CN106367370A - 一种茶树专用解钾菌k2及其菌剂制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种茶树专用解钾菌K2及其菌剂制备方法。发明人从山东茶园土壤中分离得到一株保藏号为GDMCC NO:60052的解钾菌枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO 3所示；利用该菌株制备得到一种茶树解钾菌专用菌剂，可将土壤中难溶性的钾元素转化成为可溶性养分；将本发明中的解钾菌制备成固体菌剂后，每亩茶园沟施2公斤，可起到提高土壤中速效钾的含量，促进茶树的生长发育。

Description

一种茶树专用解钾菌K2及其菌剂制备方法
一、技术领域
本发明涉及一种茶树专用解钾菌k2及其菌剂制备方法，属于生物技术领域，提供了一种从山东茶园土壤中分离的解钾菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis K2)及其菌剂的制备方法。
二、背景技术
解钾菌是一类能分解硅酸盐和铝硅酸盐矿物，释放钾、磷和硅等元素的细菌。自亚历山大罗夫首次从土壤中分离出释放铝硅酸盐矿物中钾元素的硅酸盐细菌后，国内外学者相继进行高效解钾菌株的分离和选育，试图利用其改变土壤中缺乏有效态钾的状况。目前发现的解钾菌主要包括芽胞杆菌、固氮菌、假单胞菌、伯克霍尔德菌和农杆菌等多个菌属的微生物。
三、发明内容
本发明提供了一种茶树专用解钾菌K2及其菌剂制备方法。
发明人首先从山东茶园土壤中分离得到一株解钾菌，根据其形态学、生理生化特性和分子生物特征，将其命名为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60052；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO 3所示；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一种茶树解钾菌K2专用菌剂的制备方法，其制备步骤如下：
(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入所述麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的蒸馏水(蒸馏水pH＝7)，高温灭菌后得到固体复合载体；
(2)菌液种子的制备：首先挑取枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)接种到100mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后OD值＝0.5的培养液和LB液体培养基按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到菌液种子。
(3)将菌液种子按照质量比12％的接种量接种到步骤1)得到的固体复合载体中；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，得到茶树解钾菌专用菌剂。
本发明分离得到的枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)可将土壤中难溶性的钾元素转化成为可溶性养分。将本发明中的解钾菌制备成固体菌剂后，每亩茶园沟施2公斤，可起到提高土壤中速效钾的含量，促进茶树的生长发育。
四、附图说明
(1)图1为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)的菌落形态图
图中菌株菌落为乳白色椭圆形，其表面褶皱，边缘不整齐，不透明，菌落呈凸起状。
(2)图2为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)的个体形态图
图中菌株个体形态为杆状细菌，周生鞭毛，无荚膜。
五、具体实施方式
实施例1、以茶树专用解钾菌的分离、鉴定为例
发明人采集山东茶园土样，放置于无菌袋中低温保存并带回实验室4℃保存。利用解钾菌培养基(酵母膏0.5g，蔗糖10g，(NH4)2SO4 1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO31.0g，钾长石粉1.0g，定容至1000mL，调pH至7.0～7.5)从土壤中筛选目标菌株。以传统的形态学、生理生化特征和PCR为基础的现代技术相结合，对培养的菌株进行分类鉴定，最后筛选得到一株解钾菌。
经过形态学观察(如图1)，发现该解钾菌菌落为乳白色椭圆形，其表面褶皱，边缘不整齐，不透明，菌落呈凸起状。从个体形态来看(如图2)，菌株为杆状细菌，周生鞭毛，无荚膜。
经菌株生理生化特征试验发现，菌株为革兰氏阳性菌，好氧，接触酶、V-P均为阳性，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖作为碳源使用，能水解酪素，液化明胶，能运动。
提取该菌株基因组DNA为模板进行PCR，扩增16S rDNA的序列：引物16S-8F：5ˊ-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3ˊ(SEQ ID NO.1)，和16S-1510-R：5ˊ-AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ(SEQ ID NO.2)。
反应程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性1min；③46℃退火50s；④72℃延伸2min；⑤重复步骤②～④30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止反应。结束后，用1×TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用康为公司的DNA回收试剂盒回收PCR的产物并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段直接由华大基因测序完成。随后在BLAST上进行检索，发现目的片段与Bacillus subtilis strain CE1的16s rRNA的DNA序列(JQ435698)相似度最高，最终确定分离物为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)，将其命名为枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)，并对其进行了生物保藏，其保藏号为GDMCC NO:60052，验证为存活。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2、制备一种茶树解钾菌专用微生物菌剂
(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的蒸馏水(蒸馏水pH＝7)，120℃高温灭菌后得到固体复合载体；
(2)菌液种子的制备：首先挑取枯草芽孢杆菌K2接种到100mL LB液体培养基(胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g)中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后将达到OD值＝0.5的培养液和LB液体培养基按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到菌株液体种子。
(3)将液体种子按照质量比12％的接种量接种到步骤(1)得到的固体复合载体中；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，得到茶树解钾菌专用菌剂。
试验例1、以茶树专用解钾菌剂对解钾作用的影响为例
首先挑取枯草芽孢杆菌K2接种到100mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后吸取40mL OD值＝0.5的解钾菌培养液，注入到1000mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养24小时，得到菌株液体种子。然后将液体种子接种到已高温灭菌的固体复合载体(麦麸：草炭：硅藻土＝70％：20％：10％)中，接种量为12％(质量比)；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用无机磷分解菌菌剂。
处理一：称取1g茶树专用无机磷分解菌菌剂放入灭菌的500mL解钾菌培养基中；处理二：以不加菌剂的解钾菌培养基为对照；将两个处理30℃培养48小时后，采用火焰光度法进行有效钾含量测定。首先将两个处理的菌株培养液进行离心，吸取10mL离心上清液并将其移至50ml容量瓶中，加水定容，采用火焰光度计测定有效钾的含量。
测定结果：处理一中有效钾浓度为6.74mg/mL，处理二中有效钾浓度为2.13mg/mL，处理一有效钾浓度是处理二中的3.16倍。可见加入茶树专用解钾菌剂后能够提高有效钾的浓度。
试验例2、以茶树专用解钾菌剂对茶园土壤钾含量的影响为例
采用小区实验方式，设置3个处理，分别为本发明制备的茶树专用解钾菌剂+普通有机肥(处理一)、普通有机肥(处理二)、不施肥(处理三)。每个处理设2个小区，每个小区面积为60m2。施用菌剂量均为2公斤/亩，普通有机肥均为400公斤/亩。施肥方法采用常规的开沟方式(开沟深度为20cm左右)。各小区水分管理、病虫害防治等均相同。
测定结果：处理一小区茶园土壤速效钾含量为225.2mg/kg，缓效钾含量为576.8mg/kg；处理二小区茶园土壤速效钾含量为221mg/kg，缓效钾含量为512.4mg/kg；处理三小区茶园土壤速效钾含量为213.7mg/kg，缓效钾含量为478.8mg/kg。处理一速效钾、缓效钾含量比处理二分别增加2％、13％，比处理三分别增加10％、20％，结果证明在茶园中施用本发明得到的茶树专用解钾菌剂可提高土壤钾素肥力。
试验例3、以茶树专用解钾菌剂对茶树产量的影响为例
采用小区实验方式，设置3个处理，分别为本发明制备的茶树专用解钾菌剂+普通有机肥(处理一)、普通有机肥(处理二)、不施肥(处理三)。每个处理设2个小区，每个小区面积为60m2。施用菌剂量均为2公斤/亩，普通有机肥均为400公斤/亩。施肥方法采用常规的开沟方式(开沟深度为20cm左右)。各小区水分管理、病虫害防治等均相同。
测定结果：处理一小区茶树百芽重为80.78g；处理二小区茶树百芽重为78.08g；处理三小区茶树百芽重为75.34g。处理一百芽重比处理二增加3％，比处理三增加7％。结果证明本发明得到的茶树专用解钾菌剂具有良好的增产作用。

Claims (3)

1.保藏号为GDMCC NO:60052的一株解钾菌枯草芽孢杆菌K2(Bacillus subtilis K2)；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.3所示。
2.利用权利要求1所述的一株解钾菌枯草芽孢杆菌K2制备的茶树解钾菌K2专用菌剂在提高土壤中速效钾含量的应用。
3.如权利要求2所述的一种茶树解钾菌K2专用菌剂的制备方法，其制备步骤如下：
(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入所述麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的pH＝7的蒸馏水，高温灭菌后得到固体复合载体；
(2)菌液种子的制备：首先挑取枯草芽孢杆菌K2接种到100mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5；然后OD值＝0.5的培养液和LB液体培养基按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到菌液种子；
(3)将菌液种子按照质量比12％的接种量接种到步骤1)得到的固体复合载体中；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×1010cfu/g；将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，得到茶树解钾菌专用菌剂。
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