CN105671202B - 鸡白血病内源病毒ev21分子标记及其引物、鉴定方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡白血病内源病毒ev21分子标记及其引物，该引物的正向引物为：5’GGAGGGAGACTATTTTTACACG3’；反向引物为：5’GTTTAACGGACCAACAGGCTAGTCTCTCG’。该引物特异性好，扩增效率高，扩增产物中包含6614bp的ev21基因序列。本发明还提供了一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，该方法与上述引物配合进行实验，操作简便，可行性高，利用该方法还可以用于快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化或某些品种鸡的快慢羽表型鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡白血病内源病毒ev21分子标记及其引物、鉴定方法、应用。
背景技术
禽白血病病毒(Avian leukosis viruses，ALVs)是引起禽类各种造血细胞肿瘤性增生的一类逆转录酶病毒。针对鸡的ALVs共有六种亚型(A、B、C、D、E和J)。E型白血病病毒(ALVE)属鸡内源性病毒(endogenous virus，EV)，其完整的或部分的遗传序列元件整合于鸡细胞染色体基因组中，随鸡基因组复制而复制，遵循孟德尔遗传规律，具备潜在的影响鸡体生理功能的作用。ev21是ALVE的一种，其转录活化影响外源病毒的感染和疾病发生，并影响蛋品生产、蛋重和蛋比重等重要经济性状。
现已证明鸡携带有超过50种不同的ALVE内源病毒位点，其中22种ALVE位点来自于白莱航鸡体内。每只蛋鸡一般携带有1～3个ALVE位点，而每只肉鸡有8～10个。之前的研究认为，ev21基因与慢羽鸡K基因连锁(Smith&Crittenden 1986；Bacon et al.1988)，慢羽鸡和快羽鸡的杂交实验发现ev21与K基因间距0.3cM(Smith&Fadly 1994)。慢羽白莱航鸡及其后代均表现出对外源淋巴白血病病毒免疫性能减退、生产性能下降、死亡率升高等(Harriset at，1984；Smith and Fadly，1988)，这些症状可能都与ev21相关。宁中华等也证实了白壳蛋鸡慢羽系的ALV高发生率与内源病毒ev21的存在有直接关系，并对蛋鸡的生产性能产生影响。
九十年代研究者利用Southern-blot技术来检测，即通过制备病毒特异DNA片断及其侧翼区域的特异探针利用DNA杂交和RFLP技术检测ALVE病毒元件，该技术基于病毒插入位点上下游的鸡基因组序列特异性通过限制内切酶获得不同长度基因片断而鉴定的。由于Southern-blot技术成本较高，且费时，现在一般应用基于位点特异性的PCR技术鉴别。之前也有研究通过PCR获得390bp或515bp序列以鉴定ev21的存在，但由于ev21基因序列全长为7524bp，扩增难度很大，因而只有相对小的测序序列被成功扩增，未见有获得较完整病毒基因组序列的报道，这对于ev21的研究带来很多的阻碍。此外，由于之前的扩增均只扩增出了ev21的一小部分，而ev21具有重复序列，且其插入区和LTR具有多态性，因而关于其基因序列与慢羽鸡K基因连锁的报道可能存在错误。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，该标记中含有ev21基因中的6614bp序列，占ev21基因全长的88％左右，用此标记可检测鸡体内是否携带ev21基因。
本发明的第二目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定引物，该引物特异性好，扩增效率高，可用于白莱航鸡快慢羽表型的分子鉴定。
本发明的第三目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，该方法可以扩增出如上所述的分子标记。
本发明的第四目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化中的应用，配合本申请特定的引物及其扩展方法。该方法比其他的现有的PCR技术鉴定结果都更为准确，可排除快慢羽种鸡白血病病毒ev21携带者，建立用于羽速性别鉴定的慢羽纯种蛋鸡品系，对蛋鸡品种选育生产具有重大意义。
本发明的第五目的在于提供一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽表型鉴定中的应用。
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，其碱基序列为SEQ ID NO:1所示。
如上所述ev21的分子标记的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。
通常说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
一般引物序列中G+C含量一般为40％～60％，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。本发明所述引物SEQ ID NO:2中G+C含量为45.5％，SEQ ID NO:3中G+C含量为51.7％，且碱基分布随机，因而具有适中的解链温度，便于扩增。
所述引物自身不存在互补序列(连续互补碱基小于3bp)；引物3’端无修饰不易错配；最终扩增产物长度为7590bp，其中包含6614bp的ev21基因序列及部分鸡的基因序列。
综上，该引物特异性好，扩增效率高，可很好的用于鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定。
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，包括：
提取待检样本的DNA作为模板，用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对所述DNA进行PCR扩增并将得到的扩增产物SEQ ID NO:1进行电泳分析。
优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，所述PCR扩增反应体系为：
其中，所用LA Taq，dNTP等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；LA Taq商品名为TaKaRa LA，产品货号为RR52A。
进一步优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法：
所述正向引物和反向引物的浓度为8～12μM；
所述DNA模板浓度为50～150ng/ul。
本发明涉及同一体系或配比中各组分的量，应视为对相关各组分之间比例关系的限定，而不是对各自用量绝对值的限定，各组分之间的比例关系可适当改变。
优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，所述PCR扩增反应体系的相应反应程序为:
本申请采用两步法，退火延伸合为一步。
随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTPs等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本发明限定为30～35个循环。
优选的，如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，所述电泳为琼脂糖浓度为0.8～1％的琼脂糖凝胶电泳；电泳的电压为130～150V恒压，电泳时间为20～25分钟。
优选的，在进行所述电泳分析时，对结果的分析方法为：若样本的DNA能扩增出7590bp的目的片段，则该样本对应的鸡体内携带ev21基因。
如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化中的应用。
内源性病毒指动物细胞不是因外源性感染而是在染色体组上原本保持着的病毒。原始病毒是通过精子和卵来遗传的，通常其遗传基因的发生被调节而分成若干个，且内源性病毒的遗传特征和动物本身的基因是一致的，因而也符合孟德尔定律，存在基因连锁关系等。
之前的研究认为，ev21基因与慢羽鸡K基因连锁，但在本申请的实施例中，发现即便快羽公鸡中也可能扩增得到ev21基因，具有意想不到的技术效果。
这说明之前的研究可能由于扩增的ev21基因片段过小而造成在对ev21基因的认识上存在一些偏差；同时也说明本申请在作为快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化中的应用比其他现有PCR方法更加准确的。
如上所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽表型鉴定中的应用。
通常情况下(如在白莱航鸡中)，该方法扩增结果是：扩增出7590bp，为慢羽；未扩增出7590bp，为快羽。
但也有例外情况，在海兰褐鸡中，即便是快羽鸡也有可能扩增出7590bp的条带，且未扩增出条带也有可能为超慢羽。因而在结合大量预实验的前提下，可将本申请提供的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法用于快慢羽表型鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明所用引物特异性好，扩增效率高，且所需模板量较少即可完成PCR反应。
2)、本发明提供的应用配套的扩增方法可扩增出包含6614bp的ev21基因的片段的分子标记，该ev21基因的片段比以往的任何相关引物扩增出的片段都要大的多，可为对ev21的功能研究提供更详细的遗传基础信息。
3)、本发明提供的扩增方法可用于快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化，且纠正了传统观念上的ev21基因与慢羽鸡K基因连锁的观念，具有意想不到的技术效果。
附图说明
图1为太行鸡中ev21基因的部分检测结果；
图2为白莱航鸡、太行鸡和坝上长尾鸡中ev21基因的部分检测结果；
图3为太行鸡、白莱航、坝上长尾鸡和海兰褐鸡中ev21基因的部分检测结果；
图4为海兰灰祖代白莱航鸡中ev21基因的部分检测结果；
图5为海兰褐鸡中ev21基因的部分检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)、模板DNA的提取；
2)、用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物，以1)所提取的DNA为模板进行PCR扩增；
3)、将2)中PCR扩增得到的扩增产物SEQ ID NO:1进行电泳分析。
实施例2
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)、模板DNA的提取：通常从鸡血中提取，当然也可以从其他组织提取。
2)、用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物，以1)所提取的DNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系为：
其中，正向引物和反向引物的浓度为12μM；
DNA模板在PCR反应体系中的浓度为150ng/μl；
反应程序为：
3)、将2)中PCR扩增得到的扩增产物SEQ ID NO:1进行1％的琼脂糖凝胶电泳电泳分析，电泳的电压为130V恒压，电泳时间为20分钟。
实施例3
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)、模板DNA的提取：通常从鸡血中提取，当然也可以从其他组织提取。
2)、用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物，以1)所提取的DNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系为：
其中，正向引物和反向引物的浓度为8μM；
DNA模板在PCR反应体系中的浓度为50ng/μl；
反应程序为：
3)、将2)中PCR扩增得到的扩增产物SEQ ID NO:1进行1％的琼脂糖凝胶电泳电泳分析，电泳的电压为140V恒压，电泳时间为23分钟。
实施例4
一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)、模板DNA的提取：通常从鸡血中提取，当然也可以从其他组织提取；
2)、用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物，以1)所提取的DNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系为：
其中，正向引物和反向引物的浓度为10μM；
DNA模板在PCR反应体系中的浓度为100ng/μl；
反应程序为：
3)、将2)中PCR扩增得到的扩增产物SEQ ID NO:1进行1％的琼脂糖凝胶电泳电泳分析，电泳的电压为150V恒压，电泳时间为25分钟；对结果的分析方法为：若样本的DNA能扩增出碱基序列如SEQ ID NO:3所示的目的片段，则该样本对应的鸡体内携带ev21基因。
应用例
根据实施例4中记载的方法，对太行鸡、坝上长尾鸡、海兰灰、海兰褐及白莱航进行检测，其结果如下：
表1 不同品种快慢羽鸡检测ev21的分布情况
注：“—”代表实验中没有检测相关样品。
从表1中也可得知，在某些品种的鸡中(如白莱航鸡)，本发明提供的方法也可以用于快慢羽表型的鉴定。
检测的部分结果如图1～5所述，其中：
在图1中：1-6泳道为太行鸡，其中1、2、3泳道为快羽公鸡，6泳道为快羽母鸡，均未扩增出目的条带；4、5泳道为慢羽公鸡，均扩增出目的条带；7-9泳道为坝上长尾鸡慢羽公鸡，均扩增出目的条带；10泳道未点样；
在图2中：1-3泳道为白莱航慢羽公鸡，均扩增出目的条带；4-8泳道为太行鸡，其中，4泳道为慢羽公鸡，未扩增出目的条带，5-8泳道为慢羽公鸡，均扩增出目的条带；9、10泳道为坝上长尾鸡慢羽公鸡，其中，9泳道扩增出目的条带，10泳道未扩增出目的条带；
在图3中：1、11-15泳道为太行鸡，其中，1泳道为慢羽公鸡，扩增出目的条带，11-15泳道为快羽公鸡，均未扩增出目的条带；2-10泳道为白莱航快羽公鸡，均扩增出目的条带；16-20泳道为坝上长尾鸡慢羽公鸡，16泳道未扩增出目的条带，17-20泳道均扩增出目的条带；21-30泳道为海兰褐慢羽公鸡，均扩增出目的条带；
在图4中：1-24泳道是海兰灰祖代白莱航，其中1-13泳道为白莱航慢羽公鸡，除3、12泳道未扩增出目的条带(可能因为初始模板量过少导致未扩增出)，其他泳道均扩增出目的条带；14-24泳道为白莱航快羽母鸡D系，均未扩增出目的条带。
在图5中：1-17泳道是海兰褐鸡，其中，1-4泳道为慢羽母鸡，均扩增出目的条带，5-17泳道为快羽母鸡，均未扩增出目的条带。
综上所述，本发明提供了鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定引物，该引物特异性好，扩增效率高。本发明还提供了一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，该方法可以扩增出包含6614bp的ev21基因的片段，为ev21病毒的研究创造条件；利用该方法还可以用于快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化及快慢羽表型的鉴定(某些品种可能不适合)。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种鸡白血病内源病毒ev21的分子标记，其碱基序列为SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述ev21的分子标记的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
3.一种鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于，包括：
提取待检样本的DNA作为模板，用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对所述DNA进行PCR扩增并将得到的扩增产物SEQ ID NO:1进行电泳分析。
4.如权利要求3所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
5.如权利要求4所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于：
所述正向引物和反向引物的浓度为8～12μM；
所述DNA模板浓度为50～150ng/ul。
6.如权利要求5所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系的相应反应程序为：
7.如权利要求1所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于，所述电泳为琼脂糖浓度为0.8～1％的琼脂糖凝胶电泳；电泳的电压为130～150V恒压，电泳时间为20～25分钟。
8.如权利要求3所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法，其特征在于，在进行所述电泳分析时，对结果的分析方法为：若样本的DNA能扩增出碱基序列如SEQ ID NO:1所示的目的片段，则该样本对应的鸡体内携带ev21基因。
9.权利要求3～8任一项所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽种鸡内源白血病病毒ev21的分子净化中的应用。
10.权利要求3～8任一项所述的鸡白血病内源病毒ev21的分子鉴定方法在快慢羽表型鉴定中的应用。
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