin47的融合蛋白，无毒突变体CRM197A载体蛋白具有分子量均一，质量易于控制，且无毒性逆转风险等优点，Hin47是重要的免疫抗原，将两者融合就兼容两者的优点，将此作为多糖结合疫苗的蛋白载体，即可突出地增强多糖抗原的免疫原性，同时针对蛋白载体的抗体可增加新的适应症，即针对载体蛋白的抗体反应可以预防不分型流感嗜血杆菌引起的中耳炎等疾病。此外，基于该载体蛋白开发的疫苗可以有效降低目前大量使用同种蛋白载体引起的免疫干扰，易于联合疫苗以及多价疫苗的开发。
附图说明
图1为over-lap PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2 CRM197A-Hin47表达载体双酶切验证图；
图3 CRM197A-Hin47蛋白表达SDS-PAGE电泳图(附图中M：protein maker，1：CRM197A-Hin47超声破碎沉淀，2:CRM197A-Hin47超声破碎上清)；
图4 CRM197A-Hin47CHT柱纯化后SDS-PAGE电泳图(M：protein maker，1：CRM197A-Hin47超声处理样品，2：CRM197A-Hin47流穿，3：CRM197A-Hin47平衡，4：50mmol/LPB，5:250mmol/LPB+250mmol/LNaCl，6：0.5mol/LPB)；
图5 CRM197A-Hin47DEAE柱纯化后SDS-PAGE电泳图(M：protein maker，1：DEAE置换的样品，2：CRM197-Hin47流穿，3：CRM197-Hin47 50mM Tris(50mM的NaCl)，4：50mMTris(200mM的NaCl)，5：50mMTris(500mM的NaCl)，6：50mMTris(1M的NaCl))
图6 CRM197A-Hin47Western-Blotting验证；
图7 Hin47单体和融合蛋白的免疫原性(抗Hin47抗体滴度)比较；
图8 CRM197A单体和融合蛋白的免疫原性(抗CRM197A抗体滴度)比较；
图9 CRM197A-Hin47-PRP Sepharose CL-4B凝胶过滤洗脱曲线；
图10不同载体结合物两次免疫后PRP免疫原性；
图11不同载体结合物两次免疫后Hin47免疫原性；
图12不同载体结合物两次免疫后Hia免疫原性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进 行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例一：蛋白载体CRM197A-Hin47制备
步骤一：CRM197A-Hin47表达载体的构建
以CRM197A、Hin47基因序列作为模板，以G4S为linker，采用over-lap PCR即可扩增出融合蛋白目标基因，如图1所示，图1为over-lap PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
融合基因和pET 9a表达载体均经BamHI限制性内切酶和NdeI限制性内切酶双酶切，然后通过T4DNA连接酶进行连接，16℃过夜；重组表达载体，转化到DH5a感受态，挑取单克隆，接种于5ml LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；提取质粒进行酶切鉴定，验证结果如图2所示，图2表示CRM197A与Hin47基因成功连接。
CRM197A-Hin47融合蛋白氨基酸组成如表1所示：表1只是示出了融合蛋白的每个组成部分氨基酸组成，具体的融合蛋白的氨基酸序列可以根据融合蛋白的融合基因的组成形式进行组合。
表1 CRM197A-Hin47重组蛋白氨基酸组成
CRM197A、Hin47、G4S的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-3所示。
步骤二：CRM197A-Hin47的表达验证
PCR和双酶切验证正确的重组CRM197A-Hin47表达载体转化感受态细胞，挑取单克隆进行表达验证。
单克隆接种到5ml LB培养基中，37℃，250rpm摇菌过夜；以5ml复苏菌液接种100mlLB培养基的比例扩大培养，37℃250rpm摇 菌至OD600＝1.2～1.5；加入IPTG诱导目标蛋白表达，其中诱导条件为1mM IPTG，16℃低温诱导；收集菌体，超声破碎，图3为CRM197A-Hin47蛋白表达SDS-PAGE电泳图(附图中M：protein maker，1：CRM197A-Hin47超声破碎沉淀，2:CRM197A-Hin47超声破碎上清)。IPTG诱导表达上清中出现新增条带，融合基因表达载体成功表达。
步骤三：CRM197A-Hin47融合蛋白的制备
菌体发酵，发酵液离心收集沉淀，用pH＝8.0，10mmol/l的PB缓冲液重悬后超声破碎，超声破碎产物8000rpm离心30分钟，取上清液。
发酵液上清采用CHT和DEAE两级柱层析，即可得到80％以上的CRM197A-Hin47融合蛋白，具体纯化工艺如下：
1.CHT柱纯化
PH＝8.0，10mM PB平衡液平衡柱子后进行上样，洗脱液则为50mM PB(PH＝8.0)，然后以250mM PB((含有250mM的NaCl，PH＝8.0)的溶解液溶解目标蛋白，最后以0.1M的NaOH洗脱杂蛋白，进行填料的再生，CHT柱纯化结果如图4所示，图4为CRM197A-Hin47 CHT柱纯化后SDS-PAGE电泳图(附图中M：protein maker，1：CRM197A-Hin47超声处理样品，2：CRM197A-Hin47流穿，3：CRM197A-Hin47平衡，4：50mmol/LPB，5:250mmol/LPB+250mmol/LNaCl，6：0.5mol/LPB)；
2.DEAE柱纯化
将CHT洗脱蛋白置换到PH＝8.0,50mM Tris缓冲液中，然后进行DEAE的纯化，平衡缓冲液为PH＝8.0，50mM Tris，蛋白上样后以50mM Tris(50mM的NaCl，PH＝8.0)洗杂，以50mM Tris(200mM的NaCl，PH＝8.0)的洗脱液洗涤目标蛋白。最后以50mM Tris(1M的NaCl，PH＝8.0)进行填料的再生，纯化结果如图5所示。图5为CRM197A-Hin47 DEAE柱纯化后SDS-PAGE电泳图(M：protein maker，1：DEAE置换的样品，2：CRM197-Hin47流穿，3：CRM197-Hin4750mM Tris(50mM的NaCl)，4：50mM Tris(200mM的NaCl)，5：50mM Tris(500mM的NaCl)，6：50mM Tris(1M的NaCl))。
步骤四：CRM197A-Hin47融合蛋白的鉴定
Western blot分析纯化的CRM197A-Hin47，以抗CRM197的单抗作为一抗，结果如图6所示，图6为CRM197A-Hin47Western-Blotting验证；
Western blot结果表明，纯化得到目标蛋白。
实施例二：CRM197A-Hin47融合蛋白免疫原性研究
选取100至SPF级10～12g的雌性BALB/c小鼠进行免疫原性研究，方法如下：小鼠随机分为10组，每组10只。腹部皮下免疫，免疫体积为0.2mL，各组小鼠免疫的组分及含量信息见表3。分别在第0、14d免疫，于第28d摘眼球采全血，8000rpm离心6min收集样品血清，﹣20℃保存。间接ELISA法测定小鼠血清中抗Hin47、CRM197A蛋白的抗体滴度。
表2 各组小鼠免疫的组分及含量
组号 样品编号 免疫剂量
1 Hin47-1 1μg
2 Hin47-2 5μg
3 Hin47-3 10μg
4 CRM197A-1 1μg
5 CRM197A-2 5μg
6 CRM197A-3 10μg
7 CRM197A-Hin47-1 1μg
8 CRM197A-Hin47-2 5μg
9 CRM197A-Hin47-3 10μg
10 生理盐水 /
每种蛋白分别选取1μg、5μg、10μg三种不同的免疫剂量进行免疫，二针免疫后，采集小鼠的免疫血清，采用间接ELISA法检测血清中抗目标抗原的抗体滴度。
小鼠血清抗体滴度检测的包被抗原分别为CRM197A和Hin47蛋白，检测结果如图7和图8所示，图7为Hin47单体和融合蛋白免疫原性(抗Hin47抗体滴度)比较；图8为CRM197A单体和融合蛋白免疫原性(抗CRM197A抗体滴度)比较。
从图7和图8可以得出，Hin47和CRM197A单体蛋白以1μg、5μg、10μg的剂量免疫小鼠时，小鼠血清中针对两种单体蛋白的抗 体水平随着免疫剂量的增加而逐渐上升；比较同一剂量下单体蛋白和CRM197A-Hin47融合蛋白的免疫原性，可以看出，CRM197A-Hin47融合蛋白并不影响单体蛋白的免疫原性。
实施例三：CRM197A-Hin47-PRP结合疫苗的制备
步骤一：b型流感嗜血杆菌荚膜多糖PRP与CRM197A-Hin47的共价结合
以普通的实验室方法制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖，取适量多糖溶于纯化水中(10mg/ml)，将1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborate，CDAP)溶解到乙腈中(100mg/ml)，按照0.75mg CDAP/mg的比例加入CDAP，活化反应30s。随后加入0.2M TEA(10ul/mg)，调节PH值至9.5，150s后加入融合蛋白CRM197A-Hin47(5mg/ml)，室温反应1h，4℃过夜反应，加入5滴2M甘氨酸溶液终止结合反应。透析过滤后，进行分离纯化。
步骤二：CRM197A-Hin47-PRP的纯化
以Sepharose CL-4B凝胶柱分离纯化结合物，结果如图9所示，图9为CRM197A-Hin47-PRP Sepharose CL-4B凝胶过滤洗脱曲线。
步骤三：结合物中多糖和蛋白含量的测定
CRM197A-Hin47-PRP结合物中采用苔黑酚法测多糖含量，采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。CL-4B不同收集管结合物糖蛋白比如表3所示：
表3 结合物中多糖蛋白含量及结合反应率
步骤四：配制CRM197A-Hin47-PRP结合疫苗
以纯化的CRM197A-Hin47-PRP为原料配制疫苗半成品，经灌装环节制备疫苗样品，疫苗剂型可以是液针，也可以是冻干粉针。
实施例四：CRM197A-Hin47-PRP结合疫苗免疫原性研究
CRM197A-Hin47-PRP结合物免疫原性研究采用以下方法，选取6周龄雌性BALB/c小鼠，每组10只，共5组，各组免疫情况见表4所示，阴性对照组免疫NS。每组小鼠免疫2针，间隔2周，最后一周免疫后14天摘眼球采集全血，ELISA法测定抗PRP、Hin47抗体效价。
表4 CRM197A-Hin47-PRP免疫原性研究
ELISA测定抗体滴度，如图10和图11所示：图10为不同载体结合物两次免疫后PRP免疫原性；图11为不同载体结合物两次免疫后Hin47免疫原性。
从图10和图11可以得出：不同载体蛋白的PRP结合物免疫小鼠，CRM197A-Hin47-PRP能够刺激机体产生较强免疫原性，且免疫原性要明显高于CRM197-PRP，Hin47-PRP或PRP。
实施例五：CRM197A-Hin47-Hia多糖结合物的免疫原性研究
以CRM17A-HIN47-PRP结合物制备的方法制备CRM197-Hin47-Hia多糖蛋白结合物，并进行免疫原性的研究。
实验分组见表5所示，选用SPF级雌性BALB/c小鼠，10～12g，将小鼠随机分为4组，每组10只。腹部皮下免疫，免疫2针，间隔2周，最后一周免疫后14天摘眼球采集全血，ELISA法测定抗a型流感嗜血杆菌荚膜多糖的抗体滴度。
表5 CRM197A-Hin47-Hia免疫原性研究
ELISA测定抗体滴度，图12为不同载体结合物两次免疫后Hia免疫原性比较。可见，CRM197A-Hin47载体蛋白能够有效地增强a型流感嗜血杆菌荚膜多糖的免疫原性。
以CRM197A-Hin47融合蛋白为蛋白载体与多糖抗原形成的结合物产生的免疫反应明显强于以CRM197A或者Hin47为载体蛋白的结合物所产生的免疫反应，这说明CRM197A-Hin47融合蛋白可有效提高多糖抗原的免疫原性。此外，以CRM197A-Hin47为载体的结合物可以激发机体产生的抗Hin47的抗体滴度可预防不分型流感嗜血杆菌引起的中耳炎。
以上详细描述了本发明的实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体，其特征在于，所述蛋白载体为CRM197A-Hin47融合蛋白，选自：
(n)CRM197A-linker-(n)Hin47，(n)Hin47-linker-(n)CRM197A，
(Hin47-linker-CRM197A)n，
(CRM197A-linker-Hin47)n，
其中，n为该单体基因的分子数，n＝1、2或3，linker选自：G4S、DL或EL。
2.权利要求1所述的一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体，其特征在于，n为1。
3.权利要求1所述的一种增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体，其特征在于，所述蛋白载体为CRM197A-G4S-Hin47。
4.一种权利要求1所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体的制备方法，其特征在于：由CRM197A基因序列和Hin47基因序列作为模板，通过over-lap PCR扩增出融合基因；所述融合基因和pET 9a表达载体均经BamHI和NdeI双酶切后通过T4连接酶进行连接；通过酶切鉴定表明成功连接后，经IPTG诱导后进行表达；从发酵液中分离纯化获得所述CRM197A-Hin47融合蛋白。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述CRM197A基因序列和所述Hin47基因序列按照1:1的比例通过over-lap PCR扩增得到融合基因。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于:对所述CRM197A-Hin47融合蛋白进行表达的方式包括原核表达、酵母表达或真核表达。
7.一种结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗为权利要求1所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体与多糖抗原的结合物。
8.权利要求7所述的一种结合疫苗，其特征在于，所述抗原为多糖抗原，选自b型流感嗜血杆菌荚膜多糖PRP或a型流感嗜血杆菌荚膜多糖Hia。
9.一种权利要求7-8任意一项所述的结合疫苗的制备方法，其特征在于，通过CDAP/CNBr或者还原胺法将多糖抗原和权利要求1所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体偶联，经CL-4B纯化制备得到。
10.如权利要求9所述的结合疫苗的制备方法，其特征在于:所述多糖抗原与所述的增强多糖抗原免疫原性的蛋白载体的比例为1:1。
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