CN106367482A - 插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用 - Google Patents
插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106367482A CN106367482A CN201610739654.5A CN201610739654A CN106367482A CN 106367482 A CN106367482 A CN 106367482A CN 201610739654 A CN201610739654 A CN 201610739654A CN 106367482 A CN106367482 A CN 106367482A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- test kit
- gene
- cardiac death
- detecting
- detecting sudden
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 title abstract description 19
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 28
- 206010049993 Cardiac death Diseases 0.000 claims description 17
- 206010011906 Death Diseases 0.000 claims description 17
- 108010012219 Ryanodine Receptor Calcium Release Channel Proteins 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 33
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 abstract 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 3
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical group [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000019027 Ryanodine Receptor Calcium Release Channel Human genes 0.000 description 1
- 102000001424 Ryanodine receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010049418 Sudden Cardiac Death Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 108091052345 ryanodine receptor (TC 1.A.3.1) family Proteins 0.000 description 1
- 210000001908 sarcoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死中的应用,本发明还公开了一种用于检测不明原因猝死的试剂盒,包括用于检测雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点的特异性引物对,所述特异性引物对为:有义引物:5’‑GCATGTTTATTATGCAAGTT‑3’;反义引物:5’‑ATACAATTAAGCCCACGA‑3’;或有义引物序列:5’‑CATTCATTGCATGTTTATTATG‑3’;反义引物序列:5’‑CATTATTTCACAGCACCCG‑3’;或有义引物序列:5’‑TAAATGAACAAAGAAAACCTTC‑3’;反义引物序列:5’‑CTCGGTCACAGTAGGTGG‑3’;本发明的试剂盒通过检测分析个体的雷诺定受体2基因上的rs10692285位点基因携带型来预测该个体对不明原因猝死的易感性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种插入/缺失多态性位点在不明原因猝死检测试剂盒中的应用。
背景技术
猝死是由于机体潜在的疾病或重要器官急性功能障碍导致的意外的突然死亡,在所有自然死亡的人数中猝死约占10%或更多。根据我国疾病猝死资料分析,因心血管疾病引起的猝死大约占50%~60%,居猝死发生率之首,可见心源性猝死的危害之大。此外,尚有一部分猝死病例经过系统尸检及相关的实验室检验均未能发现致死性的病理改变及其他死因,这类猝死通常被归类为不明原因猝死(Sudden unexplained death,SUD),对于具有这类猝死风险患者的筛选诊断及死因的法医学鉴定已成为一个亟待解决的难题。近年来的科学研究发现此类SUD有很大一部分与离子通道病相关,有证据表明在心脏正常电生理活动中起重要作用的离子通道功能或表达量异常均可诱发心律失常,从而导致此类猝死的发生。
目前针对SUD诊断领域的研究主要集中于对重要蛋白编码基因的编码区突变与猝死的关联性分析,然而有报道的猝死相关基因与位于这些基因上的错义突变数量毕竟有限,并且与之在普通群体中较低的基因频率相比,高之许多的猝死发生率难以完全得到解释。与此同时,全基因组关联研究之类的大数据分析也是猝死研究的热点,尽管一系列研究已经揭示了许多位于编码基因上或毗邻区域的普通多态性也可通过诱发心律失常而产生猝死风险,但这类研究所得到的结果在来自不同样本群体的研究比较中未能得到一个较为统一又具有说服力的结果,并且其结论目前尚未在功能试验中得到验证。
雷诺定受体2(Ryanodine receptor type 2,RYR2)是心肌细胞肌浆网上主要的钙释放通道,主要参与心肌的兴奋收缩耦联过程。研究表明其蛋白功能或表达量异常均可诱导一系列致死性心律失常,因此,其编码基因RYR2基因上的基因突变被认为与SUD的发生存在一定关系。
rs10692285为RYR2基因上的一个插入/缺失多态性位点。现有技术中,并没有对rs10692285插入/缺失多态与SUD相关性的研究报道,也没有通过检测RYR2基因3'UTR的插入/缺失多态位点来预测SUD的易感性的相关报道。
鉴于上述原因,本发明人积极加以研究创新,以期创建一种新型插入/缺失多态性位点在不明原因猝死检测试剂盒中的应用,使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种插入/缺失多态性位点在不明原因猝死检测试剂盒中的应用,通过检测个体的RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型,可以起到预测个体SUD的易感性的作用。
本发明的公开了一种雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死中的应用。
本发明还公开了一种用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:包括用于检测雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点的特异性引物对,特异性引物对为能够特异性扩增出包含rs10692285号插入/缺失多态性位点的DNA片段的上下游核苷酸序列,特异性引物对包括:
有义引物:5’-GCATGTTTATTATGCAAGTT-3’
反义引物:5’-ATACAATTAAGCCCACGA-3’;
或
有义引物序列:5’-CATTCATTGCATGTTTATTATG-3’;
反义引物序列:5’-CATTATTTCACAGCACCCG-3’;
或
有义引物序列:5’-TAAATGAACAAAGAAAACCTTC-3’;
反义引物序列:5’-CTCGGTCACAGTAGGTGG-3’。
进一步的,特异性引物对为能够特异性扩增出包含rs10692285号插入/缺失多态性位点的DNA片段的上下游核苷酸序列。
进一步的,特异性引物对用异硫氰酸荧光素或羧基荧光素标记。
进一步的,特异性引物对的浓度为0.2~1.0μM/μl。
进一步的,试剂盒还包括1U/μL~2.5U/μL耐热DNA聚合酶。
进一步的,耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
进一步的,试剂盒还包括2.5mM~10mM脱氧核糖核苷三磷酸和25mM~50mM镁盐。
进一步的,镁盐为氯化镁或硫酸镁。
进一步的,试剂盒还包括5×PCR或10×PCR反应缓冲液和水。
进一步的,有义引物序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5所示。
进一步的,有义引物的Tm(解链温度)值为50-52℃。
进一步的,反义引物序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示。
进一步的,反义引物的Tm值为50-52℃。
进一步的,荧光标记的特异性引物是针对RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点而设计,能特异性扩增出包含该插入/缺失的片段,通过荧光标记技术将荧光染料标记在寡核苷酸引物的5’端,PCR扩增后产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。
进一步的,试剂盒的保存温度为-20℃~-80℃。
进一步的,使用本发明的试剂盒,通过荧光标记PCR扩增及毛细管电泳分型法检测RYR2的rs10692285号插入/缺失多态性位点基因型,能够通过该检测推断当个体携带插入型等位基因时其罹患SUD的风险将显著增高。
本发明的原理为:发明人通过分子生物学研究发现RYR2基因的3'UTR中的一个插入/缺失多态rs10692285的不同等位基因型可影响RYR2基因转录活性,携带插入型等位基因的个体RYR2蛋白的表达相对较高;此外,通过一定规模人群的SUD病例对照研究发现,该插入/缺失多态的插入型等位基因与SUD发生呈正相关,即使在调整年龄、性别等因素后,这种相关性仍然存在,说明RYR2基因的3'UTR中的一个四碱基(AAAC)插入/缺失多态(rs10692285)与患SUD风险性存在显著性关联,因此RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型可用于评估个体患SUD的易感性。
借由上述方案,本发明具有以下优点:
公开了RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型在评估个体患SUD的易感性中的应用;公开了用于检测不明原因猝死的试剂盒:由于本发明的试剂盒中包含的特异性引物对是针对RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点而设计,能特异性扩增出包含该位点的DNA片段并通过检测不同长度片段在毛细管电泳中的迁移率来识别不同基因型,结合病例对照研究发现,被检测DNA的RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点携带有插入型等位基因者为SUD易感型;使用本发明的试剂盒,通过检测个体的RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型,本发明的试剂盒可以用于预测个体SUD的易感性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下为本发明的实施例,并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明对照组与SUD病例组在rs10692285位点的基因频率差异与患病风险OR值;
图2是基因测序图示和SDS-PAGE凝胶电泳分型图示。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
试剂盒包括:荧光标记的用于检测RYR2的rs10692285位点的特异性引物对及普通PCR扩增和毛细管电泳的常规组件。其中,特异性引物对包括有义引物序列和反义引物序列,具体如下所示:
有义引物序列:5’-GCATGTTTATTATGCAAGTT-3’,Tm值为50℃;
反义引物序列:5’-ATACAATTAAGCCCACGA-3’,Tm值为51℃。
普通PCR扩增和毛细管电泳的常规组件包括:2.5U/μL的Taq DNA聚合酶、2.5mM的dNTP、25mM的MgCl2溶液、10×PCR反应缓冲液和去离子水。
本发明的试剂盒的使用步骤如下:
步骤1:DNA模板的抽取
使用血液基因组DNA提取系统提取外周血的基因组DNA,本实施例以QIAamp DNAMini Kit提取血液样本DNA试剂盒,其操作步骤如下:
1、于1.5mL离心管底部加入20μL QIAGEN Protease,然后加入200μL血浆,再加入200μL Buffer AL,振荡15s,56℃下水浴反应10min,DNA产量在此过程中达到最大值,离心,以去除离心管盖内沿液体。
2、向离心管中加入200μL乙醇(96%-100%),振荡15s,离心,以去除离心管盖内沿液体,得到混合液。
3、将以上所得混合液加入QIAamp Mini spin column中,将离心柱放入2mL收集管中,盖紧离心管盖,以6000×g(8000rpm)离心1min。然后将离心管取出,放入一支洁净的2mL收集管中。
4、向QIAamp Mini spin column中加入500μL Buffer AW1。盖紧离心管盖,以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出,放入一支洁净的2mL收集管中。
5、向QIAamp Mini spin column中加入500μL Buffer AW2,盖紧离心管盖,以20000×g(14000rpm)离心3min。
6、将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5mL收集管中,在QIAamp Minispin column中加入200μL Buffer AE或蒸馏水,室温下(15-25℃)静置1min,6000×g(8000rpm)离心1min,将收集管盖好,保存于-20℃。
步骤2:PCR反应-目的片段的复制
使用本发明的试剂盒进行PCR反应,其中试剂盒中的引物对可特异性地扩增RYR2基因中包含rs10692285号插入/缺失位点多态性的片段。
PCR反应体系总体积为10uL,其中包括:1uL DNA模板;50μM特异性引物对两条,各0.04μl,特异性引物对用异硫氰酸荧光素标记;2.5U/uL的Taq DNA聚合酶0.08μl;2.5mMdNTP 0.2uL;25mM MgCl2溶液0.6uL;10×PCR反应缓冲液1uL;余量为去离子水。在Eppendorf Mastercycler nexus PCR扩增仪上进行反应,反应条件是:94℃3min;再进行30个PCR循环:94℃30s,52℃30s,72℃1min;最后72℃5min。
步骤3:RYR2基因插入/缺失基因型分析
采用ABI 3500基因测序仪对PCR扩增的产物进行毛细管电泳分离,分析检测个体的RYR2的rs10692285位点的基因型。
图1为对照组与SUD病例组在该位点的基因频率差异与患病风险OR值,从图中可以看出rs10692285与患SUD风险性存在显著性关联,携带插入型等位基因的个体患SUD的风险显著升高(OR值=2.03;95%置信区间=1.08-3.77;P值=0.0161),说明对于该位点的基因型分析有助于为SUD的诊断和防治提供分子遗传学方面的支持和帮助,具体来说,即本发明的雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点能够用于检测不明原因猝死。
图2为基因测序和SDS-PAGE凝胶电泳分型图示。其中图2A为模板链测序结果,下划线处对应编码链在rs10692285处的四碱基插入/缺失;图2B为对14个来自不同个体的DNA样本使用本发明的PCR扩增体系得到的产物电泳示意图,其中,1、3、7、11、14为缺失型纯合子,8为插入型纯合子,其余为杂合子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死中的应用。
2.一种用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:包括用于检测雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点的特异性引物对,所述特异性引物对包括:
有义引物:5’-GCATGTTTATTATGCAAGTT-3’;
反义引物:5’-ATACAATTAAGCCCACGA-3’;
或
有义引物序列:5’-CATTCATTGCATGTTTATTATG-3’;
反义引物序列:5’-CATTATTTCACAGCACCCG-3’;
或
有义引物序列:5’-TAAATGAACAAAGAAAACCTTC-3’;
反义引物序列:5’-CTCGGTCACAGTAGGTGG-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述特异性引物对用异硫氰酸荧光素或羧基荧光素标记。
4.根据权利要求2所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述特异性引物对的浓度为0.2~1.0μM/μl。
5.根据权利要求2所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括1U/μL~2.5U/μL耐热DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
7.根据权利要求2所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括2.5mM~10mM脱氧核糖核苷三磷酸和25mM~50mM镁盐。
8.根据权利要求7所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述镁盐为氯化镁或硫酸镁。
9.根据权利要求2所述的用于检测不明原因猝死的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括5×PCR或10×PCR反应缓冲液和水。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610739654.5A CN106367482B (zh) | 2016-08-26 | 2016-08-26 | 插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610739654.5A CN106367482B (zh) | 2016-08-26 | 2016-08-26 | 插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106367482A true CN106367482A (zh) | 2017-02-01 |
CN106367482B CN106367482B (zh) | 2019-08-06 |
Family
ID=57904374
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610739654.5A Active CN106367482B (zh) | 2016-08-26 | 2016-08-26 | 插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106367482B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112029853A (zh) * | 2020-10-12 | 2020-12-04 | 苏州大学 | 基于hspa1b基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
CN112063711A (zh) * | 2020-10-12 | 2020-12-11 | 苏州大学 | 基于stim1基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
CN112159841A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-01 | 苏州大学 | 基于cox10基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107858423B (zh) * | 2017-12-22 | 2020-06-30 | 苏州大学 | 用于预测心源性猝死易感性的试剂盒 |
-
2016
- 2016-08-26 CN CN201610739654.5A patent/CN106367482B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DBSNP数据库: "rs10692285", 《NCBI》 * |
HUANG LEI等: "Postmortem genetic screening of SNPs in RyR2 gene in sudden unexplained nocturnal death syndrome in the southern Chinese Han population", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL》 * |
王云云: "RYR2基因G1885E,G1886S位点多态性与不明原因心脏性猝死的相关性探索", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
郝禄贵等: "RYR2基因与心脏性猝死的相关性研究", 《解剖学研究》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112159841A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-01 | 苏州大学 | 基于cox10基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
CN112159841B (zh) * | 2020-10-10 | 2022-03-01 | 苏州大学 | 基于cox10基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
WO2022073259A1 (zh) * | 2020-10-10 | 2022-04-14 | 苏州大学 | 基于cox10基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
CN112029853A (zh) * | 2020-10-12 | 2020-12-04 | 苏州大学 | 基于hspa1b基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
CN112063711A (zh) * | 2020-10-12 | 2020-12-11 | 苏州大学 | 基于stim1基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
CN112029853B (zh) * | 2020-10-12 | 2022-03-01 | 苏州大学 | 基于hspa1b基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
WO2022077540A1 (zh) * | 2020-10-12 | 2022-04-21 | 苏州大学 | 基于stim1基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106367482B (zh) | 2019-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106367482B (zh) | 插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用 | |
JP2012120542A (ja) | ウルトラディープ配列決定を用いて配列変異体を決定するための方法 | |
JP2007529218A5 (zh) | ||
CN107858423B (zh) | 用于预测心源性猝死易感性的试剂盒 | |
US9637788B2 (en) | Discrimination of blood type variants | |
ES2445709T3 (es) | Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W) | |
CN112111572B (zh) | 基于stat5a基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 | |
CN111549137B (zh) | 胃癌辅助诊断相关的遗传分子标志物及其应用 | |
JP6233022B2 (ja) | Hla−a*24グループの判定方法 | |
CN112029853B (zh) | 基于hspa1b基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 | |
CN109897895A (zh) | 一种TaqMan-MGB探针技术检测影响降压药物疗效基因的方法学建立 | |
CN108342404A (zh) | Inpp5e基因突变体及其应用 | |
CN113637738B (zh) | 与冠心病相关的snp位点及其应用 | |
CN107164550A (zh) | 一种检测心肌梗死的试剂及其应用 | |
CN112159841B (zh) | 基于cox10基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 | |
WO2022077540A1 (zh) | 基于stim1基因插入缺失多态性位点的心源性猝死易感性检测试剂盒 | |
CN103160576B (zh) | 基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法 | |
KR101216378B1 (ko) | 2 종의 단일염기다형의 유전자형 또는 반수체형 분석을 포함한 조기페경의 진단방법 | |
CN104561346B (zh) | 用于检测scz相关基因多态性的引物及试剂盒 | |
JP5071998B2 (ja) | 本態性高血圧症の判定方法 | |
CN105506165A (zh) | 基于AllGlo探针的rs2844682检测分型试剂盒及其分型方法 | |
KR20220113305A (ko) | 단일염기다형성을 이용한 안지오텐신 전환효소억제제 이상반응 진단용 조성물 및 이를 이용한 방법 | |
CN104372004A (zh) | 一个与心肌梗死易感相关的miR-27a基因单核苷酸多态位点的检测方法及其应用 | |
CN110195105A (zh) | 一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒 | |
KR20220028329A (ko) | 심혈관계 질환에 대한 정보 제공 방법 및 이를 이용한 키트 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |