CN106367483B - TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents

TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用。本发明是基于本发明发明人首次发现AML患者外周血γδT细胞TRDV1～TRDV8亚家族的克隆性增殖情况与AML患者的疗效和预后相关所提出的技术方案。克隆性增殖的TRDV4和TRDV8亚家族与AML患者获得完全缓解相关，是保护性因素；克隆性增殖的TRDV5和TRDV6亚家族与AML患者复发相关。TCRγδT细胞亚家族的谱系分析和克隆性增殖情况在预测AML患者临床疗效和预后评价方面具有广阔的前景，可为AML个体化治疗提供更多的基础研究资料。

Description

TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂 盒中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别涉及TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，白血病细胞由于失去分化成熟的能力而停滞于细胞发育的不同阶段，并在骨髓及其他造血组织中大量聚积，使正常造血受抑制。近来的研究显示，γδT细胞在AML的过继性免疫治疗具有良好的应用前景，但目前尚没有γδT细胞相关的有效预测AML患者临床疗效及预后评价的实验室指标。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，是基于本发明发明人首次发现AML患者外周血γδT细胞TRDV1～TRDV8亚家族的克隆性增殖情况与AML患者的疗效和预后相关。
所述的TCRγδT细胞亚家族包括TRDV1亚家族、TRDV2亚家族、TRDV3亚家族、TRDV4亚家族、TRDV5亚家族、TRDV6亚家族、TRDV7亚家族和TRDV8亚家族。
所述的试剂盒包括用于扩增TRDV1～TRDV8亚家族cDNA的引物。
所述用于扩增TRDV1～TRDV8亚家族cDNA的引物包括8条上游引物和1条下游引物，具体如下：
VD1：5’-GTGGTCGCTATTCTGTCAACT-3’；
VD2：5’-GCTCCATGAAAGGAGAAGCGA-3’；
VD3：5’-CACTGTATATTCAAATCCAGA-3’；
VD4：5’-TGACACCAGTGATCCAAGTTA-3’；
VD5：5’-TCTGCACATTGTGCCCTCCCA-3’；
VD6：5’-TATCATGGATTCCCAGCC-3’；
VD7：5’-GAACATCACAGCCACCCAGACCG-3’；
VD8：5’-ACTTCCAGAAAGCAGCCAAA-3’；
Cδ：5’-AACAGCATTCGTAGCCCAAGCAC-3’。
所述的试剂盒还包括用于进行不对称扩增的引物，如下：
Cδ-FAM：5’-FAM-GTTTATGGCAGCTCTTTGAAGGT-3’。
所述的试剂盒还包括用于分离外周血单个核细胞的试剂、用于获得γδT细胞的试剂、用于抽提RNA的试剂和用于逆转录的试剂中的一种或至少两种。
所述TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，包括如下步骤：
(1)T细胞克隆性情况的确定：对AML患者的TCRγδT细胞亚家族的cDNA进行PCR扩增；再以荧光素标记的Cδ-FAM引物进行不对称扩增，得到荧光标记的单链PCR产物；然后进行基因扫描分析，确定其T细胞克隆性情况；
当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致，其电泳时的迁移率完全一致，在同一时间通过扫描，所显示的结果为一单峰图像，提示PCR产物来自TCR Vδ的CDR3序列完全相同的γδT细胞即为寡克隆；双峰图像提示为双克隆；多峰提示多克隆；而图像介于寡克隆与多克隆之间，呈一主峰明显高于其他峰的图像并有向寡克隆发展的趋势，提示寡克隆趋势；未检测到表达用阴性表示；
(2)结果分析：
当检测出克隆性增殖的TRDV4和TRDV8亚家族时，表明AML患者获得完全缓解的可能性很大；当检测出克隆性增殖的TRDV5和TRDV6亚家族，表明AML患者复发的可能性很大。
所述的基因扫描分析优选为通过310DNA序列分析仪进行分析。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明人首次发现AML外周血γδT细胞TRDV8和TRDV2表达频率较高，TRDV1、TRDV3、TRDV4及TRDV6亚家族的表达频率较健康对照组相比明显降低；与健康对照组相比，TRDV2和TRDV4亚家族克隆性增殖频率明显增高，而TRDV1亚家族明显降低。如图1，图2和图3所示。正常人外周血表达各亚家族γδT细胞，并呈现多克隆性，这是机体TCR随机重排的结果。AML患者体内可能存在特异的抗原，可引起某一或某些亚家族的TCR发生特异性重排，导致γδT细胞的TCR谱系分布出现偏移，呈现某些亚家族优势利用和克隆性增殖。
2.克隆性增殖的TRDV4和TRDV8亚家族与AML患者获得完全缓解相关，是保护性因素。克隆性增殖的TRDV5和TRDV6亚家族与AML患者复发相关。如图4和图5所示。
本发明提供的γδT细胞中TCR Vδ(TRDV)谱系分析和克隆性增殖情况的检测，在预测AML患者临床疗效和预后评价方面具有广阔的前景，可为AML个体化治疗提供更多的基础研究资料。
附图说明
图1是12例健康对照组(A)和30例AML(B)外周血γδT细胞TRDV亚家族基因扫描结果图。
图2是AML患者与健康对照组外周血γδT细胞TRDV亚家族表达频率比较结果图。
图3是AML患者与健康对照组外周血γδT细胞TRDV亚家族克隆增殖频率比较结果图。
图4是AML患者中复发组与非复发组外周血γδT细胞TRDV亚家族克隆增殖频率比较结果图。
图5是7例AML复发患者TRDV亚家族的基因扫描结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)在与患者签署知情同意书的前提下采血，所有标本取自于清晨空腹静脉血肝素抗凝。收集30例初发未治AML患者的外周血样及12例健康人外周血样本。该部分研究方案已经获得本单位伦理委员会通过。同时收集AML患者临床疗效等临床资料(如表2所示)。
(2)分离外周血单个核细胞。取淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077)4ml加入15ml离心管内，将稀释后的抗凝外周血标本混悬液平铺于分离液之上，以水平离心机于1500rpm离心15分钟。吸取中间单个核层转移至另一15ml离心管中，再加入适量1×PBS，轻轻吹打，以1000rpm离心洗涤10分钟，弃上清，加入1×PBS液至2ml，混匀后计数，并用同样的方法洗涤两次，按1x107/ml调整细胞浓度备用。
(3)应用磁珠分选法分选γδT细胞。操作方法按产品说明。用分离缓冲液洗涤单个核细胞，将悬浮细胞离心弃上清(尽可能不留残液)，按107个细胞数分别加入10μl Anti-TCRγ/δHapten-Antibody(抗TCRγ/δ半抗原抗体)和40μl分离缓冲液，充分混匀，4℃孵育10分钟。按107个细胞数分别加入20μl Anti-Hapten MicroBeads-FITC(FITC标记的抗半抗原免疫磁珠)和30μl分离缓冲液，充分混匀，4℃孵育15分钟。用1ml分离缓冲液洗涤细胞，充分混匀，以300g离心洗涤10分钟，弃上清。安装磁铁与磁力架，将磁柱置于磁铁上，以500μl分离缓冲液重悬细胞后将混合液加入磁柱中，用500μl分离缓冲液冲洗2次。从磁铁上撤下磁柱，加入500μl分离缓冲液，迅速洗脱结合在磁柱上的细胞，重复2次，获得的细胞即为外周血γδT细胞。以1×PBS洗涤细胞2次，重悬细胞后计数备用。
(4)RNA提取及反转录合成cDNA。按说明书操作方法，用RNA提取Trizol试剂盒提取所收集的外周血γδT细胞的RNA，并应用随机引物和反转录酶试剂盒反转录合成cDNA第一链，然后以RT-PCR检测β2微球蛋白基因确定合成cDNA的质量。
(5)TCR Vδ亚家族谱系分析及克隆性增殖情况检测。
5.1PCR扩增TCR Vδ8个亚家族：根据8个TCR Vδ基因谱系的cDNA序列设计8个Vδ(TRDV1-TRDV8)特异性上游引物，并在C区设计一下游引物Cδ(具体引物序列如表1所示)。总反应体系20μl，其中1μl cDNA产物、0.2mmol/L dNTP、1.25U Taq聚合酶、1.5mmol/L MgCl2、5×PCR缓冲液4μl、dH2O补足至20μl、含任一0.15μmol/L Vδ引物(8个Vδ亚家族之一)和对应下游Cδ引物。
反应条件：94℃3分钟；94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1分钟，40个循环；72℃10分钟，最后PCR产物保存于4℃中。取8μl PCR产物电泳分析结果。
5.2标记PCR产物：反应体系10μl，含2.5μl未标记的PCR产物、0.1μmol/L Cδ-Fam引物、1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1.0U Taq聚合酶、5×PCR缓冲液2μl、dH2O补足至10μl。
反应条件：94℃3分钟；94℃1分钟、66℃1分钟、72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟，最后PCR产物保存于4℃中。
5.3基因扫描样品配制：荧光素标记的PCR产物(2μl)加入10μl混合液(高质量的去离子甲酰胺(Hi-Di Formamide)与Genescan-500LIZ分子量标准品按20:1(体积比)配比)中，利用310DNA序列分析仪进行基因扫描分析。
5.4基因扫描(按操作指南进行)
1)按照操作指南准备好仪器，更换缓冲液和水。
2)灌胶：操作前2小时从4℃冰箱取出POP-4(Performance Optimized Polymer-4)胶恢复至室温，将胶液抽进至贮胶5ml针筒中，倒置后排出针筒内气泡装紧针筒于310序列分析仪上。
3)上样：将备好的样品于94℃变性4分钟，随后立即放置冰上冷却2分钟。将变性后样品加入96孔板，直接装载到310序列分析仪进行毛细管电泳。
4)运行：电泳过程中CCD检测器把荧光信号转换为电信号，并将其传送给安装310数据采集软件的计算机工作站进行数据处理，以电泳信号图的形式展现出来。
5)数据及分析：数据处理完成后存储于计算机数据库里，以电泳信号图的形式显示出来，打开GeneMapper SoftwareTMV3.5，将保存于计算机硬盘数据库中的原始数据加进分析软件，分析产物的长度和荧光素强度。电泳图信号的X轴代表DNA片段大小，Y轴代表相对荧光强度，结果见图1。
(6)将TRDV克隆增殖情况结合AML患者临床资料，与患者疗效及预后进行相关性分析(表2)，发现AML外周血γδT细胞TRDV8和TRDV2表达频率较高，TRDV1、TRDV3、TRDV4及TRDV6亚家族的表达频率较健康对照组相比明显降低(图2)；TRDV8和TRDV4克隆性增殖频率较高，与健康对照组相比，TRDV2和TRDV4亚家族克隆性增殖频率明显增高，而TRDV1亚家族明显降低(图3)。克隆性增殖的TRDV4和TRDV8亚家族与AML患者获得完全缓解相关，是保护性因素；与非复发组相比，复发组中克隆性增殖的TRDV5和TRDV6亚家族频率明显增加，提示其与AML患者复发相关(图4和图5)。可见，正常人外周血表达各亚家族γδT细胞，并呈现TRDV1～TRDV8多家族多克隆；AML初发患者外周血γδT细胞中当检测出克隆性增殖的TRDV4和TRDV8亚家族时，可能与其获得完全缓解相关，当检测出克隆性增殖的TRDV5和TRDV6亚家族，可能与其复发相关。上述实验结果表明通过检测TCRγδT细胞亚家族在预测AML疗效及预后评估具有重要意义。
表1 RT-PCR实验所涉及的引物序列
表2 AML患者临床资料
注：F表示女性，M表示男性，M0表示急性髓性白血病微分化型，M1表示急性粒细胞白血病未分化型，M2表示急性粒细胞白血病部分分化型，M3表示急性早幼粒细胞白血病，M4表示急性粒-单核细胞白血病，M5表示急性单核细胞白血病，CR表示完全缓解，PR表示部分缓解，NR表示未缓解
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，所述的TCRγδT细胞亚家族包括TRDV1亚家族、TRDV2亚家族、TRDV3亚家族、TRDV4亚家族、TRDV5亚家族、TRDV6亚家族、TRDV7亚家族和TRDV8亚家族。
2.根据权利要求1所述TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒包括用于扩增TRDV1～TRDV8亚家族cDNA的引物。
3.根据权利要求2所述TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述用于扩增TRDV1～TRDV8亚家族cDNA的引物包括8条上游引物和1条下游引物，具体如下：
VD1：5’-GTGGTCGCTATTCTGTCAACT-3’；
VD2：5’-GCTCCATGAAAGGAGAAGCGA-3’；
VD3：5’-CACTGTATATTCAAATCCAGA-3’；
VD4：5’-TGACACCAGTGATCCAAGTTA-3’；
VD5：5’-TCTGCACATTGTGCCCTCCCA-3’；
VD6：5’-TATCATGGATTCCCAGCC-3’；
VD7：5’-GAACATCACAGCCACCCAGACCG-3’；
VD8：5’-ACTTCCAGAAAGCAGCCAAA-3’；
Cδ：5’-AACAGCATTCGTAGCCCAAGCAC-3’。
4.根据权利要求3所述TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于进行不对称扩增的引物，如下：Cδ-FAM：5’-FAM-GTTTATGGCAGCTCTTTGAAGGT-3’。
5.根据权利要求1～4任一项所述TCRγδT细胞亚家族在制备用于预测AML疗效及预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于分离外周血单个核细胞的试剂、用于获得γδT细胞的试剂、用于抽提RNA的试剂和用于逆转录的试剂中的一种或至少两种。
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