CN103184278A - 基于固定化酶微反应器的dna测序技术 - Google Patents
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Abstract
本发明基于固定化酶微反应器的DNA测序技术。本发明将固定化酶微反应器合成技术与质谱检测相结合，应用于DNA测序分析。此种固定化酶微反应器，具有均一的孔隙结构和优良的通透性；反应器可以重复使用多次，且酶活保持情况良好；在反应器制作过程中加入碱性柠檬酸盐，可以有效抑制金属离子的产生，使得谱图清晰、基线平稳，保证了DNA测序过程中每个核苷酸组分的定性鉴定。本发明可以用于DNA或RNA的测序，也可以用于环境污染物与DNA形成的DNA加合物结合位点的检测，对于进一步研究DNA加合物形成的序列特异性分析，阐明化学毒物导致肿瘤作用机制具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明将固定化酶微反应器合成技术与质谱检测相结合，应用于DNA测序分析，是一种快速、准确、高效的DNA测序方法。
背景技术
1977年，化学家Allan Maxam，Walter Gilbert和Frederick Sanger先后提出了DNA化学降解测序和DNA双脱氧链末端终止测序，并获得了1980年的诺贝尔化学奖。短短三十年过去，DNA测序技术已经从最初的以电泳为基础的测序方法发展到以大规模测序平台为主的第四代测序，取得了令人瞩目的成就。不论是人类基因组计划的顺利实施，还是生命科学已经进入后基因组时代的今天，DNA测序技术的迅猛发展，对于生命奥秘探索，疾病治疗，癌症防治，生命科学及其相关学科的发展等诸多领域都起到了巨大的推动作用。
近年来，将DNA测序技术应用于环境污染物与DNA形成的加合物检测工作中，成为了普遍关注的热点问题。DNA加合物是一类极其重要、具有多种作用的生物标志物，可应用于环境致癌物的暴露监测、基因毒性测定、个体敏感性和环境致癌物与基因的相互作用研究、癌症风险评价、环境致癌因素筛查以及癌症预防研究等。基于DNA测序技术的加合物检测方法，主要依赖于产生DNA损伤的因素在DNA修饰位点引起DNA断裂的能力或者抑制聚合酶作用的能力，用来确定致癌物引起的DNA加合物的损伤分布、结合位点、配位基结合等。其中，采用核酸外切酶来控制DNA酶解和质谱检测相结合的DNA酶解测序法得到了广泛应用：采用核酸外切酶，按照顺序从DNA寡核苷酸链的3’端或5’端降解单一核苷酸，控制不同的酶解时间，取出酶解液，进行质谱鉴定，根据相邻分子量之差即可以确定核苷酸分布情况，将不同酶解时间的序列信息进行汇总，即可得到DNA酶解过程中完整的核苷酸片段，达到了DNA测序的目的。
DNA酶解测序法，是一种溶液体系内的酶解，酶解速度快、较难控制，而且对高分子量酶解产物的质谱响应较差，金属离子加合物干扰严重。本发明将酶的固定化技术引入到DNA测序中，设计并合成了固定化酶微反应器，即将核酸外切酶固定在硅胶整体柱上。采用反应器进行酶解，检测效果得到了较大的改善，同时具有更高的酶解效率、酶可重复使用并能减少酶的自身降解等优点。此外，使用固定化酶微反应器还可以避免样品的手工处理，从而也就减少了样品被污染的可能性。本发明适用于DNA加合物的快速、灵敏的检测分析。对于研究DNA加合物的位点特异性，并且进一步阐明某种化学毒物导致某特定肿瘤的机制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用固定化酶微反应器-质谱技术进行DNA测序的检测方法。
本发明提供的DNA测序方法原理如附图1所示，其具体检测方法依次包括以下步骤：
1)固定化酶微反应器的制作；
2)采用固定化酶微反应器对DNA(无任何修饰)进行酶解测序、质谱进行定性分析；
3)采用固定化酶微反应器对含有修饰位点和DNA加合物结合位点的DNA进行酶解测序、质谱进行定性分析。
利用固定化酶微反应器对DNA进行测序的检测方法为：如附图2和附图3显示，以四甲氧基硅烷为交联剂，水溶性的聚乙二醇为聚合成分，乙酸为催化剂，通过水解和缩聚反应实现溶胶凝胶化，形成具有孔隙结构的整体凝胶材料；然后，在整体凝胶材料基础上，键合硅烷偶联剂3-氨基丙基三甲氧基硅烷，引入氨基基团；接下来，键合戊二醛，为核酸外切酶的键合提供醛基基团，从而达到了固载酶的目的。将DNA溶液缓慢推入制作好的固定化酶微反应器内，通过控制不同的时间在反应器内对DNA进行酶解。将酶解液进行质谱(选用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，MALDI-TOF MS)鉴定，根据DNA中相邻核苷酸分子量之差即可确定酶解产物中核苷酸的分布情况，将不同酶解时间的情况进行汇总，即可得到DNA寡核苷酸链整体核苷酸分布情况，达到了对DNA进行测序的效果。同样，DNA加合物结合位点的检测也是采用以上的定性方法。
本发明所提供的DNA测序方法，具有DNA用量少(1.0μL)，检测灵敏度高，高效快速等优点，克服了传统溶液体系的酶解速度难以控制，金属离子干扰严重等缺陷，具有广泛的应用前景。可以应用于DNA或RNA的测序，也可以应用于DNA加合物的检测分析。
附图说明
图1为基于固定化酶微反应器的DNA测序技术原理图；
图2为硅胶整体材料的合成机理；
图3为核酸外切酶(以蛇毒磷酸二酯酶SVP为例)的固定化机理；
图4为硅胶整体柱的扫描电子显微镜谱图；
图5为固定化酶微反应器的明场和荧光谱图(a和b没有键合SVP；c和d已经键合SVP)；
图6为固定化酶微反应器(a)和自由溶液(b)酶解情况比较图(反应器分别保存4、8、12、20和30天；自由溶液分别保存0和1天)，半定量示意图中箭头代表酶解方向；
图7为固定酶过程中缓冲溶液的优化比较图(A，25mM Tris-HCl，pH6.9；B，25mM phosphatebuffer，pH6.9；C，25mM DHC-NH4OH，pH6.9；D，25mM DHC-NH4OH，pH9.4)，酶解过程中缓冲溶液是25mM DHC-NH4OH，pH9.4，十字星和同心圆分别代表加钾离子峰和未知组分峰；
图8为酶解过程中缓冲溶液的优化比较图(A，25mM Tris-HCl，pH6.9；B，25mM phosphatebuffer，pH6.9；C，25mM DHC-NH4OH，pH6.9；D，25mM DHC-NH4OH，pH9.4)，固定酶过程中缓冲溶液是25mM DHC-NH4OH，pH9.4，星号和同心圆分别代表加钾离子峰和未知组分峰；
图9为采用固定化酶微反应器对22mer-DNA进行测序(22mer-DNA：5’-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’；a，酶解10min；b，酶解20min；c，酶解30min)；
图10为采用固定化酶微反应器对含有修饰位点的29mer-DNA进行测序(29mer-DNA：5’-/56-TAMN/AGTCC GTGGTAGGGCAGGUBr TGGGGTGACT-3’)；
图11为采用固定化酶微反应器对33mer-DNA和丙烯醛的加合物进行测序(33mer-DNA：5’-GCCCTGATTTTCATGGGGCTAAGGGTCGCGGGA-3’)。
具体实施方式
本发明的具体实施方法包括以下几个步骤：
1、固定化酶微反应器的制作
取经过预处理的毛细管柱，将溶胶-凝胶化整体材料缓慢冲入毛细管内，至均一无气泡；水浴条件下进行缩聚反应；进一步采用高温老化；然后，在此基础上采用戊二醛法进行氨基硅烷化和核酸外切酶的固定化。
2、采用固定化酶微反应器对DNA(无任何修饰)进行酶解测序、质谱进行定性分析
取一定浓度的DNA溶液，按照不同酶解时间通过固定化酶微反应器，在不同的时间段收集酶解液。
将酶解液通过MALDI-TOF MS进行核酸的定性分析。用激光照射DNA酶解样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给DNA分子，使得DNA分子发生电离，经电离后的DNA分子飞速通过质量分析器，根据到达检测器的飞行时间不同，而检测出不同质量的离子，即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比，质荷比大的离子飞行速度小，到达检测器的时间长，由于酶解液中含有不同分子量的DNA片段，它们达到检测器的时间各不相同，从而可以将各种酶解产物进行区分，达到DNA测序的效果。
4、采用固定化酶微反应器对含有修饰位点和DNA加合物结合位点的DNA进行酶解测序、质谱进行定性分析
选取含有修饰位点的29mer-DNA和33mer-DNA-丙烯醛溶液，分别经反应器酶解，然后采用MALDI-TOF MS定性分析；其中，将33mer-DNA和丙烯醛在溶液体系内避光反应48小时。
下述实例中所用的MALDI-TOF/MS基质是邻氨基苯甲酸(anthranilic acid，AA)、烟碱酸(Nicotinic acid，NA)和柠檬酸铵(diammoniumhydrogene citrate，DHC)的混合基质体系：AA(3.0mg，0.02mmol)和NA(1.5mg，0.01mmol)溶于50μL乙腈和30μL水，加入6μL10mM DHC。最后三者摩尔比：AA∶NA∶柠檬酸铵＝2∶1∶0.003。上样模式：分别取基质1.5μL，样品1.0μL，混合均匀，最后上样1.0μL，晾干。
下述实例中所用的MALDI-TOF/MS主要实验参数：
(1)Linear Positive ion mode
(2)Ion soure：19kv
(3)Linear：13kv
(4)Vacuum：2*10-6mbar
(5)TOF：1.8m linear，3.4m reflector
(6)pulse delay extraction time：200ns
(7)Laser energy：60-70％
实施例1、固定化酶微反应器的表征与制作条件的优化
本实例采用扫描电子显微镜对内径为75μm的硅胶整体柱进行表征，附图4显示合成的硅胶整体柱具有严格的硅胶骨架结构，其中均匀分布着较大的空隙结构，使得反应器可以保持较低的背压和良好的通透性，有利于酶解液的传输。
采用荧光显微镜对反应器键合酶前后进行表征。采用SYPRO Orange染料(1∶5000)对反应器预染20分钟，然后采用25mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.9)冲洗10分钟，将过量的未结合染料的蛋白分子冲洗干净，然后进行荧光显微镜的观察，采用绿光(450-490nm)激发，附图5D显示键合了酶的反应器可以观察到强烈的荧光信号，相反，附图5B显示没有键合酶的反应器没有观察到任何荧光信号，表明酶已经成功键合到整体材料上。
采用P-nitrophenyl thymidine-5′-phosphate(NTP)作为酶解底物，通过检测400nm处吸光度值的变化，来考察反应器内SVP酶活情况的变化，实验表明：反应器内SVP的酶活(0.0110Units/mg)比溶液体系酶活(0.0008Units/mg)高出近14倍，分析表明：在反应器内，存在着局部高浓度SVP的微环境，最终使得反应器酶活有所增加，同时也表明，将酶固定在整体材料上，不但没有降低酶活反而有利于酶活的增加和保持。
本通过酶解产生的质量梯度谱图和半定量示意图来考察反应器酶活保持情况。每次酶解前要用缓冲溶液25mM DHC-NH4OH(pH9.4)冲洗20分钟。附图6显示，反应器在保存了4、8、12、20和30天之后，酶活保持情况良好，和新制反应器酶活情况相当；但是，溶液体系，将酶保存1天后丧失了酶活，所以，将酶固定在整体住内，十分有利于酶活的保持，反应器可以重复使用多次。
DNA是电负性较强的大分子，很容易与溶液中的金属离子产生加合物，从而严重干扰质谱的检测。本实例在固定酶和酶解过程中，都加入缓冲溶液25mM DHC-NH4OH(pH9.4)，附图7D和附图8D显示，采用其作为缓冲溶液，可以有效的抑制金属离子的产生，使得质谱图清晰、基线平稳，提高了质谱检测的灵敏度。
综上，本实例证明我们设计并合成的固定化酶微反应器，具有均一的孔隙结构和优良的通透性，为酶的固定化和酶解液的传输提供了优良的环境；由于酶的固定化所产生的局部高浓度SVP微环境，使得反应器的酶活比溶液体系高出近14倍；反应器可以重复多次使用，且酶活保持情况良好；在反应器制作过程中加入碱性柠檬酸盐，可以有效抑制金属离子的产生，保证了DNA测序过程中每个核苷酸组分的定性鉴定。
实施例2、采用固定化酶微反应器对22mer-DNA进行测序分析
按照实例1优化的条件，采用固定化酶微反应器对22mer-DNA进行测序分析。22mer-DNA序列顺序为：5’-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’。取浓度为50μM 22mer-DNA溶液，在反应器内分别酶解10、20和30分钟，两次酶解之间用25mM DHC-NH4OH(pH9.4)进行冲洗20分钟，然后采用MALDI-TOF MS对酶解液进行定性分析。附图9显示，随着酶解时间的延长，酶解速度相对缓慢；对于高分子量酶解产物的响应较好；金属离子加合物显著减少，反应器具有显著的抑制金属离子的效果。
实施例3、采用固定化酶微反应器对含有修饰位点(UBr)的29mer-DNA进行测序分析
按照实例1优化的条件，采用固定化酶微反应器-质谱技术对含有修饰位点(UBr)的29mer-DNA进行测序分析。29mer-DNA序列顺序为：5’-/56-TAMN/AGTCCGTGGTAGGGCAGGUBr TGGGGTGACT-3’)；取浓度为50μM 29-merDNA溶液，在反应器内酶解10分钟，两次酶解之间用25mM DHC-NH4OH(pH9.4)冲洗20分钟，然后采用MALDI-TOFMS对酶解液进行定性分析。附图10显示，可以确定UBr修饰的位点是在距5’末端第19位，由于此修饰位点的存在，在酶解20min内，可以阻碍酶解反应的进行。
实例4、采用固定化酶微反应器对33mer-DNA-丙烯醛加合物进行测序分析
按照实例1优化的条件，采用固定化酶微反应器对33mer-DNA-丙烯醛加合物进行测序分析。33mer-DNA序列顺序为：5’-GCC CTG ATT TTC ATG GGG CTA AGG GTC GCG GGA-3’；取浓度为50μM 33mer-DNA溶液和终浓度是1mM丙烯醛(溶于20mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液)在37℃条件下避光反应48小时，然后，将反应液在反应器内酶解10分钟，两次酶解之间用25mM DHC-NH4OH(pH9.4)冲洗20分钟，然后采用MALDI-TOF MS对酶解液进行定性分析。附图11显示，只有在距5’端第12位含有一个Acr-dC加合物，在距5’端15位含有一个Acr-dG加合物。表明丙烯醛-dC/dG加合物的形成是具有序列选择性的，这与supF基因突变位点是一致的，对于丙烯醛DNA加合物致突变的研究具有十分重要的作用。
通过以上的实例证明了本发明可以对DNA进行测序分析，并且可以进一步用于环境污染物和DNA形成的加合物检测中，具有准确、快速、灵敏度高等优点。
Claims (5)
1.一种DNA测序的高效准确检测方法，其特征在于利用自制的固定化酶微反应器酶解和质谱鉴定相结合的技术进行测序分析。
2.基于权利要求1所述，其检测依次包括以下步骤：
1)固定化酶微反应器的制作；
2)采用固定化酶微反应器对DNA(无任何修饰)进行酶解测序、质谱进行定性分析；
3)采用固定化酶微反应器对含有修饰位点和DNA加合物结合位点的DNA进行酶解测序、质谱进行定性分析。
3.基于权利2，固定化酶微反应器的制作方法包括：
1)采用戊二醛法将蛇毒磷酸二酯酶键合到硅胶整体柱内；
2)在固定酶和酶解过程中采用碱性柠檬酸盐作为缓冲溶液，有效抑制金属离子。
4.基于权利要求2所述，待测样品包括：
1)DNA；
2)RNA；
3)含有修饰位点的DNA；
4)DNA加合物。
5.基于权利1、2、3和4所述的方法，其特征在于：本发明可以用于环境污染物与DNA形成的DNA加合物结合位点的检测；应用于DNA加合物形成的序列特异性分析；应用于阐明化学毒物导致肿瘤作用机制的风险评估。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106399089A (zh) * | 2016-07-12 | 2017-02-15 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种用于dna酶切为单核苷的级联酶反应器 |
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| WO2003004690A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | 454$m(3) CORPORATION | Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter |
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2011
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| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20130703 |