CN106323882A - 一种基于金‑石墨烯纳米组装体对Mucin‑1手性信号超灵敏检测的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于金‑石墨烯纳米组装体对Mucin‑1手性信号超灵敏检测的方法,属于材料化学技术领域。本发明包括金纳米粒子的合成,石墨烯纳米材料的准备,金纳米粒子与Mucin‑1适配体的偶联,石墨烯与Mucin‑1适配体部分互补序列的偶联,以及金‑石墨烯纳米结构的组装和之后的TEM和手性信号的表征和测定。基于不同Mucin‑1浓度对金‑石墨烯组装体的解离程度不一样从而影响其手性信号的强弱来建立Mucin‑1浓度与金‑石墨烯组装体手性信号的关系,来实现Mucin‑1的定量检测。本发明提供了能够通过圆二色信号超灵敏检测Mucin‑1含量的方法,制备出了圆二色性能高,生物稳定性好的金‑石墨烯自组装纳米结构。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法,属于材料化学技术领域。
背景技术
黏蛋白是重要的糖蛋白,它是由在粘膜表面的粘液凝胶层组成。粘蛋白固定在细胞表面形成凝胶基质,作为细胞的防御屏障,其黏膜保护和通信与外部环境发挥了重要作用。粘蛋白家族包括21个成员名叫Muc1-muc21,已分为分泌型和膜型。其中,粘蛋白1(Mucin-1)是由一个疏水的跨膜结构域,胞质结构域,和胞外结构域构成。Mucin-1 是一种广泛表达于导管上皮细胞的跨膜糖蛋白,其多肽骨架由多个串联的重复序列( variablenumber of tandem repeats,VNTR) 组成。正常导管上皮细胞中 Mucin-1 的 VNTR 结构域高度糖基化,而 IBD 患者结肠上皮组织中高表达一种 VNTR结构域低糖基化的突变型Mucin-1。Mucin-1是已知的与多种癌症(如乳腺癌、胃癌和肺癌)的发生相关。因此,灵敏的检测Mucin1在肿瘤的初步诊断中具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法,首先通过在金纳米粒子的表面修饰Mucin 1的适配体,在石墨烯表面修饰与Mucin-1适配体部分互补的序列,随着DNA的杂交组装成金-石墨烯纳米自组装体,并对其圆二色性质进行了研究和探讨。加入不同浓度的Mucin-1溶液,对金-石墨烯自组装体的手性信号进行测试,以达到对Mucin-1的超灵敏检测的目的。
本发明的技术方案,一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法,将偶联有Mucin-1适配体的金纳米粒子和偶联有与Mucin-1适配体部分互补序列的石墨烯组装得到金-石墨烯纳米组装体,当存在有待测物Mucin-1时,组装体的结构发生改变,金纳米粒子从组装体上解离,进而引起组装体手性信号的改变,从而实现对Mucin-1的超灵敏检测;具体步骤如下:
(1)检测传感器的构建:
a、金纳米粒子上修饰Mucin-1适配体Mucin-1 aptamer:采用柠檬酸还原法合成的金纳米粒子,将其离心浓缩后,重悬于超纯水中,浓度为5nM;取100μL浓缩重悬后的金纳米粒子,加入2μL 10μM巯基化的Mucin-1 aptamer,和终浓度为50mM的NaCl溶液中,37℃孵育过夜,得到偶联了Mucin-1 aptamer的金纳米粒子溶液,待用;
b、石墨烯偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS:取破碎后的石墨烯用超纯水稀释使终浓度为0.1mg/ml;按EDC、NHS和石墨烯的摩尔比为1000︰1000︰1,加入EDC和NHS,在避光的情况下反应2h;之后,用截留量30k的超滤管过滤,用pH为7.5、10mM的PB缓冲液重悬;向其中加入终浓度2μM的Mucin-1 CS,反应3h,得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液,待用;
c、金-石墨烯纳米结构的组装:取100μL步骤a制备的金纳米粒子偶联Mucin-1aptamer溶液7500rpm离心10min,除去上清;取100μL步骤b制得的石墨烯- Mucin-1 CS溶液用超滤管过滤;最后两种过滤物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO3)2 和质量浓度为 0.01%SDS的10mM TBE 缓冲液中,杂交12h;梯度离心,用超纯水重悬,得到高产率的金-石墨烯纳米组装体;
(2)圆二色光谱检测:建立金-石墨烯纳米组装体手性信号与Mucin-1浓度的标准曲线,根据Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线,从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。
步骤(2)具体如下:金纳米粒子偶联Mucin-1 aptamer,石墨烯偶联 Mucin-1 CS,两者混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO3)2和质量浓度为0.01% SDS的10mM TBE 缓冲液后,分别加入不同浓度的目标物Mucin-1,室温孵育12h,由于Mucin-1会与Mucin-1aptamer的特异性结合,随着Mucin-1浓度的增加,金-石墨烯纳米组装体会有不同程度的解离,因此得到不同的手性信号强度;根据Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线,从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。
所述Mucin-1 aptamer序列和Mucin-1 CS序列如表1所示。
表1:
本发明的有益效果:本发明制备出了组装产率高,性质稳定的金-石墨烯纳米自组装体,提供了能够通过圆二色光谱超灵敏检测Mucin-1浓度的方法,建立了Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体圆二色信号强度两者之间的标准曲线,具有灵敏度高、选择性好,省时省力的优点,具有非常好的实际应用前景。
附图说明
图1 本发明的金-石墨烯纳米自组装体的透射电镜图。
图2 本发明中向金-石墨烯纳米自组装体中加入不同浓度的Mucin-1,导致的圆二色光谱的变化图。
具体实施方式
以下实施例所用试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1
(1)检测传感器的构建:
a、金纳米粒子上修饰Mucin-1适配体:采用柠檬酸还原法合成的金纳米粒子,将其离心浓缩后,重悬于超纯水中,浓度为5nM;取100μL浓缩重悬后的金纳米粒子,加入2μL 10μM巯基化的Mucin-1 aptamer,和终浓度为50mM的NaCl溶液中,37℃孵育过夜,得到偶联了Mucin-1 aptamer的金纳米粒子溶液,待用;
b、石墨烯偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS:取破碎后的石墨烯用超纯水稀释使终浓度为0.1mg/mL;按EDC、NHS和石墨烯的摩尔比为1000︰1000︰1,加入EDC和NHS,在避光的情况下反应2h;之后,用截留量30k的超滤管过滤,pH为7.5、10mM的PB缓冲液重悬;向其中加入终浓度2μM的Mucin-1 CS,反应3h,得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液,待用;
c、金-石墨烯纳米结构的组装:100μL金纳米粒子偶联Mucin-1 aptamer溶液7500rpm离心10min,除去上清;100μL石墨烯- Mucin-1 CS溶液用超滤管过滤,最后两种过滤物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO3)2 和 0.01% SDS的10mM TBE 缓冲液中,杂交12h;梯度离心,用超纯水重悬,得到高产率的金-石墨烯纳米组装体,如图1所示;
(2)圆二色光谱检测:建立金-石墨烯纳米组装体手性信号与Mucin-1浓度的标准曲线,如图2所示。根据Mucin-1浓度与手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线,从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。
Mucin-1 aptamer序列为:
5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T-3’;
Mucin-1 CS序列为:5’- SH-AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG-3’。
Claims (3)
1.一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法,其特征在于:将偶联有Mucin-1适配体的金纳米粒子和偶联有与Mucin-1适配体部分互补序列的石墨烯组装得到金-石墨烯纳米组装体;存在有待测物Mucin-1时,组装体的结构发生改变,金纳米粒子从组装体上解离,进而引起组装体手性信号的改变,从而实现对Mucin-1的超灵敏检测;
具体步骤如下:
(1)检测传感器的构建:
a、金纳米粒子上修饰Mucin-1适配体Mucin-1 aptamer:采用柠檬酸还原法合成的金纳米粒子,将其离心浓缩后,重悬于超纯水中,浓度为5nM;取100μL浓缩重悬后的金纳米粒子,加入2μL 10μM巯基化的Mucin-1 aptamer,和终浓度为50mM的NaCl溶液中,37℃孵育过夜,得到偶联了Mucin-1 aptamer的金纳米粒子溶液,待用;
b、石墨烯偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS:取破碎后的石墨烯用超纯水稀释使终浓度为0.1mg/mL;按EDC、NHS和石墨烯的摩尔比为1000︰1000︰1,加入EDC和NHS,在避光的情况下反应2h;之后,用截留量30k的超滤管过滤,用pH为7.5、10mM的PB缓冲液重悬;向其中加入终浓度2μM的Mucin-1 CS,反应3h,得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液,待用;
c、金-石墨烯纳米结构的组装:取100μL步骤a制备的金纳米粒子偶联Mucin-1 aptamer溶液7500rpm离心10min,除去上清;取100μL步骤b制得的石墨烯-Mucin-1 CS溶液用超滤管过滤;最后两种过滤物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO3)2和质量浓度为0.01%的十二烷基硫酸钠SDS的10mM TBE 缓冲液中,杂交12h;梯度离心,用超纯水重悬,得到高产率的金-石墨烯纳米组装体;
(2)圆二色光谱检测:建立金-石墨烯纳米组装体手性信号与Mucin-1浓度的标准曲线,根据Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线,从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。
2.根据权利要求1所述基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法,其特征在于步骤(2)具体如下:金纳米粒子偶联Mucin-1 aptamer,石墨烯偶联 Mucin-1CS,两者混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO3)2和质量浓度为0.01% SDS的10mM TBE缓冲液后,分别加入不同浓度的目标物Mucin-1,室温孵育12h,由于Mucin-1会与Mucin-1aptamer的特异性结合,随着Mucin-1浓度的增加,金-石墨烯纳米组装体会有不同程度的解离,因此得到不同的手性信号强度;根据Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线,从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。
3.根据权利要求1所述基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法,其特征在于:所述Mucin-1 aptamer序列为:
5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T-3’;
Mucin-1 CS序列为:5’- SH-AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG-3’。
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