CN106399089A - 一种用于dna酶切为单核苷的级联酶反应器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于将DNA酶切为单核苷的级联酶反应器，其特征在于由两支以上的DNA单一酶反应器串联得到的级联酶反应器，基因组DNA通过该反应器可被酶解为单核苷。这种级联DNA酶反应器具有丰富的孔状结构和优异的机械性能，通过低压微量注射泵、手推泵等可将DNA样品注入酶反应器进行酶解。级联DNA酶反应器将基因组DNA酶解为单核苷具有很高的酶切效率，可达99.0％以上；酶切速度快，酶切时间小于1小时。级联DNA酶反应器具有很好的稳定性，可重复使用30次以上和长期保存2月以上。经过级联酶反应器酶解后的样品不用热变性或超滤除酶，可直接进入质谱进行目标核苷产物的定性或定量分析；可用于环境污染物暴露下的DNA加合物的分析。

Description

一种用于DNA酶切为单核苷的级联酶反应器
技术领域
本发明涉及DNA酶切技术领域，是一种用于将DNA酶切为单核苷的级联酶反应器。由两支以上的DNA单一酶反应器的串联构成，基因组DNA通过该反应器可被酶解为单核苷，通过质谱可以进行DNA样品中普通核苷和DNA加合物的定量、定性分析。
背景技术
环境污染与人类疾病的发生密切相关，污染物对人体的暴露可以引起DNA损伤和DNA的修饰，若不能及时修复，则可能引起基因突变，最终导致癌症的发生。为了评价疾病发生的风险，对DNA损伤产物和DNA加合物进行鉴定显得尤为重要。液相色谱-质谱(LC-MS)因为高灵敏度和准确度是检测DNA加合物的常用方法。检测之前要将高分子量基因组DNA酶解为单核苷，这一步骤通常在溶液体系中进行。而溶液体系下的酶解耗时长(＞12h)，酶的稳定性差，酶解结束后还需要通过热变性、超滤等操作将DNA水解酶去除。对于某些DNA氧化损伤产物如8-羟基脱氧鸟苷(8-oxodG)的检测，繁琐的样品前处理过程极容易引起dG的氧化，干扰氧化损伤产物的准确定量。因此，发展一种快速、便捷的酶解体系是DNA分析迫切需要解决的问题。
基于整体柱的固定化酶反应器因为酶的稳定性好，酶切效率高，酶与底物易分离已经在蛋白组学得到了广泛的应用。Zhang等人采用戊二醛法将胰蛋白酶固定于有机-无机杂化整体柱中，得到了高活性的酶反应器，30s对蛋白序列的覆盖率可达到92％。(Ma,J.F.；Liang,Z.；Zhang,Y.K.；Anal.Chem.2008,80(8),2949-2956.)随着DNA酶反应器的快速发展，DNA酶反应器在寡聚核苷酸的鉴定方面也开始有了新尝试。Zhao等将蛇毒磷酸二酯(SVP)酶固载于毛细管整体柱上，对寡聚核苷酸进行酶解，并结合MALDI-TOF对寡聚核苷酸进行分析，通过控制不同的酶解时间得到酶解的质量“梯度”，实现对ssDNA及DNA加合物的序列测定。(Zhao,C.；Yin,R.C.；Yin,J.F.；Anal.Chem.2012,84(2),1157-1164.)Porebski等将脱氧核糖核酸酶(DNase I)键合于环氧基功能化的硅胶颗粒上制成填充酶反应器柱，该酶反应器与液相色谱联用成功地用于在线检测寡聚核苷酸的稳定性。(Porebski,P.W.A.；Gyssels,E.；Madder,A.；J.Chromatogr.A 2015,1422,18-26.)基因组DNA的酶解过程涉及到包括脱氧核糖核酸酶，磷酸二酯酶及碱性磷酸酶在内的多种DNA水解酶，酶解体系复杂，目前还没有一种DNA酶反应器能够将基因组DNA酶解为单核苷。近年来，对于涉及多种酶参与的酶解过程，人们尝试将这些酶混合固载于整体柱中制备多酶反应器，例如Krenkova等人将胰蛋白酶和LysC蛋白内切酶固定到poly(GMA-co-EDMA)整体柱上，这种酶反应器打破了传统胰蛋白酶反应器对所分析蛋白分子量的限制，可以对高分子量(Mw>150000Da)的蛋白如免疫球蛋白G进行鉴定；(Krenkova,J.；Lacher,N.A.；Svec,F.；Anal.Chem.2009,81(5),2004-2012.)此外，也有研究考虑将多种单酶反应器进行串联制备级联酶反应器，例如Yamaguchi等人将蛋白酶和磷酸酶反应器串联，可以进行蛋白质和多肽的去磷酸化分析。(Yamaguchi,H.；Miyazaki,M.；Proteomics 2013,13(3-4),457-466.)本发明将DNA酶解体系常用的三种酶：脱氧核糖核酸酶，磷酸二酯酶，碱性磷酸酶分别固载于整体柱中，制备得到相应的单一酶反应器；再将各单一酶反应器按照一定的次序串联，制备级联DNA酶反应器。该级联DNA酶反应器能够将基因组DNA快速酶解为单核苷。酶解产物可直接进入LC-MS进行目标核苷产物的定性或定量分析，可减少样品前处理过程(酶解，除酶)带来的样品污染。该发明适用于基因组DNA的酶解，结合LC-MS可进行环境污染物暴露下的DNA加合物的分析。对研究环境污染与人类疾病发生的关系，评价癌症发生的风险具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是由两支及两支以上的单一酶反应器串联制备级联DNA酶反应器，基因组DNA通过该酶反应器可被快速酶解为单核苷。
为了实现该目的，本发明的技术方案为：
DNA单一酶反应器的制备：通过四甲氧基硅烷(TMOS)的原位聚合反应制备得到具有多孔结构的毛细管硅胶整体柱；再通过氨基硅烷化试剂(如3-氨基丙基三甲氧基硅烷)在整体柱表面引入氨基；最后由戊二醛与氨基的席夫碱反应或碳二亚胺缩合法(NHS/EDC)将DNA水解酶(脱氧核糖核酸酶，磷酸二酯酶，碱性磷酸酶)键合于整体柱中。所制备的单一酶反应器的长度为2-50cm，反应器内径为25-200μm。
级联DNA酶反应器的制备：采用零死体积接头将各单酶反应器按照一定的次序进行连接。
按照以上方法制备的级联DNA酶反应器具有良好的通透性和机械性能，DNA样品通过低压注射泵或手推泵即可注入反应器并快速酶解为单核苷。将级联DNA酶反应器酶解与LC-MS分析相结合可以进行基因组DNA中目标核苷产物的快速鉴定。
本发明具有以下特点：
级联酶反应器具有良好的通透性和优异的机械性能，酶解过程中反应器柱的背压低，酶解过程不会对反应器的整体结构造成影响；
级联DNA酶反应器可将基因组DNA酶解为单核苷，酶切效率可达99.0％以上；
级联DNA酶反应器用于基因组DNA的酶解速度快，酶切时间小于1小时；
制备的级联DNA酶反应器稳定性好，可重复使用(30次)和长期保存(2月以上)；
经过级联酶反应器酶解后的样品不用热变性或超滤除酶，可直接进入LC-MS进行目标核苷产物的定性或定量分析；
将级联DNA酶反应器酶解与质谱分析相结合可以用于环境污染物暴露下的DNA加合物的鉴定。
附图说明
图1为所制备的级联DNA酶反应器的实物图；
图2为基于毛细管硅胶整体柱的单一酶反应器制备示意图；
图3为级联DNA酶反应器酶解小牛胸腺DNA，LC-MS检测dG色谱图；
图4为级联DNA酶反应器酶解小牛胸腺DNA，LC-MS检测dC色谱图；
图5为级联DNA酶反应器酶解小牛胸腺DNA，LC-MS检测dT色谱图；
图6为级联DNA酶反应器酶解Fe2+/H2O2处理的小牛胸腺DNA，LC-MS检测8-oxodG色谱图；
图7为级联DNA酶反应器酶解TCBQ/H2O2处理的小牛胸腺DNA，LC-MS检测8-oxodG色谱图；
图8为级联DNA酶反应器酶解HepG2细胞DNA，LC-MS检测8-oxodG色谱图。
具体实施方式
以下提供本发明的级联DNA酶反应器制备方法及应用的具体实施方式。
实施例1
分别制备脱氧核糖核酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶固定化的DNA单一酶反应器，再将这三种酶反应器按照脱氧核糖核酸酶-磷酸二酯酶-碱性磷酸酶的顺序串联得到级联DNA酶反应器，实物如图1。其中，脱氧核糖核酸酶在有Mg2+存在的情况下可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或寡脱氧核苷酸；磷酸二酯酶则可以从寡聚核苷酸的3’末端的羟基并释放出5’-单核苷酸；而碱性磷酸酶可以将单核苷酸脱磷酸得到单核苷产物。单酶酶反应器的制备方法如图2，具体步骤如下：
1、毛细管硅胶整体柱的制备：截取的熔融石英毛细管若干，先用水和甲醇各冲30min，再用1M NaOH溶液冲洗活化3h，然后依次用去离子水冲洗30min，0.1M HCl冲洗1h，最后用去离子水再冲洗2h，活化好的毛细管在60℃下氮吹干。取PEG(Mw＝10000)0.44g，溶入0.01M 5mL乙酸，搅拌至溶解，再加入尿素0.45g，搅拌至溶解，冰浴下加入TMOS 2.1-2.2mL；高速搅拌30-40min，至均一无气泡为止；搅拌后的均质溶液经过滤后注入毛细管中，封住两端，在40℃水浴条件下反应24h；逐步提高反应温度：即60℃保持1h，80℃保持1h，120℃保持3h。毛细管在330℃下老化24h，再用水、甲醇冲洗毛细管，氮吹干燥，得到的毛细管整体柱在4℃条件下保存。
2、毛细管整体柱的氨基硅烷化：配置1mL 5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇-水溶液(即1mL溶液：900μL乙醇，100μL水和50μL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，并注入毛细管整体柱中室温下(25℃)反应2h，重复2次；反应结束后用去离子水反复冲洗毛细管1h，60℃条件下氮吹，干燥后待用。
3、酶的固定化：配置20％的戊二醛磷酸缓冲溶液(25mM PBS缓冲溶液，pH＝6.9)，在4℃条件下，将戊二醛溶液缓慢注入毛细管内，反应2h，并重复2次；然后用PBS溶液冲洗20min。配置5mg/mL的脱氧核糖核酸酶(﹥500Kunitz U/mg)反应溶液(25mM PBS缓冲溶液，pH＝6.9)，确保在低温条件下，将脱氧核糖核酸酶溶液缓慢注入毛细管内，反应2h，重复2次；反应结束后，用PBS缓冲溶液(pH＝6.9)冲洗30min；再通入2mg/mL NaCNBH3溶液(25mM PBS缓冲溶液，pH＝6.9)反应1h；制作完成的脱氧核糖核酸酶反应器注入PBS(pH 6.9，0.02％NaN3)，在4℃条件下保存待用。
同样的，与脱氧核糖核酸酶反应器制作方法相似，分别制备磷酸二酯酶酶反应器和碱性磷酸酶反应器。其中，配置的酶反应溶液为：5mg/mL磷酸二酯酶(﹥0.01U/mg)反应溶液(25mM PBS缓冲溶液，pH＝6.9)和5mg/mL的碱性磷酸酶(200U/mg)反应溶液(25mM PBS缓冲溶液，pH＝6.9)。
4、级联DNA酶反应器的制备：制备完成的DNA单一酶反应器采用PEEK二通接头(VICI，瑞士)按照脱氧核糖核酸酶-磷酸二酯酶-碱性磷酸酶的顺序依次连接，得到级联DNA酶反应器。酶反应器注入10mM Tris-HCl缓冲液(2mM Mg2+，2mM Ca2+，0.5％BSA，0.02％NaN3)，在4℃条件下保存待用。
实施案例2
级联DNA酶反应器酶解小牛胸腺DNA用于检测脱氧鸟苷(dG)：将12μL的200ng/μL小牛胸腺DNA通过低压微量注射泵注入级联DNA酶反应器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg2+，2mM Ca2+)将酶解液冲出，室温(25℃)条件下分别酶切15，30，45分钟直至收集60μL的酶解样品。采用LC-MS定量检测酶切产物中的dG，检测不同酶切时间下的色谱峰如图3所示。
所用LC-MS的主要参数设置：
(1)色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18column(2.1×100mm,1.8μm,Aglient)
(2)流动相比例：等度分离，5.0％甲醇和95.0％水(0.1％甲酸)
(3)流速：0.3mL/min
(4)柱温：30℃
(5)进样量：10μL
(6)质谱条件：ESI电离方式；正离子化，多重监测(MRM)模式，干燥气流速9.0L/min；电喷雾电压3500V；源温度300℃；定量特征离子对：dG m/z 268.1→152.1(5eV)。
实验结果表明，随着酶解时间的增加，从15分钟到45分钟，通过级联DNA酶反应酶解得到的dG也在增加；酶解45分钟时，小牛胸腺DNA酶切为单核苷释放dG的效率达到了99.3±1.6％，说明制备的级联酶反应器具有很高的DNA酶切效率。
实施案例3
级联DNA酶反应器酶解小牛胸腺DNA用于检测dC:将12μL的200ng/μL小牛胸腺DNA通过低压微量注射泵注入级联DNA酶反应器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg2+，2mMCa2+)将酶解液冲出，室温(25℃)条件下分别酶切15，30，45分钟直至收集60μL的酶解样品。采用LC-MS定量检测酶切产物中的dC，检测不同酶切时间下的色谱峰如图4所示。
所用LC-MS的主要参数设置同实施案例2，定量特征离子对设为：dC m/z 228.1→112.1(5eV)。
实验结果表明，随着酶解时间的增加，从15分钟到45分钟，通过级联DNA酶反应酶解得到的dC的含量也随之增加；酶解45分钟时，小牛胸腺DNA酶切为单核苷释放dC的效率达到了95.1±2.4％，说明制备的级联酶反应器具有很高的DNA酶切效率。
实施案例4
级联DNA酶反应器酶解小牛胸腺DNA用于检测dT:将12μL的200ng/μL小牛胸腺DNA通过低压微量注射泵注入级联DNA酶反应器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg2+，2mMCa2+)将酶解液冲出，室温(25℃)条件下分别酶切15，30，45分钟直至收集60μL的酶解样品。采用LC-MS定量检测酶切产物中的dC，检测不同酶切时间下的色谱峰如图5所示。
所用LC-MS的主要参数设置同实施案例2，定量特征离子对设为：dT m/z 243.1→127.1(5eV)。
实验结果表明，随着酶解时间的增加，从15分钟到45分钟，通过级联DNA酶反应酶解得到的dC也随之增加；酶解45分钟时，小牛胸腺DNA酶切为单核苷释放dC的效率达到了103.7±0.8％，说明制备的级联酶反应器具有很高的DNA酶切效率。
实施案例5
级联DNA酶反应器酶解Fe2+/H2O2处理的小牛胸腺DNA用于检测8-oxodG：采用经典的Fenton反应处理小牛胸腺DNA，即10μM Fe2+和50μM H2O2于37℃与200ng/μL的小牛胸腺DNA孵育2小时，结束时加入1mM的甲磺酸去铁铵终止反应。将12μL的200ng/μL ct-DNA通过低压微量注射泵注入级联DNA酶反应器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg2+，2mM Ca2 +)将酶解液冲出，室温(25℃)条件下酶切45分钟直至收集60μL的酶解样品。采用LC-MS定量检测酶切产物中的dG，8-oxodG，检测得到的色谱峰如图6所示。
所用LC-MS的主要参数设置：
(1)色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18column(2.1×100mm,1.8μm,Aglient)
(2)流动相比例：等度分离，5.0％甲醇和95.0％水(0.1％乙酸)
(3)流速：0.3mL/min
(4)柱温：30℃
(5)进样量：10μL
(6)质谱条件：ESI电离方式；正离子化，多重监测(MRM)模式，干燥气流速9.0L/min；电喷雾电压3500V；源温度300℃；定量特征离子对：dG m/z 268.1→152.0(5eV)；[15N5]-dG m/z 273.1→157.0(5eV)；8-oxodG m/z 284.1→168.0(5eV)；[15N5]-8-oxodG m/z 289.1→173.0(5eV)。
通过LC-MS测得ct-DNA，H2O2以及Fe2+/H2O2处理的ct-DNA中8-oxodG的含量分别为：34.3±2.7，49.5±4.2，230.1±3.4个损伤/106dG。而常规的溶液酶解体系测得值分别为：43.3±3.4，59.5±6.7，241.1±9.0个损伤/106dG。说明级联DNA酶反应器能够将基因组DNA有效地酶解为单核苷，并可能降低酶解等过程引起的dG的氧化及8-oxodG的干扰，这对8-oxodG准确定量分析具有重要意义。
实施案例6
级联DNA酶反应器酶解TCBQ/H2O2处理的小牛胸腺DNA用于检测8-oxodG：采用10μMTCBQ和50μM H2O2于37℃与200ng/μL的小牛胸腺DNA孵育0.5小时，结束时加入1mM的甲磺酸去铁铵终止反应。将12μL的200ng/μL ct-DNA通过低压微量注射泵注入级联DNA酶反应器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg2+，2mM Ca2+)将酶解液冲出，室温(25℃)条件下酶切45分钟直至收集60μL的酶解样品。采用LC-MS定量检测酶切产物中的dG，8-oxodG，检测得到的色谱峰如图7所示。
所用LC-MS的主要参数设置同实施案例4。
通过LC-MS检测得到TCBQ/H2O2处理的ct-DNA中8-oxodG的含量为982.6±30.1个损伤/106dG。
实施案例7
级联DNA酶反应器酶解HepG2细胞基因组DNA用于检测8-oxodG：提取HepG2细胞的基因组DNA，将12μL的80ng/μL HepG2细胞基因组DNA通过低压微量注射泵注入级联DNA酶反应器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg2+，2mM Ca2+)将酶解液冲出，室温(25℃)条件下酶解45分钟直至收集60μL的酶解样品。采用LC-MS定量检测酶切产物中的dG，8-oxodG检测得到的色谱峰如图8所示。
所用LC-MS的主要参数设置同实施案例4。
通过LC-MS检测得到HepG2细胞中8-oxodG的含量为9.6±3.4个损伤/106dG。
通过以上实例证明了本发明中所制备的级联DNA酶反应器能够将细胞基因组DNA的快速酶解为单核苷，结合LC-MS能够进行细胞基因组DNA中DNA加合物的快速定性、定量分析。该方法可以应用于环境污染与DNA加合物的产生机理的相关研究。

Claims (7)

1.一种用于DNA酶切为单核苷的级联酶反应器，其特征在于由两支以上的DNA单一酶反应器的串联得到级联酶反应器，基因组DNA通过该反应器可被酶解为单核苷。
2.基于权利要求1所述的级联酶反应器，其特征在于：以毛细管整体柱为载体，采用戊二醛法或碳二亚胺缩合法(NHS/EDC)将DNA水解酶固载于毛细管整体柱上，制得单一酶反应器；不同酶反应器按照一定次序进行连接构建级联酶反应器。
3.基于权利要求2所述的级联酶反应器，所述的酶为：脱氧核糖核酸酶、磷酸二酯酶(包括磷酸二酯酶I，磷酸二酯酶II)和碱性磷酸酶等。
4.基于权利要求1所述的级联酶反应器，其特征在于，单一酶反应器的长度为2-50cm，反应器内径为25-200μm。
5.基于权利要求1所述的级联酶反应器，其特征在于，可将基因组DNA酶解为单核苷，酶切效率可达99.0％以上；酶切时间小于1小时。
6.基于权利要求1所述的级联酶反应器，其特征在于，具有很好的稳定性，可重复使用30次以上和保存2月以上。
7.基于权利要求1所述的级联酶反应器，其特征在于：经过级联酶反应器酶解后的样品不用热变性或超滤除酶，可直接进入质谱进行目标核苷产物的定性或定量分析，可用于环境污染物暴露下的DNA加合物的分析。
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