CN106417155A - 一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法，将白色羽雪峰乌骨鸡中携带显性白突变即基因型为II和Ii的个体剔除后，再与黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交即可。新建立的白色羽纯系与黄麻色羽纯系杂交后代不会出现类蛋鸡表型的个体，本发明的方法对企业生产鉴定不合格的白羽系个体，并将之淘汰，选育符合要求的白羽系雪峰乌骨鸡具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体地，涉及一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法。
背景技术
雪峰乌骨鸡营养价值高，干物质的粗蛋白含量在76%以上，肉质细嫩，味道鲜美，与含有较高的天门冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸密切相关，且富含人体所必须的多种氨基酸、维生素和微量元素。可调节机体代谢及内分泌，增加人体血红细胞和血色素，具有抗疲劳、调节生理、增强免疫力，提高耐缺氧等功效。
雪峰乌骨鸡白羽系与黄麻羽系杂交后代大部分为黄麻羽，但是会出现类蛋鸡的表型，类蛋鸡表型不符合生产标准，给企业造成经济损失。生产通常做法是标记每只母鸡个体的蛋，待出孵后至羽色稳定观察并记录其羽色，根据后代羽色淘汰不合格的父母代母鸡。该方法有以下缺点：
（1）周期长，从入孵到能够判定羽色至少需要3个月时间；
（2）工作量大，每只母鸡的蛋必须标记清楚；
（3）过程繁琐，容易出错，首先需要在产蛋舍记录每只种蛋的母亲，然后需要在孵化机内对种蛋分组孵化，出雏后对分组的个体带翅号进行标记，在60日龄左右的时候对鸡只进行表型鉴定确认需要淘汰的母鸡，最后是淘汰母鸡；
（4）准确率小于100%。由于是测交的方法，无法保证结果100%的准确。
所以建立一种周期短，速度快，准确率高的剔除不符合要求种鸡的方法，对企业培育新的黄麻羽配套系具有重要意义。
发明内容
白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交会出现类蛋鸡表型，这种羽色表型是生产上不希望出现的。不同的毛色相关基因的变异导致了个体不同的毛色表型，众多动物中的研究结果都显示PMEL17基因控制羽色形成。研究了杂交后类蛋鸡表型和黄麻羽表型个体显性白突变位点的基因型情况，结果显示所有类蛋鸡个体均为显性白杂合子，而黄麻羽个体均为野生型等位基因，类蛋鸡表型均为显性白杂合子Ii，而黄麻羽个体则为野生型纯合子ii，确认了导致类蛋鸡表型个体的原因是显性白突变。根据研究结果可以确认类蛋鸡表型个体是由于显性白突变导致，因此只需将携带显性白突变等位基因的白色羽个体剔除，剩余的白色羽个体与纯系的黄麻羽杂交后代就不会出现类蛋鸡表型个体，从而建立新的白色羽雪峰乌骨鸡纯系，新建立的白色羽纯系与黄麻色羽纯系杂交后代不会出现类蛋鸡表型个体。
为了克服白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交会出现类蛋鸡表型，本发明提供一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法，将白色羽雪峰乌骨鸡中携带显性白突变即基因型为II和Ii的个体剔除后，再与黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交即可。
优选地，上述避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法，具体包括以下步骤：
S1. 抽取白色羽雪峰乌骨鸡的血样DNA，以SEQ ID NO：1～2所示引物进行PCR扩增；
S2. 纯化S1的PCR产物，以SEQ ID NO：3所示延伸引物进行延伸反应；
S3. 测序分型，将白色羽雪峰乌骨鸡中携带显性白突变即基因型为II和Ii的个体剔除后，再与黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交即可。
优选地，S1所述PCR扩增的体系为： DNA，1ul；10×buffer，1.5ul；25mmol MgCL2，1.5ul；DMSO，0.5ul；DNTP，0.3ul；20pmol/ul混合引物，0.15ul；Taq酶，0.3ul；H2O补至15ul；PCR扩增条件：95°C，3min；94°C，15s；62°C，15s；72°C，30s；72°C，3min；35个循环。
优选地，S2中延伸反应的体系为：PCR产物，2ul；Snapshot Mix，1ul；延伸引物，2ul；H2O补至6ul；延伸条件为：96°C，1min；96°C，10s；52°C，5s；60°C，30s；30个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）周期短，速度快。从拿到待检个体血样到决定被检个体的选淘只需要2天时间，每人每天至少可以完成144个体的检测。
（2）准确率100%。由于该方法是直接检测白羽个体是否携带导致后代出现类蛋鸡表型的致因突变，因此准确率为100%。
（3）环节少，不易出错。整个过程只涉及采样和基因型分型两个步骤，因此不易出错。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、被检个体样本采集：白色羽与黄麻羽杂交后代48只，其中24只类蛋鸡表型个体和24只黄麻羽个体。采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL 2%无菌EDTA（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。
2、待测样本DNA 抽提：基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法（奥斯泊F等，1998）：
（1）取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL 1×SET缓冲液、12.5μL 20% SDS和6μL 10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
（2）取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（3）取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（4）取上清，加入500μL氯仿-异戊醇（23：1）轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（5）取上清，加入1mL冰无水乙醇（-20℃），来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
（6）用1mL 75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
（7）待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
（8）存放于-20℃冰箱中保存备用。
3、被检个体基因分型
（1）PCR扩增
引物片段F1：GAGCATCCCCAGCCGCCAGT，引物片段R1：TCACCGGTAGGTGTAGGCAG；PCR扩增体系为： DNA，1ul；10×buffer，1.5ul；25mmol MgCl2，1.5ul；DMSO，0.5ul；DNTP，0.3ul；20P混合引物，0.15ul；Taq，0.3ul；H2O补至15ul；PCR扩增条件：95°C，3min；94°C，15s；62°C，15s；72°C，30s；72°C，3min；35个循环。
（2）PCR产物纯化
扩增后取3ul PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的dNTP。纯化体系：PCR产物，3ul；ExoI，0.2ul；FastAP，0.8ul；ExoI buffer，0.7ul；H2O补至7ul；纯化条件：37°C，15min；80°C，15min。纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物。
（3）延伸反应
延伸体系为：PCR产物，2ul；Snapshot Mix，1ul；延伸引物混合液，2ul；H2O补至6ul；延伸条件为：96°C，1min；96°C，10s；52°C，5s；60°C，30s；30个循环，Snapshot试剂盒购于ABI公司。
（4）测序分型
取1ul延伸产物，加8ul上样loading buffer，95°C变性3min，立即冰水浴，测序仪型号为ABI 3730XL。
4、结果与分析：分型结果见表1，所有的杂交后代的类蛋鸡表型个体均为显性白杂合子，而黄麻羽个体均为野生型的个体，结果说明显性白位点是造成类蛋鸡表型的致因突变。
表1 不同表型后代目的位点分型结果统计
注：“II”表型显性白纯合子，“Ii”表示显性白杂合子，“ii”表示野生型。
实施例2：剔除雪峰乌骨鸡白羽系携带显性白突变的个体
一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法，主要关键点在于将白羽系雪峰乌骨鸡中携带显性白突变个体剔除，组建新的白羽系，确保新组建的雪峰乌骨鸡白羽系与黄麻鸡杂交后代不会出现类蛋鸡表型。具体方法步骤如下：
1、样本采集：对某企业白羽系雪峰乌骨鸡所有个体进行样本采集。方法同实施例1中的步骤1。
2、DNA 抽提：被检个体血样DNA抽提，方法同实施例1中的步骤2。
3、被检个体基因分型：方法同实施例1中的步骤3。
4、不合格个体的淘汰：根据步骤3的结果，将携带显性白突变即基因型为II和Ii的个体淘汰。
5、后代表型观察：观察选淘后的白羽系与黄麻羽系杂交后代羽色表型并没有类蛋鸡表型出现。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代
的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcaccggtag gtgtaggcag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcaccgtg gggctgct 18
Claims (4)
1.一种避免白色羽雪峰乌骨鸡和黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交出现类蛋鸡表型后代的方法，其特征在于，将白色羽雪峰乌骨鸡中携带显性白突变即基因型为II和Ii的个体剔除后，再与黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1. 抽取白色羽雪峰乌骨鸡的血样DNA，以SEQ ID NO：1～2所示引物进行PCR扩增；
S2. 纯化S1的PCR产物，以SEQ ID NO：3所示延伸引物进行延伸反应；
S3. 测序分型，将白色羽雪峰乌骨鸡中携带显性白突变即基因型为II和Ii的个体剔除后，再与黄麻色羽雪峰乌骨鸡杂交即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1所述PCR扩增的体系为： DNA，1ul；10×buffer，1.5ul；25mmol MgCl2，1.5ul；DMSO，0.5ul；DNTP，0.3ul；20 pmol/ul混合引物，0.15ul；Taq酶，0.3ul；H2O补至15ul；PCR扩增条件：95°C，3min；94°C，15s；62°C，15s；72°C，30s；72°C，3min；35个循环。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，S2中延伸反应的体系为：PCR产物，2ul；Snapshot Mix，1ul；延伸引物，2ul；H2O补至6ul；延伸条件为：96°C，1min；96°C，10s；52°C，5s；60°C，30s；30个循环。
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| US20030224392A1 (en) * | 2002-01-28 | 2003-12-04 | Manuel Engelhorn | Method for identification of mutant antigens with enhanced immunogenicity |
| CN101990857A (zh) * | 2009-08-18 | 2011-03-30 | 江苏省家禽科学研究所 | 速生型丝羽乌骨鸡品系的培育方法 |
| CN103571963A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-12 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN103602744A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN103602745A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡pmel17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
-
2016
- 2016-07-20 CN CN201610572231.9A patent/CN106417155A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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