CN106399172B - 降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌及其应用，属于环境微生物应用技术领域。该菌株的名称为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW‑1，保藏编号：CCTCC NO:M2015246，是从富含SDS的土壤中分离出的一株细菌，近球形短杆状、个体较小，革兰氏阴性，不产芽孢。在LB平板上37℃培养菌落不透明，光滑、湿润，呈白色，中心凸起，边缘不规则；在LB平板上28℃培养产生红色色素。粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)能有效降解十二烷基硫酸钠，可用于制备降解SDS的制剂。

Description

降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种能高效降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌及其应用，属于环境微生物应用技术领域。
背景技术
表面活性剂(Surface active agen，surfactant)是指分子中同时含有亲水基团和疏水基团，并在较低浓度时能显著降低介质表面张力的一类化合物。目前，人工合成的表面活性剂广泛应用于工农业生产中，如洗涤剂、农用化学喷雾等，致使大量的表面活性剂残留于环境中，造成日益严重的环境污染。有研究表明，表面活性剂有可能破坏细胞组织，引起人体过敏、农作物老化早衰，污染水质并毒害水生生物。
十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate SDS)是一种重要的阴离子表面活性剂，极易溶于水，在液体洗涤剂及化学试剂工业生产中应用广泛。SDS毒性较大且不易被降解，在环境中的大量累积对人体及水生生物具有潜在危害，易造成土壤及水体生态系统的破坏。研究表明，SDS对克氏原鳌虾、斑马鱼、卤虫等水生生物均有较强的毒害作用。
目前针对SDS的污染治理主要有物理法、化学法和生物降解法。物理法(超滤、吸附、气浮)设备简单，但不能解决二次污染问题。化学法处理费用较高，同时也存在二次污染问题。在天然水体中，SDS的降解主要依赖于微生物作用，其降解速度与微生物浓度呈正比关系。利用微生物降解SDS具有安全、投资少，环境友好无二次污染等优点。
近年来，已先后发现若干种对SDS具有降解效果的微生物，如湖南大学颜丙花等筛选的一株放线菌，72h对SDS的降解率达90.0％，兰州大学李田等筛选的一株假单胞菌，在pH6～9时对SDS的降解率达90.0％，关向杰等筛选的一株不动杆菌，对初始浓度400mg/L的SDS的降解率为94.0％。筛选高效菌株降解SDS已成为研究的趋势和热点，而目前关于生物降解SDS的研究中，尚没有关于粘质沙雷氏菌降解能力的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌。
同时，本发明还提供一种沙雷氏菌的应用。
最后，本发明再提供一种降解SDS的制剂。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌，其名称为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)GW-1，保藏编号：CCTCC NO:M2015246，保藏日期：2015年4月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1是从土壤中分离筛选出的一株细菌，近球形短杆状，个体较小，革兰氏阴性，不产芽孢。在LB平板上37℃培养菌落不透明，光滑、湿润，呈白色，中心凸起，边缘不规则；在LB平板上28℃培养产生红色色素。生理生化实验表明：该菌明胶液化实验、糖醇发酵实验(蔗糖、甘露醇、山梨醇)、V-P实验结果均为阳性，甲基红实验、吲哚实验结果均为阴性。16s rDNA测序结果显示该菌16s rDNA序列(测序引物及序列详见序列表)与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens strain T237)同源性达99％。
沙雷氏菌的应用，具体为粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)在降解SDS中的应用，以及制备降解SDS制剂中的应用。
降解SDS的制剂，其包含粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)。
本发明的有益效果：
本发明粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)是从富含SDS的土壤中分离出的一株细菌，近球形短杆状、个体较小，革兰氏阴性，不产芽孢；在LB平板上37℃培养菌落不透明，光滑、湿润，呈白色，中心凸起，边缘不规则；在LB平板上28℃培养产生红色色素。该菌能有效降解十二烷基硫酸钠，可用于制备降解SDS的制剂。
保藏证明和存活证明说明
保藏菌株：粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1，保藏编号：CCTCC NO:M2015246，保藏日期：2015年4月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
附图说明
图1为粘质沙雷氏菌GW-1的形态图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌的分离和筛选方法，包括以下步骤：
1)从开封市某洗衣粉生产厂家周边取土样20份，作为降解菌分离筛选的材料；
2)选用LB培养基，以稀释涂布平板法对所采土样进行菌株分离，共获得162株细菌；
3)以LB培养基为基础培养基，配制含不同浓度SDS(50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)的加富培养基；将已获得的162株细菌分别划线接种于含不同浓度SDS的加富培养基平板上，37℃过夜培养，通过观察菌株生长情况对菌株进行初步筛选，筛出5株对高浓度SDS稳定耐受的细菌；
4)分别将以上5株细菌接种于降解率测定用培养基(200mg/L SDS，5g/L葡萄糖，余量为水)中，37℃培养48小时；采用亚甲基蓝法测定不同菌株对SDS的降解率，经比较得到SDS降解能力最为突出的菌株GW-1。
沙雷氏菌的鉴定分类
1)细胞形态及理化检验
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)GW-1近球形短杆状、个体较小，革兰氏阴性，不产芽孢。在LB平板上37℃培养菌落不透明，光滑、湿润，呈白色，中心凸起，边缘不规则；在LB平板上28℃培养产生红色色素。
生理生化实验表明：该菌明胶液化实验、糖醇发酵实验(蔗糖、甘露醇、山梨醇)、V-P实验结果均为阳性，甲基红实验、吲哚实验结果均为阴性。
2)16s rDNA基因序列
纯化菌株GW-1，取单菌落划线培养，利用引物27F、1492R(见序列表中SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2)扩增16s rDNA基因序列，并送上海生工生物技术服务公司进行测序，测序结果见序列表中SEQ ID NO.3。结果显示，该菌16s rDNA序列与粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens strain T237)的同源性达99％。
试验例
1、沙雷氏菌的培养：
1)试管斜面培养
配制LB培养基(配方为：2％酵母提取物，1.5％蛋白胨，2％葡萄糖，2％NaCl，1.8％琼脂，pH7)，制备试管斜面，将粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)接种到试管斜面上，于37℃下培养2天获得试管种。
2)培养皿划线培养
采用上述LB培养基倒平板，划线接种粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)，于37℃下培养24h，获得用于液体培养的单菌落。
2、沙雷氏菌对SDS的降解试验
1)降解率测定用培养基
降解率测定用培养基的配方如下：200mg/L SDS，5g/L葡萄糖，余量为水。
2)降解率测定方法
配制降解率测定用培养基，分装至250mL三角瓶中，装样量为50mL/瓶。将粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)单菌落接种于灭菌后的培养基中，37℃、200rpm振荡培养，48h后取样，将培养物于8000rpm离心20min，取上清液于三角瓶中，测定SDS浓度，并计算菌种对SDS的降解率。
SDS浓度测定采用亚甲基蓝分光光度计法，将待测样品稀释至标准曲线所测浓度范围，滴加几滴酚酞为指示剂，滴加4％NaOH至水溶液呈紫红色，再滴加3％H2S04使红色刚好褪去。取200μL调好pH值的溶液加入1.5mL离心管中，再向离心管加入50μL亚甲基蓝(5％的亚甲蓝溶液，在使用前1:10稀释)，最后再加入600μL氯仿，4000rpm离心5min。取氯仿相用分光光度计在650nm测吸光度。
分光光度法背景对照为不含SDS的降解率测定培养基。
3)降解率计算方法
SDS降解率＝(Cck－Ct)/Cck×100％，其中Cck为空白处理中SDS的浓度，Ct为振荡培养若干天后残留的SDS浓度。
4)试验结果
亚甲基蓝分光光度计发测定SDS浓度需要先制作标准曲线，试验得到标准曲线为：y＝0.06106x+0.03767，R2＝0.99923。根据标准曲线计算48h后SDS浓度为12.1mg/L，代入降解率计算公式得到降解率为93.95％。
实施例2
沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)在降解SDS中的应用，具体为：取粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)扩大培养，收集菌体，投加菌体及少量葡萄糖到含有SDS的污水中即可。
实施例3
降解SDS的制剂，其制备步骤为：取粘质沙雷氏菌(CCTCC NO:M2015246)扩大培养，收集菌体，加甘油冻存(常规操作)即可。

Claims (4)

1.降解十二烷基硫酸钠的沙雷氏菌，其特征在于：该菌的名称为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）GW-1，保藏编号：CCTCC NO: M2015246。
2.如权利要求1所述的沙雷氏菌在降解十二烷基硫酸钠中的应用。
3.如权利要求1所述的沙雷氏菌在制备降解十二烷基硫酸钠的制剂中的应用。
4.降解十二烷基硫酸钠的制剂，其特征在于：该制剂包含权利要求1中所述的沙雷氏菌。
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