CN106265748B - 一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其包括有以下步骤：S1、以纳米珍珠粉为原料，加入去离子水，搅拌成糊状；S2、加入磷酸缓冲液配制的菠萝蛋白酶溶液，搅拌，酶解，后加热灭除菠萝蛋白酶；S3、在灭除菠萝蛋白酶的纳米珍珠粉中再加入磷酸缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液，搅拌，酶解，后加热灭除木瓜蛋白酶；S4、二次酶解后，低温减压真空干燥，最后用超音速气流粉碎机粉碎，即得富含活性肽的纳米珍珠粉。本发明既能将珍珠中的有机基质框架(主要是壳角蛋白)水解成分子量适中且易于被人体吸收的可溶性低分子活性肽，而不是将其水解成没有特别营养价值的氨基酸；同时，使珍珠粉中的高度有序的天然结构变得多孔化而更易于人体吸收利用。

Description

一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法
技术领域
本发明涉及一种纳米珍珠粉的制备方法，属于珍珠粉制备技术领域，尤其是指一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法。
背景技术
珍珠是珍珠贝类和珠母贝类软体动物体内分泌作用而生成的含碳酸钙的矿物珠粒，由大量微小的文石晶体集合而成。珍珠具有重要的应用价值，一方面珍珠是一种珍贵的有机宝石，有很高的市场价值，并孕育了珍珠养殖及其相关产业；另一方面作为传统的中药一直受到人们的关注，由于珍珠中含有丰富的营养成分和生命源物质，具严格有序的结构特点及含丰富的纳米矿物颗粒，因而具有重要的药用价值。相关研究表明，珍珠的成分构成与微结构形态是决定珍珠基本特征的关键。
珍珠的化学成分包括无机成分、有机质成分和水。不同种类和质量的珍珠，其化学成分的含量稍有差异。一般而言，珍珠所含的无机成分含量为91％～96％，有机质含量约为2.5％～7.0％，水的含量约为0.5％～2％。珍珠的无机成分是珍珠的主要成分，其主体是无机相的碳酸钙，另有少量的碳酸镁，二者占91％以上，其次是氧化硅、氧化钙、氧化铝及氧化铁等。珍珠的有机质主体是珍珠贝、蚌类的外套膜细胞分泌的各类蛋白质，主要为壳角蛋白和各种色素，壳角蛋白是一种含有不同糖基的复合蛋白质，糖基的种类与珍珠的颜色有关，这种糖蛋白是一种对人体有益的生物活性物质，但壳角蛋白本身性质稳定，不易溶于水及一般溶剂，难被人体吸收利用。珍珠中有机物的含量变化明显，一般是海水珍珠高于淡水珍珠，海水珍珠含有丰富的角质蛋白，微量有机质。珍珠含有18种氨基酸(包含全部的8种人体必需氨基酸)，十多种与人体生命代谢密切相关的氨基酸，以及新发现的具有特殊活性的非蛋白质氨基酸，能增强人体新陈代谢并有镇静安神作用的非蛋白质氨基酸牛磺酸，水解珍珠蛋白可产生小分子活性肽。
珍珠层是在一个有机基质框架(主要是壳角蛋白)中由碳酸钙晶体组成的高度有序的多重微层结构体，含珍珠质层和棱柱层，对应无机矿物分别为文石和方解石。珍珠质层中的有机质通常可以呈连续层状分布于层间或于晶体间包围生物晶体，也可以呈不连续的集合体或分散的单体分布于晶体内，甚至构成单独的始壳层，呈片层结构。珍珠粒不溶于水，通常以传统方法研磨制粉服食或外用，不易被人体直接吸收，通常只能吸收29％左右，活性作用差。在近代，人们采用现代科学技术将其研磨或水解以充分利用，生产出非水溶性珍珠粉和水溶性珍珠粉两大类:一、非水溶性珍珠粉以珍珠粉的粗细来作为标准，市场上主要有普通珍珠粉和超细(纳米)珍珠粉等，但吸收效率只能有限提高；二、水溶性珍珠粉一般是指使用酸或者酸和酶进行处理的生产珍珠粉，这类珍珠粉中的碳酸钙变成可溶于水易吸收的乳酸钙，但完全破坏了珍珠(粉)中的在有机基质框架中由碳酸钙晶体组成的严格高度有序的天然结构，而这种结构可能与珍珠的药用价值密切相关；同时，目前的水溶性珍珠粉生产工艺普遍追求高的蛋白水解度，采用酶将蛋白质尽量水解成氨基酸，致使本来对人体非常有药用价值小分子活性肽极少，可能反而失去了珍珠原有的药用价值。
因此，发明一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，使其既能将珍珠中的有机基质框架(主要是壳角蛋白)水解成分子量适中且易于被人体吸收的活性肽，而不是将其水解成没有特别营养价值的氨基酸；同时，使珍珠粉中的高度有序的天然结构变得多孔化而更易于人体吸收利用，将极具价值和应用前景，这正是本发明所要改进的技术问题所在。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，该制备方法既能将珍珠中的有机基质框架(主要是壳角蛋白)水解成分子量适中且易于被人体吸收的可溶性低分子活性肽，而不是将其水解成没有特别营养价值的氨基酸；同时，使珍珠粉中的高度有序的天然结构变得多孔化而更易于人体吸收利用。
为了实现上述目的，本发明按照以下技术方案实现：
一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其包括有以下步骤：
S1、以纳米珍珠粉为原料，加入去离子水，搅拌成糊状；
S2、加入磷酸缓冲液配制的菠萝蛋白酶溶液，搅拌，酶解，后加热灭除菠萝蛋白酶；
S3、在灭除菠萝蛋白酶的纳米珍珠粉中再加入磷酸缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液，搅拌，酶解，后加热灭除木瓜蛋白酶；
S4、二次酶解后，低温减压真空干燥，最后用超音速气流粉碎机粉碎，即得富含活性肽的纳米珍珠粉。
进一步，所述S1步骤中，纳米珍珠粉5公斤加入去离子水10升，60转/分钟条件下搅拌成糊状；所述S2步骤中，按珍珠粉重量0.5‰加入0.05mol/L KH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液配制的菠萝蛋白酶溶液，在60转/分钟的搅拌状态下，55℃酶解6小时，后加热升温至100℃，保温10分钟灭活除菠萝蛋白酶；所述S3步骤中，按珍珠粉重量0.5‰加入0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液，在60转/分钟的搅拌状态下，65℃酶解6小时，后加热升温至100℃，保温10分钟灭活除木瓜蛋白酶；所述S4步骤中，在65℃低温下减压真空干燥。
进一步，所述0.05mol/L KH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液的配制，配制1000ml该缓冲液，称取6.85g KH2PO4加入去离子水溶解，用1M NaOH调节PH至7.2后，定容到1000ml即可。
进一步，所述0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液的配制，配制1000ml该缓冲液，称取71.6g Na2HPO4·12H2O加入去离子水溶解，用1M NaH2PO4调节pH至7.0后，定容到1000ml即可。
进一步，所述菠萝蛋白酶溶液的配制，取2.5g菠萝蛋白酶，加入500ml0.05mol/LKH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液，55℃水浴5min，使其充分溶解后，则为5mg/ml菠萝蛋白酶溶液，4℃保存待用。
进一步，所述木瓜蛋白酶溶液的配制，取2.5g菠萝蛋白酶，加入500ml0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液，65℃水浴5min，使其充分溶解，则为5mg/ml木瓜蛋白酶溶液，4℃保存待用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明的制备方法制得的纳米珍珠粉，可溶性低分子活性肽及小分子物质，含量显著增加，种类丰富，分子量分布大部分集中在300-945(质-荷比)之间，也就是说既能将珍珠中的有机基质框架(主要是壳角蛋白)水解成分子量适中且易于被人体吸收的可溶性低分子活性肽，而不是将其水解成没有特别营养价值的氨基酸；同时，使珍珠粉中的高度有序的天然结构变得多孔化而更易于人体吸收利用。
为了能更清晰的理解本发明，以下将结合附图详细阐述本发明的具体实施方式。
附图说明
图1是现有技术中无酶处理的珍珠粉的液-质联用分析图谱。
图2是本发明中5ml菠萝蛋白酶与5mg木瓜蛋白酶二次酶解珍珠粉的液-质联用分析图谱。
图3是本发明中10ml菠萝蛋白酶与10mg木瓜蛋白酶二次酶解珍珠粉的液-质联用分析图谱。
备注：上述每图中上部分为阴离子质谱图，下部分为阳离子质谱图。
具体实施方式
在25升酶解反应罐中，加入纳米珍珠粉5公斤，加入去离子水10升，60转/分钟条件下搅拌成糊状；按珍珠粉重量0.5‰加入0.05mol/L KH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液配制的菠萝蛋白酶溶液，在60转/分钟搅拌状态下，55℃酶解6小时，后加热升温至100℃，保温10分钟灭活除菠萝蛋白酶；再按珍珠粉重量0.5‰加入0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液，在60转/分钟的搅拌状态下，65℃酶解6小时，后加热升温至100℃，保温10分钟灭活除木瓜蛋白酶；于65℃低温减压真空干燥，最后，用超音速气流粉碎机粉碎，即得到富含活性肽的纳米珍珠粉。
上述0.05mol/L KH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液、0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液、菠萝蛋白酶溶液和木瓜蛋白酶溶液的配制如下：
所述0.05mol/L KH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液的配制，配制1000ml该缓冲液，称取6.85g KH2PO4加入去离子水溶解，用1M NaOH调节PH至7.2后，定容到1000ml即可。
所述0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液的配制，配制1000ml该缓冲液，称取71.6g Na2HPO4·12H2O加入去离子水溶解，用1M NaH2PO4调节pH至7.0后，定容到1000ml即可。
所述菠萝蛋白酶溶液的配制，取2.5g菠萝蛋白酶，加入500ml 0.05mol/L KH2PO4-NaOH(pH＝7.2)磷酸缓冲液，55℃水浴5min，使其充分溶解后，则为5mg/ml菠萝蛋白酶溶液，4℃保存待用。
所述木瓜蛋白酶溶液的配制，取2.5g菠萝蛋白酶，加入500ml 0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH＝7.0)磷酸缓冲液，65℃水浴5min，使其充分溶解，则为5mg/ml木瓜蛋白酶溶液，4℃保存待用。
实验数据：
一、菠萝蛋白酶的单一酶解实验
(1)取3个100ml洁净锥形瓶分别标记为B1、B2、B3，各加入10g珍珠粉，15ml去离子水，充分摇匀后，用锡箔纸封口，置于水浴锅中煮沸10min，取出冷却；
(2)冷却后，按下表加入菠萝蛋白酶与去离子水
标记 菠萝蛋白酶 去离子水 总体积(含第一步加入的15ml水)
B<sub>1</sub> 0ml 10ml 25ml
B<sub>2</sub> 1ml(5mg) 9ml 25ml
B<sub>3</sub> 1ml(10mg) 8ml 25ml
(3)置于恒温摇床，55℃，100r/min，酶解；
(4)取B1、B2、B3组分别在6h、8h、10h酶解后的珍珠粉乳悬液各1ml，置于1.5ml EP管，煮沸10min(去除菠萝蛋白酶)后静置冷却；
(5)4℃，7000r/min，离心10min；
(6)取各组上清100ul加入到酶标板内，在连续光谱荧光酶标仪测定275nm吸光度；
(7)结果菠萝蛋白酶不同酶解时间所取珍珠粉乳悬液离心后，上清溶液275nm吸光度值如下表所示：
酶解时间(小时h) B<sub>1</sub>组 B<sub>2</sub>组 B<sub>3</sub>组
6 0.050 0.634 0.634
8 0.050 0.652 0.651
10 0.049 0.632 0.666
(8)结果表明，与对照组(B1组)比较，菠萝蛋白酶组(B2组和B3组)的275nm吸光度明显提高，说明萝蛋白酶确实能有效水解纳米珍珠粉中的壳角蛋白产生可溶性的活性肽，且B2组和B3组2种不同酶用量及酶解时间的差别并不明显。
二、木瓜蛋白酶的单一酶解实验
(1)取3个100ml洁净锥形瓶分别标记为M1、M2、M3，各加入10g珍珠粉，15ml去离子水，充分摇匀后，用锡箔纸封口，置于水浴锅中煮沸10min，取出冷却；
(2)冷却后，按下表加入菠萝蛋白酶与去离子水
(3)置于恒温摇床，65℃，100r/min，酶解；
(4)取M1、M2、M3组分别在6h、8h、10h酶解后的珍珠粉乳悬液各1ml，置于1.5ml EP管，煮沸10min(去除木瓜蛋白酶)后静置冷却；
(5)4℃，7000r/min，离心10min；
(6)取各组上清100ul加入到酶标板内，在连续光谱荧光酶标仪测定275nm吸光度；
(7)结果木瓜蛋白酶不同酶解时间所取珍珠粉乳悬液离心后，上清溶液275nm吸光度值如下表所示：
酶解时间(h) M<sub>1</sub> M<sub>2</sub> M<sub>3</sub>
6 0.049 0.541 0.575
8 0.049 0.543 0.593
10 0.050 0.541 0.615
(8)结果表明，与对照组(M1组)比较，木瓜蛋白酶组(M2组和M3组)的275nm吸光度明显提高，说明木瓜蛋白酶确实能有效水解纳米珍珠粉中的壳角蛋白产生可溶性的活性肽，且M2组和M3组2种不同酶用量及酶解时间的差别并不明显。
三、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的二次酶解实验
(1)取3个100ml洁净锥形瓶分别标记为B1、B2、B3，各加入10g珍珠粉，15ml去离子水，充分摇匀后，用锡箔纸封口，置于水浴锅中煮沸10min，取出冷却；
(2)按下表加入菠萝蛋白酶与去离子水
标记 菠萝蛋白酶 去离子水 总体积(含第一步加入的15ml水)
B<sub>1</sub> 0ml 10ml 25ml
B<sub>2</sub> 1ml(5mg) 9ml 25ml
B<sub>3</sub> 2ml(10mg) 8ml 25ml
(3)置于恒温摇床，55℃，100r/min，酶解；
(4)酶解6h后，将各组置于水浴锅沸水浴10min(灭活菠萝蛋白酶)；
(5)取出冷却后，按下表加入木瓜蛋白酶；
标记 木瓜蛋白酶 去离子水 总体积
BM<sub>1</sub> 0 2 27ml
BM<sub>2</sub> 1ml(5mg) 1 27ml
BM<sub>3</sub> 2ml(10mg) 0 27ml
(6)65℃酶解6h后，取BM1、BM2、BM3每组酶解后的珍珠粉乳悬液，各1ml，置于1.5mlEP管，煮沸10min；
(7)冷却后，4℃，7000r/min，离心10min；
(8)各取上清100ul加入到酶标板内，用酶标仪测吸光度；
(9)结果如下表所示：
去离子水 BM<sub>1</sub> BM<sub>2</sub> BM<sub>3</sub>
吸光度 0.047 0.389 0.585 0.715
(10)结果表明，菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶二次酶解效果优于单独用菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶水解的效果。
四、可溶性小分子肽及小分子物质液-质联用分析
(1)上述实验三中水解后的BM1、BM2、BM3组样品，加入到50ml离心管中，4℃，7000r/min，离心10min；
(2)用10ml注射器将上清取出，经过0.2um的针头滤器，过滤至洁净的10mlEP管内；
(3)取1.5ml滤液，用液-质联用仪分析酶解后小分子肽分子；
(4)结果如图1、图2和图3所示；
(5)结合实验三的275nm吸光度变化，表明菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶二次酶解后可溶性低分子活性肽及小分子物质含量显著增加，种类丰富，分子量分布大部分集中在300-945(质-荷比)之间，其中在367处附近出现最高峰，此产物牛磺酸，含量最多。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动和变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。

Claims (5)

1.一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其特征在于包括有以下步骤：
S1、纳米珍珠粉5公斤加入去离子水10升，60转/分钟条件下搅拌成糊状；
S2、按珍珠粉重量0.5‰加入0.05mol/L KH2PO4- NaOH，pH＝7.2的磷酸缓冲液配制的菠萝蛋白酶溶液，在60转/分钟的搅拌状态下，55℃酶解6小时，后加热升温至100℃，保温10分钟灭活除菠萝蛋白酶；
S3、按珍珠粉重量0.5‰加入0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液，在60转/分钟的搅拌状态下，65℃酶解6小时，后加热升温至100℃，保温10分钟灭活除木瓜蛋白酶；
S4、在65℃低温下减压真空干燥，最后用超音速气流粉碎机粉碎，即得富含活性肽的纳米珍珠粉。
2.根据权利要求1所述一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其特征在于：所述0.05mol/L KH2PO4- NaOH，pH＝7.2的磷酸缓冲液的配制，配制1000ml该缓冲液，称取6.85gKH2PO4加入去离子水溶解，用1M NaOH调节pH至7.2后，定容到1000ml即可。
3.根据权利要求1所述一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其特征在于：所述0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4，pH＝7.0的磷酸缓冲液的配制，配制1000ml该缓冲液，称取71.6g Na2HPO4·12H2O加入去离子水溶解，用1M NaH2PO4调节pH至7.0后，定容到1000ml即可。
4.根据权利要求2所述一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其特征在于：所述菠萝蛋白酶溶液的配制，取2.5g菠萝蛋白酶，加入500ml0.05mol/L KH2PO4- NaOH，pH＝7.2的磷酸缓冲液，55℃水浴5min，使其充分溶解后，则为5mg/ml菠萝蛋白酶溶液，4℃保存待用。
5.根据权利要求3所述一种富含活性肽的纳米珍珠粉的制备方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶溶液的配制，取2.5g木瓜蛋白酶，加入500ml 0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4，pH＝7.0的磷酸缓冲液，65℃水浴5min，使其充分溶解，则为5mg/ml木瓜蛋白酶溶液，4℃保存待用。
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