CN106362210A - 一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法 - Google Patents

一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料领域，具体是一种人工介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法。本发明通过多巴胺的自聚反应对PET人工韧带进行表明改性，然后将MBG均匀地束缚在韧带表面实现涂层效果，从而提高人工韧带的生物相容性和生物活性；把具有良好骨诱导能力的MBG涂层到PET人工韧带表面，改进了人工韧带的生物相容性和生物活性，使得人工韧带和宿主骨之间的结合更加紧密；本发明的涂层均匀、牢固，工艺简单，操作便捷，对环境污染小。

Description

一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料领域，涉及一种人工韧带制备方法，具体来说是一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法。
背景技术
前交叉韧带损伤(ACL)是临床上常见的运动损伤之一，目前针对ACL的修复与重建问题，多项研究表明聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带在中短期的疗效和安全性较为满意，但其仍然存在腱骨愈合不佳和并发症等问题。这主要是因为PET人工韧带的生物相容性较差，与宿主骨之间存在阻碍愈合的纤维疤痕。因此，如何提高PET人工韧带的相容性和生物活性，是近年来研究者关注的焦点。目前，比较常见的方法是在PET材料表面进行生物活性涂层，如羟基磷灰石(HA)、生物玻璃、丝蛋白等。同时，如何提高涂层的牢固性和均匀性也是急需解决的难点。
多巴胺是一种生物神经递质，在湿润条件下中，它能在氧气的作用下发生氧化-交联反应，形成强力附着于材料表面的薄膜。多巴胺的这种自聚合行为常被用来对材料表面进行改性和功能化处理，从而改善材料表面的亲水性、生物相容性和生物活性等性能。并且在整个改性过程中，反应条件温和，避免了使用有机溶剂对环境造成污染，并且操作步骤简单，反应条件和改性过程易于控制。此外，多巴胺改性过的材料对金属和金属氧化物以及无机非金属纳米粒子有一定的束缚作用，如Au、Ag、TiO2和HA等。但是，多巴胺的这种特性尚未应用到对人工韧带的改性中。
近年来，有大量研究表明Ca-P-Si体系的介孔生物活性玻璃(MBG)具有较大的比表面积和高度有序的介孔结构，并且呈现出优异的生物活性，能够促进成骨细胞的增殖和分化，诱导新骨再生。在骨组织工程领域，MBG常被用来制备骨组织工程支架对缺损部位进行修复的相关研究。因此，MBG可以用来取代HA对PET进行涂层，提高人工韧带的生物活性。
发明内容
为了解决上述现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种工艺简单、涂层牢靠、生物相容性好的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法。本发明中，通过多巴胺的自聚反应对PET人工韧带进行表明改性，然后将MBG均匀地束缚在韧带表面实现涂层效果，从而提高人工韧带的生物相容性和生物活性。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的：
本发明的第一方面，提供一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，包含以下步骤：
步骤一、将人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的人工韧带；
步骤二、人工韧带表面改性：把多巴胺加入到pH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中配成浓度为0.5～5mg/ml的多巴胺溶液，将步骤一得到的预处理的人工韧带加入到多巴胺溶液中，以150～800转/分钟的转速，磁力搅拌6～48小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到多巴胺改性的人工韧带；
步骤三、MBG修饰人工韧带：50～800mg的MBG加入到100ml的去离子水中，超声分散10～60分钟，然后加入步骤二得到的多巴胺改性的人工韧带，以150～800转/分钟的转速，磁力搅拌6～24小时后，用去离子水清洗，37℃干燥12小时得到介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的人工韧带。
优选地，所述人工韧带为对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带。
需明确的是，所述的人工韧带包括但不限于对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带。应理解为，作为介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的基底材料，不限于人工韧带，也可以是其它需要成骨性或生物相容性的移植材料，例如骨、软骨、牙齿等组织修复材料。
优选地，步骤三中MBG的制备方法为溶胶-凝胶法，干凝胶经球磨碾碎后，过400～800目筛子，得到粒径小于37微米的MBG颗粒。(参考文献:Yan XX,Huang XH,Yu CZ,DengHX,Wang Y,Zhang ZD,et al.The in-vitro bioactivity of mesoporous bioactiveglasses.Biomaterials 2006；27:3396-403.)
优选地，所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，包含以下步骤：
步骤一、将PET人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的PET人工韧带；
步骤二、PET人工韧带表面改性：把多巴胺加入到pH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中配成浓度为1～2mg/ml的多巴胺溶液，将步骤一得到的预处理的PET人工韧带加入到多巴胺溶液中，以200～400转/分钟的转速，磁力搅拌24小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到多巴胺改性的PET人工韧带；
步骤三、MBG修饰PET人工韧带：100～200mg的MBG加入到100ml的去离子水中，超声分散15～30分钟，然后加入步骤二得到的多巴胺改性的PET人工韧带，以200转/分钟的转速，磁力搅拌12～24小时后，用去离子水清洗，37℃干燥12小时得到介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的人工韧带。
本发明的第二方面，提供一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带，由以上任一所述的制备方法制备得到。
本发明的第三方面，提供上述介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带在制备组织修复材料中的应用。
与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
1)利用多巴胺的自聚行为对PET人工韧带进行表面改性，改善了人工韧带表面的化学性质，赋予人工韧带附载生物活性颗粒的能力。
2)把具有良好骨诱导能力的MBG涂层到PET人工韧带表面，改进了人工韧带的生物相容性和生物活性，使得人工韧带和宿主骨之间的结合更加紧密。
3)本发明的涂层均匀、牢固，工艺简单，操作便捷，对环境污染小。
附图说明
图1为本发明人工韧带的SEM图。
图2为MC3T3-E1细胞在本发明人工韧带上培养7天后的ALP活性。
图3为本发明人工韧带植入小鼠体内12周后的组织学染色切片图。
图4为实施例3制备得到人工韧带的SEM图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明涉及一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，包含以下步骤：
步骤一、将PET人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的人工韧带。
步骤二、PET人工韧带表面改性。把多巴胺加入到pH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中配成浓度为1mg/ml的多巴胺溶液，将预处理得到的PET人工韧带加入到多巴胺溶液中，以200转/分钟的转速，磁力搅拌24小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到多巴胺改性的PET人工韧带。
步骤三、MBG修饰PET人工韧带。100mg的MBG加入到100ml的去离子水中，超声分散15分钟，然后加入多巴胺改性的PET人工韧带，以200转/分钟的转速磁力搅拌12小时后，用去离子水清洗，37℃干燥12小时得到介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的人工韧带，如图1所示。
步骤三中MBG的制备方法为溶胶-凝胶法，干凝胶经球磨碾碎后，过400目筛子，得到粒径小于37微米的MBG颗粒。
对介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带进行生物学评价结果如下：
图2为MC3T3-E1细胞在本发明人工韧带上培养7天后的ALP活性。老鼠的MC3T3-E1成骨细胞来源于日本Riken细胞库。具体操作步骤如下：
1.细胞准备。细胞接近80％融合后，加入诱导培养基，培养7天后，吸出培养基，加入200μl细胞裂解液，吹打混匀后转移入1.5ml EP管，104g，4℃，离心15min，取上清液加入另一新EP管，待下一步实验。
2.试剂准备。显色底物准备：取显色底物一管，瞬离后，溶于2.5ml ALP反应缓冲液中，充分混合，冰上放置。标准品工作液准备：取20μl p-nitrophenol标准品(10mM)，用ALP反应缓冲液稀释至0.4ml，终浓度为0.5mM。
3.加样。参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量为4、8、16、24、32和40μl，样品加50μl。如果样品中的碱性磷酸酶活性过高，可以稀释后再进行测定。
表1.各组分加样数据表
4.混匀。用摇床进行混匀。
5.孵育：37℃孵育30min。
6.终止：每孔加入100μl反应终止液终止反应。
7.检测：405nm测定吸光度。
8.结果分析。碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的二乙醇胺(diethanolamine,DEA)缓冲液中，37℃下，每分钟水解pNPP显色底物产生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定义为一个酶活力单位。
图3为本发明人工韧带植入小鼠体内12周后的组织学染色切片图。具体操作步骤如下：
在造模第12周时，每组随机取2只兔子，取出股骨，进行脱钙处理，并作HE染色，观察移植物与骨组织的愈合情况。组织切片染色总体步骤：取材→固定→脱钙→冲洗→脱水→包埋→切片→染色→观察拍照
取材：取下兔子股骨，剔除软组织。
固定：15％甲醛固定。
脱钙：放入脱钙液中脱钙，以大头针能轻松插入为宜。
冲洗：流水冲洗骨块24h。
脱水：放入自动组织脱水机脱水。
包埋：包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度。
切片：修、切、展、贴、烤(烤片55～60℃)。
石蜡切片HE染色：脱蜡、染色、脱水、透明、封固
其它实例的相关结果类似，在此就不一一举例。
实施例2
本发明涉及一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，包含以下步骤：
步骤一、将PET人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的人工韧带。
步骤二、PET人工韧带表面改性。把多巴胺加入到pH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中配成浓度为2mg/ml的多巴胺溶液，将预处理得到的PET人工韧带加入到多巴胺溶液中，以400转/分钟的转速，磁力搅拌24小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到多巴胺改性的PET人工韧带。
步骤三、MBG修饰PET人工韧带。200mg的MBG加入到100ml的去离子水中，超声分散30分钟，然后加入多巴胺改性的PET人工韧带，以200转/分钟的转速磁力搅拌24小时后，用去离子水清洗，37℃干燥12小时得到介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的人工韧带，如图1所示。
步骤三中MBG的制备方法为溶胶-凝胶法，干凝胶经球磨碾碎后，过400目筛子，得到粒径小于37微米的MBG颗粒。
实施例3
本发明涉及一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，具体操作方法如：
将PET人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的人工韧带。将100mg的MBG加入到100mlpH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中，超声处理15分钟后，同时加入预处理过人工韧带和100mg多巴胺，以200转/分钟的转速磁力搅拌12小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的PET人工韧带。
所述MBG的制备方法为溶胶-凝胶法，干凝胶经球磨碾碎后，过400目筛子，得到粒径小于37微米的MBG颗粒。
与实施例1-2相比，实施例3将步骤二和步骤三同时进行，即在对PET人工韧带改性的同时，进行MBG的涂覆。这种方法在操作上更加便捷，但是不利于控制涂层表面的均匀性，如图4所示。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤一、将人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的人工韧带；
步骤二、人工韧带表面改性：把多巴胺加入到pH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中配成浓度为0.5～5mg/ml的多巴胺溶液，将步骤一得到的预处理的人工韧带加入到多巴胺溶液中，以150～800转/分钟的转速，磁力搅拌6～48小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到多巴胺改性的人工韧带；
步骤三、介孔生物活性玻璃修饰人工韧带：50～800mg的介孔生物活性玻璃加入到100ml的去离子水中，超声分散10～60分钟，然后加入步骤二得到的多巴胺改性的人工韧带，以150～800转/分钟的转速，磁力搅拌6～24小时后，用去离子水清洗，37℃干燥12小时得到所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的人工韧带。
2.根据权利要求1所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，所述的人工韧带为对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带。
3.根据权利要求1所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，步骤三中介孔生物活性玻璃的制备方法为溶胶-凝胶法，干凝胶经球磨碾碎后，过400～800目筛子，得到粒径小于37微米的MBG颗粒。
4.根据权利要求1所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带的制备方法，包含以下步骤：
步骤一、将PET人工韧带用75％酒精浸泡清洗4小时，然后37℃干燥12小时得到预处理的PET人工韧带；
步骤二、PET人工韧带表面改性：把多巴胺加入到pH值为8.5的10mM的Tris-HCl溶液中配成浓度为1～2mg/ml的多巴胺溶液，将步骤一得到的预处理的PET人工韧带加入到多巴胺溶液中，以200～400转/分钟的转速，磁力搅拌24小时，用去离子水清洗、37℃干燥12小时，得到多巴胺改性的PET人工韧带；
步骤三、介孔生物活性玻璃修饰PET人工韧带：100～200mg的介孔生物活性玻璃加入到100ml的去离子水中，超声分散15～30分钟，然后加入步骤二得到的多巴胺改性的PET人工韧带，以200转/分钟的转速，磁力搅拌12～24小时后，用去离子水清洗，37℃干燥12小时得到介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰的人工韧带。
5.一种介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带，由权利要求1-4任一所述的制备方法制备得到。
6.一种如权利要求5所述的介孔生物活性玻璃/多巴胺修饰人工韧带在制备组织修复材料中的应用。
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