CN106367399A - 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法 - Google Patents
一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106367399A CN106367399A CN201610761975.5A CN201610761975A CN106367399A CN 106367399 A CN106367399 A CN 106367399A CN 201610761975 A CN201610761975 A CN 201610761975A CN 106367399 A CN106367399 A CN 106367399A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- suspension
- bioreactor
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14061—Methods of inactivation or attenuation
Abstract
本发明涉及一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法。本发明涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺,其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪细小病毒病病毒的大规模培养,具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势,为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)属于细小病毒科细小病毒属,是引起母猪繁殖障碍的最重要病原之一。该病原主要感染母猪,特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪,能导致仔猪死产、木乃伊胎、早期胚胎死亡和不育,而母猪本身并不表现除流产之外的临床症状,其他猪感染后也无明显的临床症状。PPV主要通过病猪和带毒猪消化道和呼吸道传播,还可垂直传播,给养猪业造成严重的经济损失。目前,在我国,PPV感染十分严重,抗体阳性率达90%以上。由于猪细小病毒的血清型单一,并具有较高的免疫原性,从而使疫苗接种成为防控猪细小病毒最有效的方法。
ST细胞,即猪睾丸细胞,属于成纤维细胞,体外可连续传代贴壁培养,该细胞系对多种病毒敏感,如:猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等,是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一。ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节,直接影响到疫苗的质量,如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。
转瓶培养ST细胞技术是目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍的细胞培养方法,优势是工艺简单、成本低廉,然而生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决。(陈文庆,王建超,刘华杰等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志,2010,44(10):37-41)。
基于转瓶培养的弊端,悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数,具有培养病毒含量高,无须混合,批间差异小,培养方式自动化,无须大量生产人员,培养需求面积小、污染小、成本低等优点,是疫苗制备中首选的细胞培养技术。
目前悬浮培养应用主要是微载体悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面,率先应用于口蹄疫疫苗的生产,之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应,疫苗生产企业越来越关注新工艺。
我公司尝试了ST细胞全悬浮生产猪细小病毒病灭活疫苗的工艺。该工艺是将猪细小病毒SJ-1毒株接种全悬浮培养的ST细胞,收获细胞培养物,经灭活后,加入油佐剂配成双相(W/O/W)油乳剂灭活疫苗。其关键技术在于细胞驯化,ST细胞全悬浮驯化成功后,可用于猪细小病毒的培养。较其它微载体悬浮培养系统,该系统具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势,为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
发明内容
本发明的目的是提供一种ST细胞全悬浮生产猪细小病毒病疫苗的工艺,从而降低生产成本,进行规模化、均一性生产,以应对目前国内猪细小病毒病流行形势。
本发明的技术方案
1.一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序,即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养,当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液,在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液,经灭活后,加入油佐剂配成双相(W/O/W)油乳剂灭活疫苗。
2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述更换培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时,将细胞培养液的1/3换成新的培养液,并接种猪细小病毒。
3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述方法具体为:
(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h~72h后离心,用细胞培养液将经离心的细胞再悬浮后以密度3×105~3×106/ml接入生物反应器,进行ST细胞全悬浮培养;
(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml~6×106/ml,生物反应器15℃沉降2小时,泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液,并接种0.1%~0.5%(V/V)的猪细小病毒种毒。
(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞,待50%左右的细胞出现典型CPE时,收获病毒液,经灭活后,加入油佐剂配成双相(W/O/W)油乳剂灭活疫苗。
4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述的病毒为猪细小病毒(Porcine parvovirus)SJ-1株,该株病毒已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为此CGMCC No.12662。
5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述ST细胞株的建立,是由猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养基的悬浮驯化过程而获得,该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(SwineTestis)悬浮适应株(简称ST-1株),该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为此CGMCC No.12698。
以上本发明所述的细胞培养液系指低血清细胞培养液,其血清含量(V/V)为:0.5%~2%。
使用的细胞生物反应器为APPLIKON公司30L~2000L细胞生物反应器。
本发明公开的ST细胞全悬浮培养猪细小病毒病疫苗的工艺,其操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体,可以在低血清培养基中悬浮培养,为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
具体实施方式
一、全悬浮培养的ST细胞株的建立驯化过程
1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(降低血清)
从液氮罐中取ST贴壁细胞种子(ST细胞,CVCCNo.CL27,购自中国兽医药品监察所,中国微生物菌种保藏管理中心),在T75培养瓶中加入10%新生牛血清的细胞生长液,进行ST细胞复苏,并贴壁培养,使用逐步降低血清的贴壁培养基进行传代培养驯化。血清含量从10%、8%、5%、3%、2%、1%降至0.5%。
2.ST细胞(低血清培养基)的悬浮驯化
将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获,并冻存,记为ST-1F0。
ST细胞驯化过程可以看出,该细胞在贴壁阶段血清含量由10%降至低血清水平(0.5%~2%),细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮,通过39代的驯化培养,细胞才能适应悬浮培养状态,并能稳定增值到1.2×106/ml,细胞活力达到90%以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化,确定了pH7.0±0.1、转速120r/min,实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养,并对生物反应器中的溶氧量进行了改进,从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程,并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系(Swine Testis cell line)悬浮适应株,简称ST-1株,该株细胞已于2016年8月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC No.12698。(详见实施例1)
二、全悬浮细胞的制备
1.细胞摇瓶扩大培养:细胞复苏后以5×105/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中,以120r/min转速于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至1.2×106/ml时,进行传代,按照比例补加新鲜培养基,使细胞初始密度为5×105/ml。
2.细胞接种:细胞接种前矫正溶氧电极,通CO2调整pH至7.0±0.1,取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后,用200ml(200ml/1000ml)培养基回悬后接入生物反应器。培养72h,传代。
三、疫苗制备
1.生产用种毒:本发明涉及到的猪细小病毒灭活疫苗的生产用种毒为猪细小病毒株SJ-1株,系本申请人自行由菏泽某猪场采集病死猪脑和扁桃体组织病料中分离、鉴定而获得,该毒株已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.12662。
2.接毒:待ST细胞全悬浮培养至密度约6×105/ml~6×106/ml,生物反应器15℃沉降2小时,泵出上层1/3原培养液,注入等量新的细胞培养液,同时接入0.2%猪细小病毒SJ-1株种毒液。
3.收获病毒液灭活配苗:在生物反应器中继续进行接毒细胞悬浮培养,待50%左右的细胞出现典型CPE时,收获病毒液,经灭活后,加入油佐剂配成双相(W/O/W)油乳剂灭活疫苗。
四、猪细小病毒病疫苗的检验
1.性状
外观本品为乳白色乳状液,静置后,下层略带淡红色乳液。
剂型为水包油包水型,用吸管取少量疫苗于冷水中,第1滴呈云雾状扩散,其余不扩散。
粘度用1ml吸管吸取乳剂苗1ml,垂直放出0.4ml所需的时间应在2秒以内。
稳定性将疫苗置试管内,3000r/min离心15min,有分层。置室温1周逐渐分为二层乳状液,在4~10℃保存不破乳。
2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
3.安全检验制成的灭活苗应接种猪细小病毒HI阴性健康猪2头,接种量每头10ml,接种猪应均无不良临床反应,无病毒血症,应有抗体反应。每批还应皮下注射2~4日龄乳鼠一窝(至少5只),观察7天应健活,如有死亡,可重检一次。发现不安全,该批疫苗应全部废弃。
4.效力检验每批疫苗应抽样一瓶,肌肉注射体重350g以上HI阴性豚鼠4只,每只0.5ml,注射后4周应有3只豚鼠出现抗体反应。HI价应≥64,同时设同批不免疫对照豚鼠2只,在试验过程中分笼饲养,平行测定HI价应始终保持阴性,如达不到规定要求可复检一次。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明涉及到的猪细小病毒(Porcine parvovirus)SJ-1株,系本申请人自行由菏泽某猪场采集病死猪脑和扁桃体组织病料中分离、鉴定而获得,该毒株已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.12662。猪睾丸传代细胞ST株,保藏编号为CVCC,No.CL27,(中国微生物菌种保藏管理中心编著《中国兽医菌种目录》(第二版),中国农业出版社,2002,p171),购自中国兽医药品监察所。猪睾丸细胞系(Swine Testis)悬浮适应株,简称ST-1株,该细胞株已于2016年8月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.12698。
本发明的积极意义
本发明一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法。本发明涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺,其关键技术在ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪细小病毒的大规模培养,具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势,为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
实施例
以下是本发明具体的实施方案,以进一步阐述本发明,但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
——全悬浮培养的ST细胞株的建立
1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(低血清驯化过程):
从液氮罐中取ST贴壁细胞种子,在T75培养瓶中加入10%MEM细胞生长液,进行细胞复苏培养,接种比例为1:1,24h后换液。待细胞长成致密单层且生长状态良好时,0.05%胰酶消化2遍,用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液,按照1:3的比例传代,进行ST细胞贴壁培养,并向下继续传代至F3。用0.05%胰酶消化液将细胞进行分离,500~1000r/min离心,使用低血清贴壁培养基重新混合均匀,以3×105~5×105个/ml进行传代培养驯化。血清含量从10%、8%、5%、3%、2%、1%降至0.5%,每个血清含量细胞状态稳定后继续传代三代,然后转到下一个血清含量。观察细胞的生长情况。见表1。
经过缓慢(37代)的细胞驯化传代培养,试验结果显示用10%~5%血清含量的培养基培养细胞,48h左右即可长成致密细胞单层;从3%降至0.5%血清含量的培养基培养细胞,传第1代时,有少许死细胞,但不影响细胞贴壁和生长,传3到5代后可按照常规方法进行分瓶传代,驯化稳定后,72h左右长成致密细胞且细胞状态良好。考虑到生产成本问题,将细胞生长液的血清含量定为0.5%~2%。
表1 ST细胞贴壁培养低血清驯化试验结果
血清含量 | 接种密度 | 贴壁情况 | 生长状况 | 数量 | 活力 |
10% | 3.2×105 | ++++ | ++++ | 3.4×106 | 98% |
8% | 2.7×105 | ++++ | ++++ | 3.5×106 | 99% |
5% | 2.9×105 | +++ | ++++ | 3.0×106 | 96% |
3% | 3.0×105 | +++ | ++++ | 3.1×106 | 97% |
2% | 2.8×105 | +++ | ++++ | 2.9×106 | 97% |
1% | 3.1×105 | +++ | ++++ | 2.8×106 | 96% |
0.5% | 3.1×105 | +++ | ++++ | 3.0×106 | 98% |
2.ST细胞(含0.5%~2%新生牛血清的低血清细胞培养液)的悬浮驯化
(1)不同代次细胞悬浮培养的驯化
将驯化好的低血清培养基(0.5%~2%新生牛血清的MEM)培养的长成致密单层的ST贴壁细胞稳定传代3代后,记为ST F0。
1)待驯化好的低血清培养基培养ST贴壁细胞(F5)生长成致密细胞单层时,0.05%胰酶消化,用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液,以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中,用低血清培养液补足至40ml,以120r/min转速于37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2%新生牛血清的MEM),并依此方法连续培养传代,直至50代,培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。
2)待驯化好的低血清培养基培养ST贴壁细胞(F8)生长成致密细胞单层时,0.05%胰酶消化,用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液,以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中,用低血清培养液补足至40ml,以120r/min转速于37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2%新生牛血清的MEM),并依此方法连续培养传代,直至50代,培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。
3)待驯化好的低血清培养基培养ST贴壁细胞(F11)生长成致密细胞单层时,0.05%胰酶消化,用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液,以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中,用低血清培养液补足至40ml,以120r/min转速于37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(低血清培养基),并依此方法连续培养传代,直至50代,培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。
试验结果:从“2)”F8开始将贴壁细胞驯化为悬浮细胞,刚开始细胞死亡数较多,经过不断地离心换液传代,“2)”传至F39时,全悬浮培养72h,细胞密度达到2.26×106/ml,细胞活力达到94%。1)和3)均未驯化成功。将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获,并冻存,记为ST-1F0。
(2)培养液pH对悬浮培养细胞的影响
在其他培养条件一致的条件下,将MEM培养液的pH分别设置为6.8±0.1、7.0±0.1、7.2±0.1和7.4±0.1,37℃培养72h后,取样计数并观察细胞形态。
当ST细胞培养液pH为7.0±0.1时,培养液的pH下降较快,细胞生长快,细胞密度比同期其他试验组高,细胞活性也较好。当pH在6.8±0.1或7.4±0.1时,培养48h后细胞生长缓慢,细胞密度显著低于其他试验组。所以ST细胞培养液理想pH为7.0±0.1。
(3)转速对悬浮培养细胞的影响
培养条件同“(2)”,以不同转速进行悬浮培养,第1种:80r/min,第2种:120r/min,均在37℃培养72h后,取样计数并观察细胞形态。
80r/min转速培养ST细胞,细胞聚团严重,细胞贴覆在罐壁和罐底的情况较多,而采用120r/min转速更有利于ST细胞的生长。
3.悬浮培养ST-1细胞在生物反应器中放大
细胞接种前一天,生物反应器中打入800ml(800ml/1000ml)培养基(含2%血清),通饱和空气过夜。用常规方法从液氮中复苏驯化好的2%MEM ST-1悬浮细胞,经500~1000r/min进行离心,将细胞加入到250ml三角瓶内,加入0.5%~2%MEM悬浮培养液,将细胞密度调整为5×105/ml,置于37℃,120rpm在摇床内进行培养。细胞生长到1.2×106/ml以上即可进行传代培养,以此方法进行放大培养。待细胞培养体积达到200ml时,可以将悬浮细胞转至3L生物反应器中进行培养。依此将细胞转入10L、30L生物反应器中,摸索细胞生长的最佳条件。将pH分别设定为7.0±0.1,溶氧量设定为40%、80%,观察在两种情况下低血清悬浮细胞ST-1在生物反应器中的增殖情况。溶氧量为40%与80%时,最高细胞密度均大于2.0×106/ml,且活力均能达到90%以上,二者相差不大。因此,选择40%溶氧量作为ST细胞悬浮培养通气量。试验结果见表2。
表2 ST-1株细胞在各反应器中生长试验结果
从ST细胞驯化过程可以看出,该细胞在贴壁阶段血清含量由10%降至低血清水平(0.5%~2%),细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮,通过39代的驯化培养,细胞才能适应悬浮培养状态,并能稳定增值到1.2×106/ml,细胞活力达到90%以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化,确定了pH7.0±0.1、转速120r/min,实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养,并对生物反应器中的溶氧量进行了改进,从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程,并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系悬浮适应株(简称ST-1株),该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为此CGMCC No.12698。
实施例2
——适应全悬浮培养的ST细胞株的扩增培养
将液氮保存的猪睾丸细胞悬浮适应株ST-1复苏传代培养,后接种到生物反应器中进行全悬浮放大培养,得到ST-1细胞悬浮培养液。具体步骤如下:
1.取液氮冻存的ST-1细胞株,快速复苏后加入装有培养液的摇瓶中,于36~37℃培养60~72h,按照1:3~1:5的比例传代放大培养;
2.细胞接种前一天,生物反应器中打入800ml(800ml/1000ml)培养基(含2%血清),通饱和空气过夜。
3.细胞接种:细胞接种前矫正溶氧电极,通CO2调整pH至7.0±0.1,培养温度为36~37℃,取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后,用200ml(200ml/1000ml)培养基回悬后接入生物反应器中进行悬浮培养。
实施例3
——ST全悬浮生产猪细小病毒病疫苗的工艺
1.生产用毒种制备:取0.1%~0.5%PPV SJ-1(CGMCC No.12662)毒株接种生长良好的ST-1细胞培养,置35~37℃继续培养,接种后6天内收获,应有50%以上细胞出现典型CPE时收获。选取HA价≥4096、TCID50≥7.0的病毒液作为生产用种毒,定量分装,注明收获日期、毒种代数等,冷冻保存。
2.制苗用毒液的繁殖
(1)细胞生物反应器清洗、灭菌:将细胞生物反应器清洗干净,121℃灭菌30min。
(2)细胞接种:在摇瓶中悬浮培养扩增ST-1细胞,达到一定密度1.2×106/ml后,接种入生物反应器,细胞培养条件为:反应器工作体积30升,细胞接种前矫正溶氧电极,通CO2调整pH至7.0±0.2,培养温度为35~37℃,溶氧量为40%,取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后,用200ml(200ml/1000ml)培养基回悬后接入生物反应器中进行悬浮培养,连续培养2~3日。
(3)接毒及收获:待ST-1细胞全悬浮培养至密度约1.2×106/ml,生物反应器15℃沉降2小时,泵出1/3细胞培养液,注入等量新的细胞培养液并按照细胞培养液终体积的0.1%~0.5%接种猪细小病毒SJ-1株种毒液,病毒培养条件为温度35~37℃,pH值为7.0±0.2,溶氧为40%,接种后6天内收获,应有50%以上细胞出现典型CPE时收获,并冻于-20℃,冻融1~2次后作HA测定,HA价应≥1024。共生产3批病毒液。
3.半成品检验
(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,均无菌生长。
(2)病毒含量每毫升病毒含量均≥107.0TCID50。
4.病毒灭活
(1)在HA价≥1024和毒价≥107.0TCID50的病毒液内加入0.1%乙酰乙烯亚胺(N-Acetyl ethylei mine,简称AEI),充分摇匀,置30~35℃水浴灭活48h,每间隔1小时摇动一次,最后按灭活病毒10%的量加20%硫代硫酸钠溶液中止灭活。
(2)抗原性测定将灭活病毒进行血凝活性测定,HA价均达到1024。
(3)安全性检测将灭活病毒原液接种ST细胞,35~37℃培养,观察14天应无细胞病变,培养液作HA测定无血凝活性,将培养物再接种ST细胞传代第二代,以同法测定仍无细胞病变和血凝活性。
5.疫苗配制
(1)油乳剂按94%白油加6%司本—80和2%硬脂酸铝配制而成。
(2)配苗及分装灭活病毒加20%吐温—80为水相,使用胶体磨按3份油相和7份水相的比例配苗。在慢速搅拌的1份油相中缓慢加入1份水相,再以8000r/min充分乳化,形成油包水乳剂。再将3份油包水乳剂缓慢加入2份水相中,再以8000r/min充分乳化,形成水包油包水(W/O/W)的双相油乳剂苗。再加入1%硫柳汞溶液,使终浓度1/万。定量分装。
实施例4
——猪细小病毒病疫苗成品检验
1.性状
(1)外观本品为乳白色乳状液,静置后,下层略带淡红色乳液。
(2)剂型为水包油包水型,用吸管取少量疫苗于冷水中,第1滴呈云雾状扩散,其余不扩散。
(3)粘度用1ml吸管吸取乳剂苗1ml,垂直放出0.4ml所需的时间均在2秒以内。
(4)稳定性将疫苗置试管内,3000r/min离心15min,有分层。置室温1周逐渐分为二层乳状液,在4~10℃保存不破乳。
2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,均无菌生长。
3.安全检验制成的灭活苗应接种猪细小病毒HI阴性健康猪2头,接种量每头10ml,接种猪应均无不良临床反应,无病毒血症,有抗体反应。每批还皮下注射2~4日龄乳鼠一窝(至少5只),观察7天健活。
4.效力检验每批疫苗应抽样一瓶,肌肉注射体重350g以上HI阴性豚鼠4只,每只0.5ml,注射后4周有3只豚鼠出现抗体反应。HI价应≥64,同时设同批不免疫对照豚鼠2只,在试验过程中分笼饲养,平行测定HI价始终保持阴性。
Claims (5)
1.一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序,即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养,当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液,在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液,经灭活后,加入油佐剂配成双相(W/O/W)油乳剂灭活疫苗。
2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述更换培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时,将细胞培养液的1/3换成新的培养液,并接种猪细小病毒。
3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述方法具体为:
(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48~72h后离心,用细胞培养液将经离心的细胞回悬后接入以密度3×105~3×106/ml接入生物反应器,进行ST细胞全悬浮培养;
(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml~6×106/ml,生物反应器15℃沉降2小时,泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液,并接种0.1%~0.5%(V/V)的猪细小病毒种毒。
(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞,待50%左右的细胞出现典型CPE时,收获病毒液,经灭活后,加入油佐剂配成双相(W/O/W)油乳剂灭活疫苗。
4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述的病毒为猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)SJ-1株,该株病毒已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为此CGMCC No.12662。
5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法,其特征在于所述ST细胞株的建立,是由猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养基的悬浮驯化过程而获得,该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(SwineTestis)悬浮适应株(简称ST-1株),该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为此CGMCC No.12698。
以上本发明所述的细胞培养液系指低血清细胞培养液,其血清含量(V/V)为:0.5%~2%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610761975.5A CN106367399B (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610761975.5A CN106367399B (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106367399A true CN106367399A (zh) | 2017-02-01 |
CN106367399B CN106367399B (zh) | 2019-10-11 |
Family
ID=57901200
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610761975.5A Active CN106367399B (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106367399B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110564698A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-13 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102091329A (zh) * | 2011-01-30 | 2011-06-15 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 猪细小病毒灭活疫苗的制备方法及其产品 |
CN104630159A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-05-20 | 成都天邦生物制品有限公司 | 低血清培养st细胞生产猪瘟c株病毒的方法 |
CN105112352A (zh) * | 2015-07-13 | 2015-12-02 | 郑州爱科生物科技有限公司 | 一株适应全悬浮培养的st细胞及其应用和培养疫苗病毒的方法 |
-
2016
- 2016-08-30 CN CN201610761975.5A patent/CN106367399B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102091329A (zh) * | 2011-01-30 | 2011-06-15 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 猪细小病毒灭活疫苗的制备方法及其产品 |
CN104630159A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-05-20 | 成都天邦生物制品有限公司 | 低血清培养st细胞生产猪瘟c株病毒的方法 |
CN105112352A (zh) * | 2015-07-13 | 2015-12-02 | 郑州爱科生物科技有限公司 | 一株适应全悬浮培养的st细胞及其应用和培养疫苗病毒的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
W.R.TOLBERT: "Cell aggregate suspension culture for large-scale production of biomolecules", 《IN VITRO》 * |
WILLIAM F. MCLIMANS ET AL.: "The submerged culture of mammalian cells:the spinner culture", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110564698A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-13 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法 |
CN110564698B (zh) * | 2019-09-29 | 2021-03-16 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106367399B (zh) | 2019-10-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101947318B (zh) | 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法 | |
CN101979518B (zh) | 一种制备伪狂犬病病毒的方法 | |
CN104258385B (zh) | Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用 | |
CN102091329B (zh) | 猪细小病毒灭活疫苗的制备方法及其产品 | |
CN107312746A (zh) | 一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法 | |
CN110093307A (zh) | 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法 | |
CN102690791A (zh) | 应用生物反应器微载体培养st细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法 | |
CN104946600B (zh) | 一种h9亚型禽流感病毒株 | |
CN111041002A (zh) | 猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法 | |
CN109913404A (zh) | 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法 | |
CN102988972A (zh) | 一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法 | |
CN108421037A (zh) | 一种猪伪狂犬病/猪细小病毒病二联灭活疫苗及其悬浮培养制备方法 | |
CN105274064B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用 | |
CN107823639B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
CN102886043B (zh) | 猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
CN105535958B (zh) | 一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗 | |
CN109207436A (zh) | 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用 | |
CN106367399B (zh) | 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法 | |
CN103285385A (zh) | 一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 | |
CN103495162B (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法 | |
CN106867973A (zh) | 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法 | |
CN106237324A (zh) | 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法 | |
CN105582535A (zh) | 猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品 | |
CN106318899B (zh) | 一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用 | |
CN102600469A (zh) | 一种猪瘟活疫苗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |