CN106372459A

CN106372459A - 一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法及装置

Info

Publication number: CN106372459A
Application number: CN201610770386.3A
Authority: CN
Inventors: 朱嘉麒; 王棪; 张振宇; 马丽娟
Original assignee: TIANJIN NOVOGENE BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN NOVOGENE BIOLOGICAL INFORMATION TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106372459B

Abstract

本发明公开了一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法及装置。其中，该方法包括以下步骤：S1，分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；S2，通过二代测序得到目标区域的序列；S3，将目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；S4，将阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将待测样本在每个扩增子上的覆盖度与正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。应用本发明的技术方案，提高了基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的准确性。

Description

一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法及装置

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体而言，涉及一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法及装置。

背景技术

多重扩增子二代测序是将感兴趣的基因组区域定制成特异性扩增引物与基因组DNA进行特异性扩增，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序的研究策略。多重扩增子二代测序是目前基因组学研究中的一个热点技术，主要原因是该技术消耗少量的成本和时间。在相同成本下，研究者可以研究到更多的样本数量和测到更深的深度。作为一个强大、有效的技术，它在新一代高通量测序中发挥独特之处，应用领域越来越广泛。

赛默飞公司推出的Ion AmpliSeq^TM是扩增子二代测序典型产品。通过扩增富集目标区域序列，然后使用proton进行二代测序得到序列具体情况，然后使用统计学检验对样本中低拷贝数变异与扩增中出现的不一致进行区分。但是这种方法检出效果的准确性还待进一步地提高。

发明内容

本发明旨在提供一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法及装置，以提高基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的准确性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法。该方法包括以下步骤：S1，分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；S2，通过二代测序得到目标区域的序列；S3，将目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；S4，将阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将待测样本在每个扩增子上的覆盖度与正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

进一步地，S4中，如果均一化后的待测样本的扩增子上的覆盖度与背景噪音相比p-value<1e-3，那么扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

进一步地，S3中数据信息处理包括：S31，使用TMAP比对软件将目标区域的序列与参考基因组相比对；S32，使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度。

根据本发明的另一方面，提供了一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的装置。该装置包括：样本处理装置，用于分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，并多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；测序装置，用于通过二代测序得到目标区域的序列；覆盖度获取装置，用于将目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；拷贝数变异检出装置，用于将阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将待测样本在每个扩增子上的覆盖度与正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

进一步地，拷贝数变异检出装置中，如果均一化后的待测样本的扩增子上的覆盖度与背景噪音相比p-value<1e-3，那么扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

进一步地，覆盖度获取装置中数据信息处理包括：使用TMAP比对软件将目标区域的序列与参考基因组相比对；使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度。

每个扩增子的扩增效果不同，应用本发明的技术方案，将阴性对照样本在每个扩增子分别使用其覆盖度创建正态分布模型作为背景噪音，将待测样本在每个扩增子上的覆盖度与正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子即p-value<1e-3的作为拷贝数变异阳性检出，因此，顾及到每个扩增子在不同次测序时的覆盖度差异大小，对于稳定的扩增子可以得到更低拷贝数的阳性检出，对于有异质性的组织或是含有少量突变DNA的样本都可以增加灵敏度，而不稳定的扩增子提高拷贝数检出的阈值，可以防止假阳性的检出。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明一具体实施方式的基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法流程示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

发明人发现，在基于扩增子的二代测序中，每次实验每个扩增子很难按照比例进行扩增。现有技术对所有扩增子设置同样的阈值，而明显由于引物序列差异，在扩增时会有一定区别，特别是不同引物在多次扩增之间覆盖度的方差不同会影响检出效果，采取同样阈值不能最大限度区分引物原因造成的背景噪音与真实突变。

本发明使用阴性对照样本得到每个扩增子上背景噪音分布，使用正态检验区分在待测样本中能与背景噪音区分的所有和目标性状相关的拷贝数变异。这样，可以使待测样本中拷贝数变异的灵敏度和特异度得到提升。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法。该方法包括以下步骤：S1，分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；S2，通过二代测序得到目标区域的序列；S3，将目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；S4，将阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将待测样本在每个扩增子上的覆盖度与正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

优选的，S4中，如果均一化后的待测样本的扩增子上的覆盖度与背景噪音相比p-value<1e-3，那么扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

根据本发明一种典型的实施方式，S3中数据信息处理包括：S31，使用TMAP比对软件将目标区域的序列与参考基因组相比对；S32，使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的装置。该装置包括：样本处理装置，用于分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，并多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；测序装置，用于通过二代测序得到目标区域的序列；覆盖度获取装置，用于将目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；拷贝数变异检出装置，用于将阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将待测样本在每个扩增子上的覆盖度与正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

优选的，拷贝数变异检出装置中，如果均一化后的待测样本的扩增子上的覆盖度与背景噪音相比p-value<1e-3，那么扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

根据本发明一种典型的实施方式，覆盖度获取装置中数据信息处理包括：使用TMAP比对软件将目标区域的序列与参考基因组相比对；使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度。

根据本发明一种典型的实施方式，基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法如图1所示，主要包括拷贝数变异检测程序外完成和拷贝数变异检测程序内完成两大部分，其中，前一部分包括样本采集、样本处理测序及下机数据；后者包括阴性对照样本数据处理得到背景噪音，待测样本数据与背景噪音进行统计检测得到检测结果。

根据本发明一种典型的实施方式，基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法包括以下步骤：1)样本处理：目标区域扩增、引物消化、末端修复、加接头、磁珠纯化、模板富集、测序；2)数据处理：使用TMAP比对软件将二代测序序列比对到参考基因组上，以及使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度；3)输入待测样本在每个扩增子上覆盖度的文件和使用阴性对照样本相同实验方法得到的每个扩增子背景噪音文件，进行统计学检验，如果背景噪音与均一化后的覆盖度有显著区别(p-value<1e-3)，那么输出阳性检出，否则输出阴性结果。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。本实施例中没有详细描述的步骤可采用本领域的常规技术手段实现。

实施例1

本实施例中，待测样本是SK-BR-3细胞系(美国模式培养物集存库购买)，为一例Her2扩增阳性细胞系，经过3d-pcr测试带有9倍的HER2基因阳性扩增。

本实施例的具体步骤如下(本实例中所有试剂购自赛默飞公司)：

1)提取待测样本DNA，利用荧光定量计(Qubit)进行定量，进行浓缩或加无核酸酶的水稀释，使其浓度为5ng/ul，体积为6ul。

2)利用多重PCR技术对目标区域进行扩增，PCR反应体系如表1所示。

表1

试剂	体积
		高保真多重扩增反应混和液	4μl
引物混合液	10μl
		血浆游离DNA	6μl

其中，引物具体序列见表2。

表2

多重PCR反应条件如表3所示。

表3

3)利用尿嘧啶-DNA糖基化酶对带有尿嘧啶的引物进行消化，利用末端修复酶将DNA片段的末端补平。

消化及补平反应体系如表4所示。

表4

试剂	体积
		消化酶&修复酶混和液	2μl
PCR扩增产物	20μl

引物消化和末端修复条件如表5所示：

表5

4)将引物消化后的目标区域DNA用连接酶和测序接头进行连接，反应体系如表6：

表6

试剂	体积
		1号接头溶液	0.5μl
2号接头溶液	0.5μl
		连接酶	2μl
连接反应混合液	4μl
		无核酸酶的水	1μl
上步反应得到的DNA	22ul

其中，1号，2号接头序列见表7。

表7

*代表T碱基硫代修饰(phosphorothioate bond)。

连接条件如表8：

表8

5)将上一步得到的连接产物进行磁珠纯化，然后利用qPCR定量得到文库的摩尔浓度。

6)根据每个文库的浓度和目标数据量计算上机需要的体积，按计算结果吸取文库混合，然后采用乳液PCR的方法使模板在测序微珠上进行单克隆扩增，将微珠纯化后加入测序芯片。

7)测序，在proton基因测序仪上完成测序，测序平台将得到的电信号转化为碱基序列下机数据为bam文件存储所有测序结果。

8)使用TMAP将测序结果比对上参考基因组，使用samtools软件建立比对文件的索引，使用GATK软件得到每一个扩增子上的测序深度，平均测序深度为40956X，质控信息如表9所示。

表9

其中，目标区域序列为比对上目标区域的序列除以总序列，为有效数据率。

9)输入待测样本在每个扩增子上覆盖度的文件和使用阴性对照样本相同实验方法得到的每个扩增子背景噪音文件，进行统计学检验，如果背景噪音与均一化后的覆盖度有显著区别(p-value<1e-3)，那么输出阳性检出，否则输出阴性结果。突变检出结果如表10所示。一共有5个ERBB2的扩增子，每一个扩增子与阴性样本的正态分布进行对比，p-value都在1e-9以下，说明在这个样本中ERBB2与阴性样本有显著性区别，即发生扩增，即存在拷贝数变异。

表10

扩增子序号	染色体	起始位置	终止位置	基因	信息
						1	chr17	37868132	37868230	ERBB2	7.13X\|p<1e-9
2	chr17	37880183	37880281	ERBB2	7.61X\|p<1e-9
						3	chr17	37880966	37881063	ERBB2	6.02X\|p<1e-9
4	chr17	37881292	37881385	ERBB2	5.19X\|p<1e-9
						5	chr17	37881562	37881645	ERBB2	5.82X\|p<1e-9

对比：本实施例样本使用赛默飞公司的Torrent-Variant-Caller软件使用默认参数进行检测没有检出结果，这是因为赛默飞公司的软件对所有位点采用同一阈值，就需要使用最保守阈值以对噪音最大的位点进行过滤。

由此可见，目前，多重扩增子测序数据使用TVC软件进行拷贝数变异检测，可以检测多个基因的拷贝数变异，对所有扩增子有相同阈值，并没有考虑到扩增子不同批扩增时的差异造成的影响，对于比较稳定的扩增子没有达到利用的极限，对于不稳定的扩增子容易造成假阳性结果。而采用本发明的技术方案，利用阴性对照样本在所有扩增子上的背景噪音信息，判断待测样本中的基因上的扩增子覆盖度能否与背景噪音区分，最大化检测血浆中拷贝数变异的能力，同时不会产生假阳性结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，所述阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；

S2，通过二代测序得到所述目标区域的序列；

S3，将所述目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；

S4，将所述阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将所述待测样本在每个扩增子上的覆盖度与所述正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中，如果均一化后的所述待测样本的扩增子上的覆盖度与所述背景噪音相比p-value<1e-3，那么所述扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3中数据信息处理包括：

S31，使用TMAP比对软件将所述目标区域的序列与所述参考基因组相比对；

S32，使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度。

4.一种基于扩增子二代测序拷贝数变异检测的装置，其特征在于，包括：

样本处理装置，用于分别提取待测样本和阴性对照样本的DNA，并多重扩增子扩增与目标性状相关突变的目标区域，其中，阴性对照样本为目标性状相关基因未突变的样本；

测序装置，用于通过二代测序得到所述目标区域的序列；

覆盖度获取装置，用于将所述目标区域的序列与参考基因组相比对，数据信息处理后得到每个扩增子的覆盖度；

拷贝数变异检出装置，用于将所述阴性对照样本在每个扩增子上的覆盖度分别创建正态分布模型作为背景噪音，将所述待测样本在每个扩增子上的覆盖度与所述正态分布模型做双边检验，将不属于正态分布的扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述拷贝数变异检出装置中，如果均一化后的所述待测样本的扩增子上的覆盖度与所述背景噪音相比p-value<1e-3，那么所述扩增子作为拷贝数变异阳性检出。

6.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述覆盖度获取装置中数据信息处理包括：

使用TMAP比对软件将所述目标区域的序列与所述参考基因组相比对；

使用samtools软件建立比对文件的索引，并且使用GATK软件得到每个扩增子上的覆盖度。