CN106350486A - 一种提高dc‑cik细胞杀伤力的细胞培养方法 - Google Patents

一种提高dc‑cik细胞杀伤力的细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高DC‑CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，将培养得到的DC细胞和CIK细胞使用混合培养液混合培养，所述混合培养液中添加有如SEQ ID NO.1所示的激发肽，利用激发肽作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞，以激发形成DC‑CIK细胞。本发明提供的方法通过改变培养体系成分，将DC与CIK之间由抑制作用变成促进、激发作用，可以提高共培养后的DC‑CIK细胞对靶细胞的杀伤力，有助于提高免疫治疗效果。

Description

一种提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法
技术领域
本发明属于生物领域，涉及免疫细胞培养，具体涉及一种提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法。
背景技术
血液肿瘤的发病率逐年升高，严重威胁人类的健康。目前对于肿瘤的治疗主要有手术切除、物理放射疗法、化学药物疗法，对于血液系统恶性肿瘤当前还是以化学药物治疗、骨髓干细胞移植为主。然而骨髓干细胞的来源有限及严格的实施条件阻碍了其作为血液系统恶性肿瘤的治疗手段，同时多要耐药性(Multidrugresistance，MDR)所导致白血病复发以及化疗失败已经成为白血病治疗的瓶颈。通过自身免疫抗癌的新型治疗方法-肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。肿瘤生物治疗主要通过运用生物技术对从患者体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到患者体内的方法，从而激发并增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。作为一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，肿瘤生物治疗为血液系统恶性肿瘤的治疗提供了新的思路。
肿瘤免疫学研究表明绝大多数的肿瘤患者存在免疫逃逸，即肿瘤细胞通过多种方式，逃避了机体的免疫监视，避免了机体通过免疫应答清除肿瘤细胞。因此，研究肿瘤细胞免疫逃逸机制，对于肿瘤的预防和治疗意义重大。机体在抗肿瘤细胞的特异性免疫应答过程中，抗原提呈细胞起到了至关重要的作用。DC是功能强大的专职抗原提呈细胞，可高效介导对特异性抗原的特异性免疫应答，CIK是一种新型高效的免疫效应细胞，具有非主要组织相容性复合体(MHC)限制杀瘤活性、增殖速度快、杀伤活性高等优点，将DC与CIK共培养，进行混合、培育，形成DC-CIK细胞，实现对肿瘤细胞的长期杀伤的目标。
但是，实际操作中，DC-CIK细胞的杀伤力远远还未达到研究者们的预期，限制了该技术的发展。申请人研究过程中发现，这主要是因为DC与CIK共培养后具有互相抑制的作用，尽管这种抑制作用不明显，但是正是这种抑制作用降低了DC-CIK细胞应该具有的杀伤力。如果能开发一种培养方法，通过改变培养体系成分，将DC与CIK之间由抑制作用变成促进、激发作用，则能显著提高DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤力。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，通过改变培养体系成分，将DC与CIK之间由抑制作用变成促进、激发作用，以提高共培养后的DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤力，提高免疫治疗效果。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法：将培养得到的DC细胞和CIK细胞使用混合培养液混合培养，所述混合培养液中添加有如SEQ ID NO.1所示的激发肽，利用激发肽作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞，以激发形成DC-CIK细胞。
优选地，作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞的激发肽的浓度为8-16μmol/mL。
优选地，作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞的激发肽的浓度为12μmol/mL。
优选地，所述混合培养液为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，其中添加有200-400U/mL的IL-2。
优选地，所述IL-2的浓度为300U/mL。
优选地，DC细胞的培养方法为：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h；2h后收集贴壁细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4，于37℃，5％CO2孵育箱中培养，换液后补充GM-CSF、IL-4，连续培养6d，并于5d在培养基中添加100ng/mLTNF-α。
优选地，，CIK细胞的培养方法为：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h；2h后收集收集单核细胞中的悬浮细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入1000U/mL INF-γ，并于24h后添加300U/mL IL-2、100U/mL IL-1α和50μg/mL抗人CD3单抗，每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子。
优选地，所述抗人CD3单抗为OKT3、UCHT1、HIT3a中的一种或多种。
优选地，混合培养的方法为：将DC细胞和CIK细胞利用混合培养液培养5-7d。
优选地，所述DC细胞和CIK细胞的数量比例为1:6。
本发明的有益效果：
本发明提供的方法将DC与CIK之间由抑制作用变成促进、激发作用，可以显著激发DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤力，有助于提高细胞免疫治疗的效果。
附图说明
图1为DC-CIK细胞对K562靶细胞的杀伤率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明的技术方案。
实施例1：DC-CIK细胞的培养
DC细胞、CIK细胞的分离培养方法：
采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。DC细胞的培养：培养2h后收集贴壁细胞，在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4，于37℃，5％CO2孵育箱中培养，换液后补充GM-CSF、IL-4，连续培养6d，并于5d在培养基中添加100ng/mL TNF-α。CIK细胞的培养：培养2h后收集收集单核细胞中的悬浮细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入1000U/mL INF-γ，并于24h后添加300U/mL IL-2、100U/mL IL-1α和50μg/mL抗人CD3单抗，每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子。所述抗人CD3单抗为OKT3，当然也可以用UCHT1或HIT3a，或这几种的组合。
混合培养：
将上述培养完成的细胞经细胞计数，DC细胞和CIK细胞按照1:6的比例混合培养，混合培养液为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，其中添加有12μmol/mL的激发肽和300U/mL的IL-2，共培养5-7d，即得DC-CIK细胞。
实施例2：实施例1的对比，混合培养时不添加激发肽
DC细胞、CIK细胞的分离培养方法：
采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。DC细胞的培养：培养2h后收集贴壁细胞，在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4，于37℃，5％CO2孵育箱中培养，换液后补充GM-CSF、IL-4，连续培养6d，并于5d在培养基中添加100ng/mL TNF-α。CIK细胞的培养：培养2h后收集收集单核细胞中的悬浮细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入1000U/mL INF-γ，并于24h后添加300U/mL IL-2、100U/mL IL-1α和50μg/mL抗人CD3单抗，每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子。所述抗人CD3单抗为OKT3，当然也可以用UCHT1或HIT3a，或这几种的组合。
混合培养：
将上述培养完成的细胞经细胞计数，DC细胞和CIK细胞按照1:6的比例混合培养，混合培养液为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，其中添加有300U/mL的IL-2，共培养5-7d。
实施例3：细胞毒作用
分别测试实施例1、2制备的DC-CIK细胞的细胞毒作用。使用K562细胞作为靶细胞，使用完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640)调整细胞浓度为105个/mL，以实施例1、2制备的DC-CIK细胞作为效应细胞，按照效靶10:1，将效应细胞及靶细胞加入96孔板中，37℃，5％CO2孵育箱中培养48h。通过MTT检测试剂盒检测细胞活率。
杀伤活性(％)＝[1-(试验孔均值-效应对照孔均值)/靶细胞对照孔均值]×100％。
结果见表1和图1。
表1DC-CIK细胞对K562靶细胞的杀伤率(％)
实施例1 实施例2
杀伤率(％) 68.55±9.45 53.42±8.34
结果表明，本发明方法可以显著激发DC-CIK细胞对K562靶细胞的杀伤力，有助于提高细胞免疫治疗的效果。
实验中还发现，SEQ ID NO.2所示的寡肽A、SEQ ID NO.3所示的寡肽B和SEQ IDNO.4所示的寡肽C具有强化激发肽激发DC-CIK细胞对K562靶细胞杀伤力的能力，但寡肽A、B、C本身并不能激发DC-CIK细胞对K562靶细胞的杀伤力。
实验结果如下：
作用浓度 对K562靶细胞杀伤率(％)
对照组(实施例2) 53.42％
寡肽A0.2μmol/L 54.55％
寡肽B0.2μmol/L 53.89％
寡肽C0.2μmol/L 54.78％
激发肽12μmol/L(实施例1) 68.55％
激发肽8μmol/L+寡肽A0.2μmol/L 77.23％
激发肽8μmol/L+寡肽B0.2μmol/L 83.38％
激发肽8μmol/L+寡肽C0.2μmol/L 80.95％
寡肽A、B、C组与对照组的杀伤率无显著性差异(P＞0.05)；但与激发肽联合使用后，杀伤率显著高于实施例1，具有显著性差异(P＜0.05)。
实施例4：激发肽和寡肽的制备
采用Fmoc法固相合成：合成反应按照从C端向N端进行，Rink介质上有自由氨基；每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸；每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10分钟；每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟；最后，所有氨基酸残基顺序连接后，用98％三氟乙酸从Rink介质上切割下来，切割在室温下进行。多肽的合成已非常成熟，可委托生物外包公司合成。
上述实施例证明，本发明提供的方法将DC与CIK之间由抑制作用变成促进、激发作用，可以显著激发DC-CIK细胞对靶细胞的杀伤力，有助于提高细胞免疫治疗的效果。
上述实施例的作用仅在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：将培养得到的DC细胞和CIK细胞使用混合培养液混合培养，所述混合培养液中添加有如SEQ ID NO.1所示的激发肽，利用激发肽作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞，以激发形成DC-CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞的激发肽的浓度为8-16μmol/mL。
3.根据权利要求2所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：作用于混合培养的DC细胞和CIK细胞的激发肽的浓度为12μmol/mL。
4.根据权利要求1所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述混合培养液为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，其中添加有200-400U/mL的IL-2。
5.根据权利要求4所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述IL-2的浓度为300U/mL。
6.根据权利要求1所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于，DC细胞的培养方法为：采集健康志愿者外周血用预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h；2h后收集贴壁细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4，于37℃，5％CO2孵育箱中培养，换液后补充GM-CSF、IL-4，连续培养6d，并于5d在培养基中添加100ng/mL TNF-α。
7.根据权利要求1所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于，CIK细胞的培养方法为：采集健康志愿者外周血用预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h；2h后收集收集单核细胞中的悬浮细胞，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入1000U/mL INF-γ，并于24h后添加300U/mL IL-2、100U/mLIL-1α和50μg/mL抗人CD3单抗，每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子。
8.根据权利要求7所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述抗人CD3单抗为OKT3、UCHT1、HIT3a中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于，混合培养的方法为：将DC细胞和CIK细胞利用混合培养液培养5-7d。
10.根据权利要求9所述的提高DC-CIK细胞杀伤力的细胞培养方法，其特征在于：所述DC细胞和CIK细胞的数量比例为1:6。
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