CN1064311A - 发酵生产甘露醇的方法和允许进行这种发酵的微生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵生产甘露醇的方法，其中包括在 需氧条件下，使用微生物，特别是接合酵母发酵含有 作为主要碳底物之葡萄糖、蔗糖、果糖和/或山梨醇 的培养基，然后回收培养基中积聚的甘露醇。本发明 还涉及用于该方法的微生物。

Description

本发明涉及使用特定微生物发酵生产甘露醇的方法。

本发明还涉及能够以高生产率产生实质量甘露醇的微生物，特别是能够由葡萄糖过量产生甘露醇的酵母。

甘露醇是一种六元醇，为山梨醇的异构体，可广泛用于食品和医药工业。

市场购得的甘露醇差不多都是用化学手段，经催化水解甘露醇的前体物之一，即果糖或甘露糖而制得的。

果糖通常是经水解蔗糖或酶促淀粉水解物的异构化而得到的。在这两种情况下，水解或异构化后得到不足50%的果糖，因而在氢化后得到不到25%的甘露醇连同高达75%的甘露醇异构体，即山梨醇。

甘露糖通常是用钼酸使淀粉水解物产生化学上的差向异构得到的。在这种情况下，可得到30%的甘露糖，并且在对这种差向异构化的淀粉水解物进行酶促异构后可得到含30%甘露糖、30%果糖和40%葡萄糖的糖浆。这样，即可在水解后使用第一途径得到30%的甘露醇，而使用第二个途径约得到45%。在这两种情况下，在产生甘露醇的同时，仍伴有其山梨醇异构体（产量分别为70%和55%），这样就带来继后分离这些异构体的特殊问题。

因此，一段时间来一直在试图发展能在没有形成山梨醇的情况下生产甘露醇的方法，即是说以高产率并且由便宜的原料，如淀粉水解物，次之是蔗糖，再次是果糖来生产甘露醇。

这些方法很早以前就已在科技文献或专利中描述过，它们基本上都是发酵方法，因为只有酶才能够完成立体有择氢化作用。

因此，自1966年就提出由葡聚糖废水中含有的果糖来制备甘露醇，且所用的微生物是属于短乳杆菌（Lactobacillus  brevis）的微生物（L.WUNSCHE，K.SATTLER  and  U.BEHRENS：“Zeitschrift  für  Allgemeine  Mikroniologie”，Vol，6，No.4，1966，pp.323-328）。这样，含有80g/L果糖的培养液发酵后约24小时内可提供56g/L的甘露醇，即平均生产能力为56g/L/天。

AJINOMOTO使用属于肠膜状明串珠菌（Leuconostoc  mesenteroides）的乳酸菌发酵富含葡萄糖的果糖培养基，以较高浓度达到了相似的产率（1987年10月20日公开的日本专利申请JP62-239995）。因此发酵含200g/L果糖和100g/L葡萄糖的培养液，有可能在60小时内提供195g/L的甘露醇，生产能力高达78g/L/天。在这种类型的细菌发酵中，只有果糖被转化为甘露醇;葡萄糖则用作能源并产生细菌生物量。

尽管这些细菌有很高的生产能力，但在工业中绝不可能使用这些以果糖作为原料的方法来制造甘露醇，因为这种果糖原料成本太高使含有果糖的残留物得不到充分利用。

因此，一直试图发展使用便宜而且容易得到的原料如葡萄糖或淀粉水解物，以及其次选用的蔗糖的发酵方法。

1966年，FODA和他的同事使用产黄青霉（Penicillium  chrysogenum）发酵葡萄糖溶液（50g/L），6天内得到24g/L甘露醇，即平均生产能力为4g/L/天（J.Microbiol.U.A.R.1966，1（1），pp.97-115）。

1967年，Secretary  of  Agriculture  of  the  USA（美国专利3，427，224）使用亮白曲霉（Aspergillus  candidus）发酵葡萄糖溶液（180g/L），10天内得到85g/L的甘露醇，即平均生产能力为8.5g/L/天。

1968年，Noda  Inst.for  Scient.Research（美国专利3，622，456）使用生甘露醇球拟酵母（Torulopsis  mannitofaciens）发酵葡萄糖溶液（200g/L），10天内得到56g/L的甘露醇，即平均生产能力为5.6g/L/天。

1982年，Institute  de  Microbiologie  de  1′Academie  des  Sciences  de  Bielorussie（苏联专利证书1，033，543）使用斜卧青霉（Penicillium  decumbens）发酵葡萄糖或蔗糖溶液（30g/L）得到终浓度为大约15g/L的甘露醇，即生产能力为3-5g/L/天。

1984年，Kao  Corp.（日本专利申请JP61-35789）使用蚕色球拟酵母（Torulopsis  bombicola）从葡萄糖溶液（100g/L）制得终浓度约12g/L的甘露醇，其生产能力为2.4g/L/天。

另外，1984年，National  Food  Research  Jnstitute  of  Japan（日本专利申请JP62-21509）也使用球拟酵母由葡萄糖溶液（200g/L）制得终浓度约42g/L的甘露醇，其生产能力为5g/L/天。

1985年，Institute  de  Microbiologie  de  1′Academie  des  Sciences  de  Bielorussie（苏联专利证书1，325，073）使用蜜蜂生球拟酵母（Torulopsis  apicola）也从葡萄糖溶液（100g/L）得到终浓度约15g/L的甘露醇，其生产能力为4g/L/天。

最后，1987年，HENDRICKSEN及其同事（J.Chem.Tech.Biotechnol.1988，43，pp.223-228）使用粗糙青霉（Penicillium  scabrosum）从蔗糖溶液（150g/L）得到终浓度40g/L的甘露醇，其生产能力为3.3g/L/天。

然而，绝不可能使用这些以葡萄糖或蔗糖等廉价原料制备培养液的方法工业化生产甘露醇，原因在于所用的微生物的生产能力差，每天每升发酵液总是不超过10g甘露醇，而且葡萄糖转化为甘露醇的产率低，再加上发酵液中甘露醇的终浓度也很低。

因此要求发展不仅能从廉价原料生产甘露醇，而且在生产能力、产率及产物浓度上均适于工业应用的方法。

本发明的目的在于提供能够以每天每升发酵液多于10g甘露醇的生产能力、以同一级数的产率或高于化学上得到的转化率即高于所用葡萄糖45%的转化率、和以发酵液中不少于70g/L的甘露醇终浓度由葡萄糖或蔗糖产生甘露醇的微生物，以及使用这些微生物的方法。

在使用碳底物，特别是葡萄糖、蔗糖、果糖和/或山梨醇发酵生产甘露醇的工业方法中可使用各种有关微生物，条件是这些微生物应具有高于每mg蛋白质高于0.8单位，较好是高于1.5单位的甘露醇脱氢酶活性，以及至少一个选自下列者的酶促系统：

-能够使葡萄糖转化为果糖的酶促系统（如果葡萄糖为起始产物），

-能够使山梨醇转化为果糖的酶促系统，

-1-磷酸甘露醇脱氢酶。

本说明书中，除特别指出者外，酶促活性都是以葡萄糖→甘露醇的反应方向给出的。并且这些活性均以单位数/mg细胞总蛋白来表示。

有两种甘露醇脱氢酶，一种是依赖NAD的甘露醇脱氢酶，另一种是依赖NADP的甘露醇脱氢酶，上述定义中使用的是这些活性的总合。

分类为EC.1.1.1.138的NADP依赖性甘露醇脱氢酶（参见Enzyme  Nomenclature  1984，Academic  Press  Inc.）是一种能够进行果糖到甘露醇的可逆转化的酶。该可逆反应伴有辅因子NADP（H2）的还原或氧化，从而可使乳酸菌如短乳杆菌或肠膜状明串珠菌能够很有效地将果糖，且只有将果糖转化成甘露醇。

分类为EC1.1.1.67的NAD依赖性甘露醇脱氢酶是一种能完成果糖到甘露醇的同样可逆转化反应的酶，但该反应伴有辅因子NAD（H2）的还原或氧化作用。

最好使用NADP依赖性甘露醇脱氢酶活性高于NADP依赖性甘露醇脱氢酶活性的微生物，且至少高2倍，一般要高5倍。另外，优选使用NADP依赖性甘露醇脱氢酶活性高于0.8单位/mg的微生物。

与上述细菌不同的是，本发明的微生物具有下列酶促系统：

-可使葡萄糖和/或山梨醇可逆地转化为果糖的酶促系统，以及

-1-磷酸甘露醇脱氢酶。

能使葡萄糖可逆地转化为果糖的酶促系统有很多，它们可由单个酶或一系列酶组成。

例如，可使用木糖（或葡萄糖）异构酶：EC5.3.1.5直接使葡萄糖异构化变成果糖。

在用6-磷酸葡萄糖异构酶：EC5.3.1.9使葡萄糖异构化成6-磷酸果糖之前，还可用葡糖激酶或己糖激酶：EC2.7.1.2或EC2.7.1.1使葡萄糖磷酸化，最后在果糖-6-磷酸酶EC3.1.3.23的作用下去磷酸，成为果糖。

也可在6-磷酸甘露醇脱氢酶：EC1.1.1.140的作用下，使按上述途径生成的6-磷酸果糖还原成6-磷酸山梨醇，然后借助山梨醇-6-磷酸酶：EC3.1.3.50使之去磷酸生成山梨醇，最后再在L-艾杜糖醇脱氢酶：EC1.1.1.14的作用下氧化成果糖。

也已知道醛糖-6-磷酸还原酶：EC1.1.1.200能够使6-磷酸葡萄糖还原成6-磷酸山梨醇，从而可避免6-磷酸果糖的生成，使上述序列缩短。

最后，还知道醛糖还原酶：EC1.1.1.21能直接将葡萄糖还原成山梨醇，而且上述L-艾杜糖醇脱氢酶能够将该山梨醇特异地氧化成果糖。

1-磷酸甘露醇脱氢酶：EC1.1.1.17是一种能够将6-磷酸果糖还原成1-磷酸甘露醇的酶，该酶存在于能由葡萄糖产生甘露醇的微生物中。在本发明的情况下，微生物最好具有高于0.1单位/mg的1-磷酸甘露醇脱氢酶活性。事实上，可借甘露醇-1-磷酸酶：EC3.1.3.22使1-磷酸甘露醇很容易地去磷酸，成为甘露醇。

此外，本发明还涉及发酵生产甘露醇的方法，其中使用本发明的微生物在通气条件下发酵以葡萄糖、蔗糖、果糖和/或山梨醇作为主要碳底物的培养基，且其中还包括发酵后回收培养基中积累的甘露醇。

申请人不想拘泥于任何理论或解释，而只是相信甘露醇脱氢酶的高活性（其前提是要有用于本方法的微生物，而且该活性高于0.8单位/mg蛋白质，更好高于1.5单位/mg蛋白质），如果与能够从葡萄糖产生果糖的代谢序列相联合，便使之有可能在实质上指导葡萄糖至甘露醇的可逆代谢转化向着甘露醇合成的方向进行。在微生物能够通过1-磷酸甘露醇途径由葡萄糖合成甘露醇的情况下，虽然甘露醇脱氢酶的存在似乎并不是必须的，但本申请人认为这些指导甘露醇合成的酶的高活性，可阻止由1-磷酸甘露醇途径形成的甘露醇在果糖水平上进入甘露醇循环，从而驱使甘露醇的分泌。

本发明方法的另一个有很大优越性的特征是使用具有高甘露醇脱氢酶活性的微生物，所说的活性具体地是指与借助山梨醇途径，特别是使用醛糖还原酶和L-艾杜糖醇脱氢酶使葡萄糖可逆地转化为果糖的酶促系统偶联的NADP依赖性酶活性。

在本发明的优选微生物中存在这一酶促序列，并进而提供高于0.8单位，特别是高达1.5单位的甘露醇脱氢酶活性，使之不仅能借助这些微生物将葡萄糖转化成甘露醇，而且还显示该途径能顺利地执行其功能，将果糖乃至山梨醇转化成甘露醇，后一个转化作用导致了培养液中甘露醇的分泌。

可利用的碳底物中，特别有利的是葡萄糖，以及所有含葡萄糖、蔗糖和/或果糖的培养基或付产品。另外这些微生物还可能用于某种制造甘露醇的工艺方法中，其中设计所说的方法是为了再利用按化学方法得到的甘露醇的结晶母液，再利用那些欲从其中提取所有甘露醇但又难以实现，而且含85-90%山梨醇及其余部分主要由甘露醇组成的母液。

实现本发明的方法，得到甘露醇浓度不少于70g/L的培养基（其有利于产物回收）、生产能力最好是10g/L/天，且产率高于45%（相对于所使用的碳底物），以确保该方法的工业化应用。

本发明方法中使用的微生物可以是细菌、酵母或真菌。

这些微生物较好是真核生物，特别是酵母，其中优选的是接合酵母属酵母，特别是兽氏接合酵母（Zygosaccharomyces  rouxii）。

现有技术中从未提到过由接合酵母生产甘露醇。

可使用本技术领域中已知的方法筛选本发明的微生物，从而可揭示它们的酶促活性，且将在实施例中更详细地描述其中的某些微生物。

可在高渗培养基特别是含500g/L葡萄糖的琼脂培养基上讲行预筛选而选择适用的菌株，然后从所说的培养基上回收形成菌落的菌株。

收集这些菌株并移入装在锥形瓶内的含葡萄糖（150g/L）的聚醇生产型液体培养基中。

在培养后40至50小时从各培养物中收获细胞，然后洗涤并超声破碎之。以20，000g离心基底细胞产物，并在体外用紫外光检测法检测上清液中的甘露醇脱氢酶活性。

只保留那些表现有高于0.8单位/mg总细胞蛋白质之高甘露醇脱氢酶活性的克隆。

有可能筛选样品以得到本发明的微生物，另外有可能应用物理或化学突变方法，以增加得到令人满意之菌株的几率。

此外，对于某些已具有了某些所要求之特征的微生物，有可能用遗传工程技术弥补上述方法，例如有可能向已经由葡萄糖并使用1-磷酸甘露醇途径产生甘露醇的微生物，如球拟酵母或亮白曲霉内引入并表达甘露醇脱氢酶活性，或者可在已由果糖产生甘露醇的微生物，如短乳杆菌或肠膜状明串珠菌中引入和/或扩增能够将葡萄糖可逆地转化为果糖的酶促系统。

因此本申请人已从枯萎的并受到初步破坏的葡萄种子中分离了具有下列特征的微生物菌株：

-培养物，萨布罗氏培养基：白色到乳白色菌落显微镜下外观：在卵圆形细胞上出现多个侧芽，存在含有1至4个圆形子囊孢子的子囊

-葡萄糖：发酵利用

-硝酸盐：不被利用

脲酶：阴性

-使用API  SYSTEM，La  Balme  les  Grottes-38390  MONTALIEU  VERCIEU（France）的ATB32C系统进行鉴定

半乳糖  -

放线菌酮  -

蔗糖  +

N-乙酰氨基葡糖  -

DL-乳酸  -

L-阿拉伯糖  -

纤维二糖  -

棉子糖  -

麦芽糖  +

海藻糖  -

2-酮葡糖酸  -

α-甲基葡糖苷  -

山梨醇  +

木糖  -

核糖  -

甘油  -

鼠李糖  -

宫殿糖（palatinose）  -

赤藓糖醇  -

蜜二糖  -

葡糖醛酸  -

松三糖  -

葡糖酸  +

乙酰丙酸  -

甘露醇  +

乳糖  -

肌醇  -

葡萄糖  +

山梨糖  +

氨基葡糖  -

-在60%葡萄糖酵母浸膏琼脂上生长。

根据上述形态学和化学特性，可将这种微生物分类为接合酵母属和兽氏接合酵母种。

申请人已发现，于1991年2月15日保藏在Collection  Nationale  de  Cultures  de  Microorganismes  of  the  Institut  Pasteur（25  rue  du  Docteur-Roux，75724  Paris  Cedex15）的这种微生物（登记号为I-1044）不同于其他接合酵母，甚至不同于其他酵母，真菌和细菌，这不仅是因为它能够从葡萄糖大量产生甘露醇，而且因为它能够从山梨醇、果糖和蔗糖产生一定量的甘露醇。

因此，为了完成本发明的方法，可使用山梨醇、葡萄糖、蔗糖甚至果糖作为原料，其中优选的是葡萄糖，其次是蔗糖，这是因为这些材料的价格较低。如果在制造甘露醇的母液中含有山梨醇，而且后者作为一种混杂的付产物难以找到处理办法时，利用山梨醇作原料是有利的。另外，利用得自菊粉水解物的果糖作为原料也是很有利的。

这些原料在培养液中的浓度范围可以很宽，但较好是占培养液重量的10-30%，即一般超过100g/L。如果原料是葡萄糖，可望在大约200g/L的浓度时获得最高生产能力。如上面已提到的，也可考虑使用其他原料，例如利用果糖并以菊粉水解物的形式，或作为制造葡聚糖时的残渣来使用。

用于本发明方法之微生物生长所需要的含氮材料可由许多有机来源的物质，如胨、蛋白水解物、玉米浆、鱼粉、酵母浸膏和尿素等组成。

微生物生长所需要的无机材料，特别是镁，可作为杂质包含在发酵原料中或含氮材料中。必要时也可将它们加入到培养基中。同样，必要时还可按常规方法加入维生素或微量元素。

发酵可以是有氧发酵或无氧发酵。在使用优选微生物的情况下，可进行有氧发酵，并且通常在25至35℃的温度下完成。发酵开始时首先是接种在相似培养基中培养过的微生物。

鉴于本发明的微生物给出极好的生产能力，故发酵通常在大约3至5天内即可完成，具体地说，这一发酵时间是培养液中原料浓度的函数，以致不考虑以有限量存在的培养基的其他成分。

发酵结束时，按传统方法（包括使用活性炭和离子交换树脂）对培养基进行过滤、脱色和去矿物质。浓缩这些纯化的培养液后，即可以结晶物形式从中提取出甘露醇。

借助下列实施例可更好地了解本发明，这些实施例只是帮助进一步阐述本发明，而不是缩小本发明的范围。

对已保藏在CNCM（保藏登记号I-1044）的接合酵母菌株LO06-19的研究

细胞的收获和洗涤

按实施例1中所述方法，在发酵40至50小时后离心（8，000g，10分钟，4℃）收获甘露醇生产发酵中形成的生物量，然后除去上清液。

在与起始样品等体积的含1mM  β-巯基乙醇的100mM  Tris-HCI缓冲液（pH7.0）中悬浮生物量沉淀物，以清洗细胞。再次离心细胞悬浮液并除去上清。

酶提取物的制备

按下列比例制备细胞的浓缩悬浮液：每1g含1mM  β-巯基乙醇的100mM  Tris-HCl缓冲液（pH7.0）中含有1g（湿重）细胞。

对细胞悬浮液进行超声处理，以破碎细胞。处理时间为20分钟。在此期间，必须使用冷却系统冷却含有细胞悬浮液的玻璃试管或小瓶，以避免使细胞悬浮液受热到5℃以上。

离心（20，000g，30分钟，4℃）除去细胞碎片及未破坏的细胞。上清液即构成了含酶提取物，其细胞内蛋白质浓度为3-15g/L，用LOWRY等人（1951）的方法检测总细胞蛋白质含量。

酶促试验

为了更客观地进行比较，须在下列最适条件下检测酶促活性：

-在底物浓度相当于酶反应之最大速度（饱和底物浓度：SSC）的条件下进行活性检测。这一速度随着酶的来源因此也即因微生物菌株的不同而变化，并应使用本技术领域中已知的方法逐次确定之。

-检测活性应在酶活性的最适pH下进行，所说的pH值不仅是作为微生物菌株的函数，而且是作为反应方向的函数来确定的。

-在30℃下随机进行活性检测。

本节中其余部分指出的pH值和底物浓度只与应用于接合酵母种的参数有关。

反应混合物：

-在己糖醇（果糖/甘露醇）形成方向检测NAD和NADP依赖性甘露醇脱氢酶

50mM  Tris-马来酸盐缓冲液，pH5.8（最适pH）;

1M果糖（饱和底物浓度，SSC）;NADH2或0.33mM NADPH₂

-在磷酸己糖醇形成方向检测1-磷酸甘露醇脱氢酶和6-磷酸山梨醇脱氢酶

50mM  Tris-马来酸盐缓冲液，pH6.1（最适pH）;

100mM  6-磷酸果糖（饱和底物浓度，SSC）;

0.33mM NADH₂。

事实上，该反应介质中检测的是两种作用的总和;为了区别它们，可在磷酸己糖形成的相反方向上进行检测。

-以磷酸己糖形成的方向检测1-磷酸甘露醇脱氢酶

50mM  Tris-马来酸盐缓冲液，pH7.9（最适pH）;

150mM 1-磷酸甘露醇（SSC）;10mM MgCl₂;

3mM  NAD

-以磷酸己糖形成的方向检测6-磷酸山梨醇脱氢酶

50mM  Tris-马来酸盐缓冲液，pH7.9（最适pH）;

150mM 6-磷酸山梨醇（SSC）;10mM MgCl₂;

3mM  NAD。

还原反应混合物的终体积为3ml。加入1-20μl含酶提取物后开始反应。直接在分光光度分析用样品杯（大小为1cm×1cm×3cm）内于30℃进行保温。经读出在340毫微米波长处的吸光率变化而测知还原态辅因子浓度的变化。调整引入分析中的含酶提取物的量，以使每分钟吸光率变化值在0.05至0.15之间。

每次活性检测均须减去相应空白对照的值。空白对照是使用没有底物的反应混合物制备的。酶促反应进行的时间为2分钟。

结果用每毫克蛋白质中的活性单位数表示。1单位相当于每分钟消耗1微摩尔底物。底物浓度的变化相当于还原态辅因子的变化值，后者在340毫微米处的光吸收系数为6.3L/毫摩尔/cm（氧化态辅因子在该波长处没有吸收）。

结果（45小时）

-NAD依赖性甘露醇脱氢酶：0.5单位/mg

-NADP依赖性甘露醇脱氢酶：5.84单位/mg

-1-磷酸甘露醇脱氢酶+6-磷酸山梨醇脱氢酶（磷酸多醇形成方向）：0.04单位/mg

-1-磷酸甘露醇脱氢酶（磷酸已糖形成方向）：0.84单位/mg

-6-磷酸山梨醇脱氢酶（磷酸已糖形成方向）：0.15单位/mg。

实施例1

由葡萄糖生产甘露醇

在琼脂培养基（培养基A）上将具有上述特性的接合酵母LO06-19菌株于37℃培养72小时。用该培养物接种在含有150ml培养基B的500ml锥形瓶内制备的培养物。在以每分钟240次振荡的摇床上37℃预培养24小时。将150ml预培养物移入一个2.5L发酵器（INTERSCIENCE商标，LABO2000型）中进行甘露醇生产培养。发酵器内含有1.35L葡萄糖基培养基C（150g/L）。

培养基A、B和C的组成

培养基A

酵母浸膏：59/L

葡萄糖：20g/L

琼脂：18g/L

终pH：7.0

灭菌：115℃，20分钟

培养基B

Biotrypcase：5g/L

葡萄糖：50g/L

玉米浆（干）：2.5g/L

KH₂PO₄：3g/L

MgSO₄（7H₂O）：1g/L

用NaOH将pH调到：5.7-6.0

灭菌：120℃，15分钟

培养基C

酵母浸膏：3g/L

葡萄糖：155g/L

KH₂PO₄：2g/L

MgSO₄（7H₂O）：1g/L

终pH，未调整：-

灭菌：120℃，15分钟

发酵条件如下：

温度：37℃

空气流速：2L/分钟（＝1.3V/V/分钟）

搅拌：900转/分钟

时间：116小时（＝4.8天）

当终止生产培养时，离心发酵液以从液相中分离出生物量。用高效液相层析法（HPLC）检测上清液中产生的甘露醇的浓度，浓度达79/L。因此发酵工艺的生产能力为16.3g/L/天且葡萄糖/甘露醇转化率为51%，所有葡萄糖均消耗掉。

实施例2

由山梨醇生产甘露醇

方法同实施例1所述。将接合酵母LO06-19菌株接种到培养基A和B中，然后移入含培养基D的发酵器中，培养基D的组成基本上与培养基C相同，只是用150g/L山梨醇取代葡萄糖。

发酵进行112小时（4.6天），发酵结束后同样用HPLC检测甘露醇，测得其浓度为94g/L。

发酵48小时后，每毫克蛋白质中甘露醇脱氢酶活性达3单位。

实施例3

由蔗糖生产甘露醇

方法同实施例1和2所述，但本例使用了蔗糖基培养基E（150g/L）。

发酵进行88小时（3.7天），发酵完成后检测甘露醇含量。

测量浓度为100.4g/L，而残留的蔗糖浓度小于1g/L。

发酵45小时后，测得NADP依赖性甘露醇脱氢酶活性为2.2单位/mg蛋白质;NAD依赖性甘露醇脱氢酶活性为0.35单位/mg蛋白质。

实施例4

由果糖生产甘露醇

方法同实施例1、2和3中所述，但其中使用果糖基培养基F（150g/L）。

发酵进行70小时（2.9天），且测得发酵液中的甘露醇浓度为108.5g/L。

NADP依赖性甘露醇脱氢醇活性为3.9单位/mg蛋白质，NAD依赖性甘露醇脱氢酶活性为0.4单位/mg蛋白质。

实施例5

由浓缩的淀粉水解物生产甘露醇

使用由本申请人推向市场的NUTRIOSE（R）74/968型含有95%真葡萄糖和5%二糖及多糖的淀粉水解物作为发酵原料。

用自来水稀释该淀粉水解物，使其中碳水化合物浓度为210g/L，即真葡萄糖浓度为200g/L，然后加入4g/L酵母浸膏，2g/L KH₂PO₄和1g/L MgSO₄·7H₂O。

将1.35升混合物引入2.5升发酵器中，整个于120℃下灭菌15分钟。

冷却至37℃后，在实施例1所述条件下接种该发酵器，然后发酵115小时（4.8天），发酵结束后检测甘露醇产生量。

结果发现其浓度102g/L，而残留的麦芽糖和寡糖浓度小于8g/L。

45小时后NADP依赖性甘露醇脱氢酶活性为4.2单位/mg蛋白质，NAD依赖性甘露醇脱氢酶活性为0.5单位/mg蛋白质。

实施例6

由菊粉水解物生产甘露醇

经石灰处理、脱灰和过滤以纯化富含菊粉的菊苣提取物，然后在本申请人提交的法国专利申请FR8710170号之实施例中所述条件下，使用NOVO  Denmark公司出售的菊粉酶NOVOZYME230进行酶促水解，并以其作为发酵原料。

得到含有10.5%葡萄糖、77%果糖、4%无机物和3.7%蛋白质（N6.25）的糖浆（所有这些浓度均以相对于糖浆中干物质的百分重量表示）。

然后浓缩该糖浆，使之成为代表156g/L总葡萄糖+果糖碳底物的干物质（180g/L）。

该浓缩糖浆中添加3g/L酵母浸膏，2g/L KH₂PO₄和1g/L MgSO₄·7H₂O。

灭菌后，用10%体积的接种物接种该培养基，所说的接种物是在培养基B中将兽氏接合酵母LO  06-19培养24小时而得到的。

在实施例1中所述条件下发酵75小时。

培养液中甘露醇浓度为80g/L，且碳底物完全被发酵利用。

发酵45小时后，NADP依赖性甘露醇脱氢酶活性为3单位/mg蛋白质，NAD依赖性甘露醇脱氢酶活性为0.3单位/mg蛋白质。

Claims (20)

1、特别用于发酵生产甘露醇的微生物，其具有表现高于0.8单位/毫克蛋白质的甘露醇脱氢酶活性及至少一个选自下列者的酶促系统：

-能够使葡萄糖可逆地转化为果糖的酶促系统，

-能够使山梨醇可逆地转化为果糖的酶促系统，以及

-1-磷酸甘露醇脱氢酶。

2、根据权利要求1的微生物，其中甘露醇脱氢酶活性大于1.5单位/毫克蛋白质。

3、根据权利要求1和2的微生物，其具有活性高于0.8单位/毫克蛋白质的NADP依赖性甘露醇脱氢酶。

4、根据权利要求1至3中任一项的微生物，其还具有活性比NADP依赖性甘露醇脱氢酶小的NAD依赖性甘露醇脱氢酶。

5、根据权利要求1至4中任一项的微生物，其具有1-磷酸甘露醇脱氢酶。

6、根据权利要求5的微生物，其中1-磷酸甘露醇脱氢酶活性高于0.1单位/毫克蛋白质。

7、根据权利要求1至6中任一项的微生物，其具有1-磷酸甘露醇脱氢酶和能够使葡萄糖和/或山梨醇转化为果糖的酶促系统。

8、根据权利要求1至7中任一项的微生物，其具有醛糖还原酶。

9、根据权利要求1至7中任一项的微生物，其为真核生物体。

10、根据权利要求8的微生物，其为酵母。

11、根据权利要求9的微生物，其中酵母是接合酵母属（Zygosaccharomyces）的酵母。

12、根据权利要求11的微生物，其中酵母是兽氏接合酵母（Zygosaccharomyces  rouxii）。

13、根据权利要求12的微生物，其为保藏在C.N.C.M.，保藏登记号为No.I-1044的接合酵母或其具有上述特性的突变体之一。

14、发酵生产甘露醇的方法，其中在需氧条件下，使用根据权利要求1至13中任一项的微生物发酵含有作为主要碳底物之葡萄糖、蔗糖、果糖和/或山梨醇的培养基，且其中包括然后回收培养基中积聚的甘露醇。

15、根据权利要求14的方法，其中使甘露醇在培养基中积聚，达到浓度不小于70克/升。

16、根据权利要求14和15之任一项的方法，其中进行发酵以确保生产能力不小于10克/升/天，且产率为所用碳底物的45%以上。

17、根据权利要求14至16中任一项的方法，其中起始培养基中碳底物的浓度为100克/升以上。

18、根据权利要求14至17中任一项的方法，其中碳底物由葡萄糖、山梨醇、果糖、蔗糖或它们的混合物组成。

19、根据权利要求14和15之任一项的方法，其中碳底物由化学合成得到之甘露醇结晶的母液组成。

20、根据权利要求14和15之任一项的方法，其中碳底物由菊粉水解物组成。