CN105154571B

CN105154571B - 一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物及鉴定方法

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Publication number: CN105154571B
Application number: CN201510680524.4A
Authority: CN
Inventors: 李兰会; 张秀玲; 李祥龙; 臧素敏; 张乐超; 刘春杨; 周荣艳
Original assignee: Heibei Agricultural University; Hebei Normal University of Science and Technology
Current assignee: Heibei Agricultural University; Hebei Normal University of Science and Technology
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2035-10-19
Also published as: CN105154571A

Abstract

本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，该引物的正向引物为1305s：5’CCTCCTTGCCAAACCTTA3’；反向引物为1305a：5’ATCAGCCAGATCCGTCAG3’。该引物特异性好，扩增效率高，可用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。本发明还提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，该方法与上述引物配合进行实验，操作简便，可行性高，可以解决快慢羽鉴定中存在的鉴定标准不够明确、鉴定结果准确率不高、雌雄配套系建系时间长、鉴定时间有限制的问题。

Description

一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物及鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物及鉴定方法。

背景技术

雌雄鉴别是现代养鸡生产中的重要技术，由于鸡为ZW型性别决定，快慢羽基因位点位于Z染色体上，慢羽是显性基因，因而目前很多种鸡场通过筛选培育纯慢羽系和纯快羽系种群，通过慢羽母鸡与快羽公鸡杂交的商品代雏鸡快慢羽自别雌雄，快羽雏鸡为母鸡，而公鸡为慢羽。快慢羽的区分主要是由初生雏鸡翅膀上的主翼羽和覆主翼羽的长短来确定。

快慢羽自别雌雄的鉴定方法最主要的问题是在能进行准确鉴定的时间上有一定的限制，一般进行羽速鉴定只有在雏鸡出雏后24h内才可以进行。此外，要实现羽速自别雌雄，需要构建相应的配套系，通过羽速表型构建配套系至少需要经过2～3个世代才能实现，并且建系时需从雏鸡开始。最后，快慢羽的鉴别方法本身也是不够明确的，当前普遍认为雏鸡出生时，主翼羽长于覆主翼羽2mm以上的为快羽，主翼羽比覆主翼羽长2mm以下、等长或略短的为慢羽，但有时候2mm的差别是不容易辨别的。由于存在以上不足，使快慢羽区分性别技术的推广与应用受到限制，因此很多企业目前仍采用翻肛等其他传统方法雌雄鉴别。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，该引物特异性好，扩增效率高，可用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。

本发明的第二目的在于提供一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，该方法可以解决快慢羽鉴定中存在的鉴定标准不够明确、雌雄配套系建系时间长、鉴定时间有限制的问题。

一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。

通常说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。

一般引物长度为18～30碱基，本发明所述引物长度为18个碱基。由于熵的原因，较短的引物退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大，因而本发明所述的引物具有很高的扩增效率。

一般引物序列中G+C含量一般为40％～60％，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。本发明所述引物SEQ ID NO:1中G+C含量为50％，SEQ ID NO:2中G+C含量为55.6％，且碱基分布随机，因而具有适中的解链温度，便于扩增。

所述引物自身不存在互补序列(连续互补碱基小于3bp)；引物3’端无修饰不易错配；最终扩增产物长度为1305bp，容易成功扩增出目的片段。

综上，该引物特异性好，扩增效率高，可很好的用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。

一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，包括以下步骤：

1)、模板DNA的提取：从鸡血凝块或抗凝鸡血中提取总DNA；

2)、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物，以1)所提取的总DNA为模板进行PCR扩增；

3)、将2)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；

4)、对3)中的电泳结果进行分析。

优选的，如上所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，在步骤1)中，所述模板DNA从鸡血凝块或鸡抗凝血中提取。

用血凝块法提取DNA模板的优点是鸡血处理和保存条件较为简单，不需要额外的抗凝处理，且可保存较长时间。该方法操作较为简便，无需特殊设备，适合一般实验室开展。

抗凝全血在2～8度可保存达两个月，但随保存时间的增加，DNA的得率和完整性会受影响。抗凝血的DNA更易抽提，且更稳定，DNA含量高。

应当注意的是，依据现有技术或其他可能的技术从鸡血中提取DNA并制备扩增模板，也可以用于本发明。

优选的，所述PCR扩增反应体系为：

其中，上述引物的浓度均为8～12μM；

上述从鸡血凝块或抗凝鸡血中提取的DNA的浓度一般可达到200～300ng/ul，而其在PCR扩增体系中的浓度达到2.5ng/ul以上即可。

本发明涉及同一体系或配比中各组分的量，应视为对相关各组分之间比例关系的限定，而不是对各自用量绝对值的限定，各组分之间的比例关系可适当改变。

2×Es mix是2倍浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs和缓冲液。

Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性，可在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的催化活性；Mg²⁺是Taq DNA聚合酶的辅酶，其浓度直接影响着酶的活性与特异性；dNTPs是DNA扩增的原料；缓冲液可为Taq DNA聚合酶的扩增提供合适的催化条件。

优选的，如上所述的PCR扩增反应体系的相应反应程序中，退火温度为60℃，反应循环次数为23～35个循环。

通常PCR扩增时的退火温度为40℃～60℃。退火温度是由引物的Tm值来决定的，在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。本发明所采用的引物退火温度为60℃，具有较高的特异性。

随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTPs等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本发明限定为23～35个循环。

优选的，所述琼脂糖凝胶电泳所采用的琼脂糖采用1～1.2％的琼脂糖凝胶；电泳的电压为130～150V恒压，电泳时间为20～25分钟。

优选的，所述对结果的判断方法为，扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未扩增出该片段的模板对应的为快羽鸡。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明所用引物特异性好，扩增效率高，且所需模板量较少即可完成PCR反应，可很好的用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。

2)、很多分子鉴定实验都需要两对或多对引物来扩增出多条扩增产物，有的方法还需要酶切反应来进行辅助鉴定，这些操作无疑增加了鉴定的时间成本和金钱成本；并且多对引物还容易造成引物之间的交叉污染，不同引物还可能会发生非特异性结合；同时不同引物间的Tm值也可能存在差异，还会对退火温度的选定造成影响，进而影响扩增效率。本发明采用一对引物即可鉴定出鸡的羽速类型，避免了以上问题。

3)、本发明鉴定准确率可达100％，而传统的比较主翼羽与覆主翼羽长度的方法准确率只有90％左右，本发明有效避免了表型鉴定时存在的人为误差。

4)、本发明解决了对鸡进行羽速鉴定只有在雏鸡出雏后24h内完成的时间限制。

附图说明

图1为实施3中琼脂糖凝胶电泳结果的扫描图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，包括以下步骤：

1)、模板DNA的提取：通常从鸡血中提取，当然也可以从其他组织提取；

2)、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物，以1)所提取的DNA为模板进行PCR扩增；

3)、将2)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；

4)、对3)中的电泳结果进行分析。

实施例2

1、引物制备

由生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成，其中：

正向引物1305s：5’CCTCCTTGCCAAACCTTA3’；

反向引物1305a：5’ATCAGCCAGATCCGTCAG3’。

2、试剂盒提取鸡血凝块DNA步骤：

选用康为世纪生物科技有限公司的ClotBlood DNA Kit进行提取，产品货号CW0545。

(1)称取凝固血块0.1～0.2g，置于离心管中，并加入550μl Buffer GTL，电动匀浆器匀浆，为充分粉碎血块，可加入小磁珠，进行机械破碎。

(2)加入20μl蛋白酶K，上下颠倒使样品充分混匀。在摇床里56℃过夜孵育至所有颗粒完全溶解。

(3)加入200μl BufferPP，涡旋震荡20s，冰上孵育3～5min。13400×g离心3min，将上清移至新的离心管中(若上清中还有浑浊，可适当增加离心时间)。

(4)加入1/2体积无水乙醇，涡旋震荡15s。短暂离心，使管壁和盖子上液体集中到管底。

(5)将步骤4中所得溶液全部加入到装入收集管(Collection Tube)中的吸附柱(Spin Column DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。13400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μl Buffer GW1，13400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入500ul Buffer GW2，13400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)13400×g离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。

(9)将吸附柱置于一新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入100～200μl BufferGE，室温放置2～5min，13400×g离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

本方法是经多次实验后优选出来的，0.1～0.2g的血凝块较为节约材料，且提取DNA的含量较高。

蛋白酶K可以使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，从而使DNA充分游离。通常加入较多的Proteinase时抽提出的DNA含量较高，为了保证消化效果，步骤(2)常采用过夜孵育。

加入Buffer GE时应注意悬空加入，防止移液枪被DNA污染。

此方法所提太行鸡血凝块DNA浓度大都在200～300ng/μl左右，纯度A260/280在1.8～1.9之间，A260/230在1.6～1.9之间。

依据现有技术或其他可能的技术从鸡其他部位提取DNA并制备扩增模板，也可以用于本发明。

3、PCR扩增

3.1、PCR反应体系

其中，2×Es mix的生产厂家为康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0690，规格为1ml；

引物浓度为8～12μM；

上述DNA模板在PCR扩增体系中的浓度达到2.5ng/ul以上即可。

3.2、扩增反应程序

4、琼脂糖凝胶电泳检测

采用1％～1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用130～150V均可，电泳时间20～25分钟。

5、结果分析与判定

扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未扩增出该片段的模板对应的为快羽鸡。

实施例3

1、引物设计和制备

Elferink等(2008)发现控制羽速的慢羽K等位基因是由串联重复序列构成，其总长度为176324bp，由两个基因部分重复所引起：PRLR基因和编码精子鞭毛蛋白的SPEF2基因，包含了PRLR基因的外显子1—外显子11和558bp的外显子12以及SPEF2基因的外显子1—外显子5；并设计引物，在慢羽鸡中扩增出一段长78bp的断点连接序列，而快羽鸡扩增不出该段序列，因此可作为区分快慢羽的一种分子检测方法。在该研究成果基础上，设计引物扩增出一段包含78bp的长度为1305bp的断点连接序列，只有慢羽鸡能扩增出来，快羽鸡扩增不出该段序列，由此可区分鸡的快慢羽型。该片段容易扩增，特异性强，PCR产物可直接测序。

利用上述连接重复片段的断点连接序列设计引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成，其中：

正向引物1305s：5’CCTCCTTGCCAAACCTTA3’；

反向引物1305a：5’ATCAGCCAGATCCGTCAG3’。

2、试剂盒提取抗凝鸡血DNA步骤：

选用北京全式金生物技术有限公司生产的EasyPure Blood Genomic DNA Kit进行提取，货号为EE121-12。

(1)取20～25μl抗凝鸡血于1.5ml离心管中，并加入500μl BB3溶液，20mg/μl蛋白酶K 20μl，涡旋15s充分混匀样品，56℃水浴2～3h。

(2)短暂离心，将全部的溶液加入离心柱中，12000×g离心1min，弃上清液。

(3)加入500μl溶液CB3，12000×g离心30s，弃上清液。

(4)加入500μl溶液WB3，12000×g离心30s，弃上清液。

(5)重复步骤4一次。

(6)12000×g离心2min，彻底去除残留的WB3。

(7)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入预热的50～200ul EB(65℃)，室温静置2～5min，12000×g离心1min，洗脱DNA，4℃保存(长时间存放-20℃保存)。

鸡血通常用EDTA或ACD作抗凝处理，抗凝全血在2～8度可保存达两个月，但随保存时间的增加，DNA的得率和完整性会受影响。抗凝血的DNA更易抽提，且更稳定，DNA含量高。

注意红细胞裂解后，一定要将红细胞碎片尽量去除，红细胞碎片残留太多会影响后期的PCR等操作；蛋白酶K通常现用现配。

依据现有技术或其他可能的技术从鸡血中提取DNA并制备扩增模板，也可以用于本发明。

3、PCR扩增

3.1、PCR反应体系

引物浓度为8～12μM；

上述DNA模板在PCR扩增体系中的浓度达到2.5ng/ul以上即可。

3.2、扩增反应程序

4、琼脂糖凝胶电泳检测

采用1％～1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，电压130～150V，电泳时间20～25分钟。

5、结果分析与判定

电泳结果参见图1所示，其中扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未扩增出该片段的模板对应的为快羽鸡。

实验例1 太行鸡羽速类型鉴定准确性检验(与传统方法比较)

赞皇县天然农产品开发有限公司取亲本羽速基因型已确定的120只太行鸡(即这些太行鸡羽速类型已知)，其中快羽公鸡、慢羽公鸡、快羽母鸡和慢羽母鸡各30只，采用单盲实验，实验者A将120只鸡随机混合，实验者B再分别用实施例3中的方法与表型鉴定(表型鉴定为传统的比较主翼羽与覆主翼羽长度的方法)方法进行鸡快慢羽的检测，再由实验者A根据实验值与真值的差异统计准确率。结果如下：

	实施例1准确率	表型鉴定准确率
			快羽太行公鸡	100％	90％
慢羽太行公鸡	100％	86.7％
			快羽太行母鸡	96.7％	90％
慢羽太行母鸡	100％	93.3％
			平均值	99％	90％

实验例2 坝上长尾鸡羽速类型鉴定准确性检验

张家口京星园生态农业公司取288份已知快慢羽表型的坝上长尾鸡的血样，用扩增1305bp的引物对血样进行血液直接PCR，由此检测鸡的快慢羽类型，所得快慢羽的比例与预期结果相符，该方法更快速，不用提取基因组，直接用血样(1ul稀释后的鸡血)做模板，直接进行PCR扩增即可。随后又取得206份坝上长尾鸡慢羽公鸡的血样用实施例3中的方法进行验证，所得结果与表型鉴定结果一致率达到95.63％，由此检验该鉴定方法的可靠性。

实验例3 海兰灰慢羽公鸡羽速类型鉴定准确性检验

河北保定满城孵化场取已知羽型的海兰灰慢羽公鸡30只，用实施例3中的方法进行验证，检测结果准确率达100％。

实验例4 海兰灰祖代四系羽速类型鉴定准确性检验

河北华裕家禽育种有限公司取90份已知羽型的海兰灰祖代四系的血样，A、B和C系各30只，其中，A系为快羽公鸡，B系为快羽母鸡，C系为纯合慢羽公鸡，用实施例3中的方法进行验证，检测结果与实际完全吻合，由此检验该鉴定方法的准确性。

综上所述，本发明提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，该引物特异性好，扩增效率高，可用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。本发明还提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，该方法可以解决快慢羽鉴定中存在的鉴定标准不够明确、雌雄配套系建系时间长、鉴定时间有限制的问题。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、模板DNA的提取；

3)、将2)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；

4)、对3)中的电泳结果进行分析：扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未扩增出该目的条带的模板对应的为快羽鸡。

3.如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述模板DNA从鸡血凝块或鸡抗凝血中提取。

4.如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增反应体系为：

所述2×Es mix是2倍浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs和缓冲液。

5.如权利要求4所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的浓度为8～12μM。

6.如权利要求4所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，所述DNA模板在PCR反应体系中的浓度为2.5ng/μl以上。

7.如权利要求4～6任一项所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系的相应反应程序中，退火温度为60℃，反应循环次数为23～35个循环。

8.如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤3)中，所述琼脂糖凝胶电泳所采用的琼脂糖为1～1.2％的琼脂糖凝胶；电泳的电压为130～150V恒压，电泳时间为20～25分钟。