CN1062449C - 制备养殖甲壳纲的饲料的方法 - Google Patents

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Abstract

甲壳纲感染病预防剂，它包括一种葡聚糖，该葡聚糖主链主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残基和/或能产生葡聚糖的真菌的菌丝体作为有效组分。

Description

制备养殖甲壳纲的饲料的方法
本发明涉及甲壳纲感染病的预防剂、甲壳纲宿主防御机理增强剂、饲料、及其制备方法，其中，预防剂、宿主防御机理增强剂的和饲料含有特定的多糖，即一种葡聚糖主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残基的主链并带有吡喃葡萄糖侧链。(以后简称为“所述葡聚糖”)。
已知道从多种蘑菇中提取的多糖能增强哺乳动物的免疫系统，包括人类，而这些多糖主要由葡聚糖表示，葡聚糖主要包括β-1，3-吡喃葡糖基残基的主链，它带有β-1，6-支链吡喃葡萄糖的侧链。
另一方面，已经知道对于鱼类疾病的采用疫苗的预防措施和采用抗生素的治疗方法是有效的。也已知FK-565(见日本未审查专利公开第233923/1988号)和所述葡聚糖(见日本未审查专利公开第218615/1990号)可依靠它们的增强免疫性对鱼类疾病有预防和治疗作用的活力。
为了高效地利用海洋资源，近来多种鱼类和贝壳类被广泛培植。据报导，在水产养植领域中，经常发生甲壳纲的细菌性和病毒性感染病，导致大大的收获损失。
为了预防或治疗这些感染病，多种药剂已被开发和应用，其中大部分是抗生素。然而，抗生素的使用致使致病细菌产生对抗生素的耐药性，并且通过食用施用抗生素的甲壳纲动物而摄入抗生素导致人对抗生素的耐药性。这样，在全世界，抗生素的使用趋向于被禁止或在全世界控制使用。
另外，试验使用用致病细菌的死亡的菌丝体的疫苗，结果无明显效果。这样，还是希望提高疫苗的效能。
在这些情况下，本发明人已研究了对鱼类的提高疫苗效能的或增强宿主防御机理的有效的方法。根据事实，所述葡聚糖对防止感染疾病及增进鱼的免疫系统有效，而且希望对甲壳纲有相似效果，本发明者从事这方面的研究并找到了本发明。
第一个发明点在于对甲壳纲病的有效疫苗，它含有有效量的所述葡聚糖和/或作为活性组分的能产生葡聚糖的真菌的菌丝体。该疫苗含有致病细菌的菌丝体作为与所述葡聚糖一起的基本组分应用以说明他们依赖于对所述葡聚糖的辅助性证明它们的协同作用。
第二个发明点在于甲壳纲宿主防御机理增强剂，它含有有效量的所述葡聚糖和/或作为活性组分的产生葡聚糖的微生物的菌丝体。本发明人们已发现所述葡聚糖特别能增强甲壳纲的宿主防御机理以防止甲壳纲被致病细菌或病毒感染。
第三个发明点在于甲壳纲的饲料，它含有所述葡聚糖和/或作为有效组分的最好是从0.001到10重量％的浓缩物的产生葡聚糖的微生物的菌丝体。可通过用所述饲料喂养甲壳纲以增强宿主防御机理来达到预防传染病的效果。
第四个发明点在于制备具有上述效能的饲料的方法。
甲壳纲感染病的例子包括日本对虾(Penaeus japonicus)，斑节对虾(Penaeus monodon)，白腿小虾等的弧菌病；寄生虫病，如Epistylissp.，Soothamnium sp．或诸如此类的；霉菌性感染病，如Lagenidi-um sp.的，Siropodium sp．的，及诸如此类的；和病毒性感染病，如Pe-naei杆状瘸毒(BP)，Monodon杆状瘸毒(MBV)，肝胰腺的似微小病毒(HPV)，或诸如此类的。
所述葡聚糖是水溶性葡聚糖，主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残基主链，它是在特定的担子菌纲培养肉汤进行细胞外培养，或从特定的担子菌纲的籽实体提取制备。也已知所述葡聚糖可由担子菌纲以外的其它微生物制得(见美国专利1，061，043号)。所述葡聚糖通常主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残基主链，该主链带有β-1，6-吡喃葡糖单元。该支链的存在致使所述葡聚糖成水溶性。
也已知一些水溶性葡聚糖，如curdlan和昆布多糖，它们主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残留物主链而无支链。与那些水溶性β-1，3-葡聚糖比较，水不溶性β-1，3-葡聚糖通常显出较低的生物活性。这样所述葡聚糖不包括这种水不溶性β-1，3-葡聚糖。水不溶性β-1，3-葡聚糖当化学改性转变为可溶时活性能被提高。该化学改性的可溶性β-1，3-葡聚糖属于所述葡聚糖。
所述葡聚糖最好是裂裥菌素(见日本审查过的专利公开第37873/1971号)、硬葡聚糖(scleroglucan)(见美国专利1，601，043号)和从Lentinus edodes蘑菇提取制得的蘑菇多糖。应当注意到酵母葡聚糖和免疫增强的甘露聚糖也被提出具有与所述葡聚糖相似的生物活性。然而，由于实验结果的波动要明显地证实它们对甲壳纲感染病的效能是困难的。
已知产生裂裥菌素的真菌的菌丝体(Schizophyllum communeFries)含有主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残基主链并带有β-1，6-吡喃葡糖支链的水不溶性葡聚糖，但是这些不溶性葡聚糖的复杂结构还不能解释(见J.G.H.Wessels等人的Biochimica et Biophysia Acta，273，346-358[1972])Schizophyllum commune Fries菌丝体中的水不溶性β-1，3-葡聚糖可能具有与所述葡聚糖相似的对感染病的效能，因为粉状的真菌菌丝体显示出对甲壳纲传染病的预防效能。典型的产生硬葡聚糖的真菌的例子是Sclerolum glucanicum。
能用于本发明的葡聚糖的例子列于下表中。
                        表
Figure 9210072500061
Figure 9210072500071
*分支度表示比率(分支点：β-1，3-连接的个数)
实施例1
将日本对虾分成四组，每组有20只。三组以10、5和2mg裂裥菌素/kg体重的不同剂量注射裂裥菌素的生理食盐水溶液。对照组注射生理盐水。过1、3和7天，收集对虾血液并在MEM培养介质中带有胶乳球珠培养(107个0.8微米直径的球珠/ml血液)，观察血细胞对球珠的吞噬作用。计算吞噬到100个血细胞中的球珠个数N和吞噬球珠的血细胞的百分数n，并将吞噬指数(PI)与一个血细胞吞噬的球珠的平均数的关系描绘在图1和2中。图1中，横轴为施用裂裥菌素后的天数，纵轴为吞噬指数，N表示未处理时，C表示对照组，A表示平均值，S表示标准偏差。图2中，横轴为施用裂裥菌素后的天数，纵轴为每个血球细胞吞噬的胶乳球珠的平均数，N表示未处理时，C表示对照组，A表示平均值，S表示标准偏差。
剂量为10mg和5mg裂裥菌素/kg体重组的对虾与对照组的相比显示出明显较高的宿主防御活性。
(PI)=(N/1000)×(n/100)×100实施例2
将日本对虾分为四组，每组20只。裂裥菌毒被以生理盐水的形式以10、5和2mg裂裥菌素/kg体重的不同剂量注入。对照组注射生理盐水。过1、3和7天，对每只对虾肌内注射108个胶乳球珠。球珠注射45分钟后，测定吞噬率，得图3和4。图3中，横轴表示施用裂裥菌素后的天数，纵轴表示吞噬指数，N表示未处理时，C表示对照组。图4中，横轴表示施用裂裥菌素后的天数，纵轴表示胶乳球珠吞噬率(％)，N表示未处理时，C表示对照组。施用裂裥菌素的组与对照组相比明显显示出较高的宿主防御活性。实施例3
已知对虾有一种淋巴器官(未知器官)通过吞噬外界颗粒而在宿主防御机理中起重要作用。
将日本对虾分成四组，每组20只，第一组接受肌内注射裂裥菌素的生理盐水溶液，剂量为10mg/kg体重，第二组5mg/kg体重，第三组2mg/kg体重，第四组注射生理盐水(对照组)，然后注射108个胶乳球球/每只对虾。过1天、3天和7天，淋巴器官被摘下、破碎并涂布于载玻片上。计数每1mm2器官细胞的吞噬的球珠数。
如图5所示，施用裂裥菌素的组显示出较高的被器官细胞吞噬的球珠数，表明了宿主防御机理的增强。图5中，横轴为施用裂裥菌素后的天数，纵轴为每mm2淋巴器官吞噬的球珠数，N表示未处理时，C表示对照组。饲料的制备例子
将0.2到2裂裥菌素加入1kg起始物料，包括鱼肉、乌贼戎鱼肉、乌贼鱼肝油、啤酒酵母、多种矿物、多种维生素、谷胶、酪蛋白和α-淀粉，并与它们充分混合。向所得混合物加入适量的水以形成浆料。然后将浆料投入饲料挤出机，并由机器的内径为1.5到3.0mm的孔挤出。挤出温度为约85到95℃而挤出时间为10到20秒。这样通过器机的孔挤出的线型饲料被切成长5到12mm的适于作对虾饲料的长度，从而得到最终产品。
如此得到的饲料营养组合物包含50到60％的蛋白质，2.5到10％的脂肪，2到4％的纤维和15到20％的灰渣。对比饲料的制备例子
用相同的方法制备对比饲料，只是不含裂裥菌素。实施例4
将日本对虾分成两组，每组20只。一组用上述普通食物喂养，而另一组用含能产生裂裥菌素的真菌的菌丝体的相同的食物以给每只对虾每天10mg的裂裥菌素。
一个月后，对虾被试验肌内注射有毒力Vibrio sp．使受到攻击。
试验后一个月，施用能产生裂裥菌素的真菌的菌丝体的组显于出72％的存活率，而对照组为48％的存活率。实施例5
通过用硬葡聚糖代替裂裥菌素重复实施例1中的试验。
那就是说，将日本对虾分四组，每组20只。三组分别以10、5和2mg硬葡聚糖/kg体重的不同剂量注射硬葡聚糖的生理盐水溶液。对照组接受生理盐水注射。
1天、3天和7天后，从对虾收集血液并在MEM培养介质中用胶乳球珠培养(107个0.8微米直径的球珠/ml血液)，观察血细胞所吞噬的球珠。
按实施例1中的等式计算吞噬指数(PI)和在一个血细胞中所吞噬的球珠的平均数，所得结果示于表1和表2中。
表1和表2表明，与对照组相比，剂量为10mg和5mg硬葡聚糖/kg体重的组显示出明显较高的宿主防御性。
表1．施用硬葡聚糖的日本对虾的
     血细胞的吞噬指数的变化
硬葡聚糖施用量(mg/kg) 施用硬葡聚糖后的天数(天)
1 3 7
2 95.3±1.2 162.7±22.2 123.1±13.3
5 137.2±9.5 195.4±34.5 93.0±12.0
10 125.8±4.5 201.6±14.6 87.9±15.8
对照组 112.5±1.8 153.4±2.5 65.6±5.7
表2．施用硬葡聚糖的日本对虾的血细胞的吞噬活性
    (每个细胞吞噬的胶乳球珠的平均数的变化)
硬葡聚糖施用量(mg/kg) 施用硬葡聚糖后的天数(天)
1 3 7
2 7.1±3.6 8.0±1.7 7.5±0.9
5 5.9±3.1 10.3±2.6 4.2±2.4
10 6.3±4.2 9.2±1.0 5.9±3.8
对照组 5.9±1.9 6.7±2.5 4.0±2.3
实施例6
以与实施例5相同的方式，将日本对虾分成四组，每组20只。用生理盐水溶液以10、5和2mg硬葡聚糖/kg体重的不同的计量注射硬葡聚糖。对照组接受生理盐水。过1、3和7天，对每只对虾肌内注射108个胶乳球珠。球珠注射后45分钟，用与实施例5相同的方法测定吞噬率，得表3和4。
这些表表明，与对照组相比施用硬葡聚糖的组显示明显较高的宿主防御能力。
表3．施用硬葡聚糖的日本对虾的
    淋巴器官的吞噬指数的变化
硬葡聚糖施用量(mg/kg) 施用硬葡聚糖后的天数(天)
1 3 7
2 10.6±8.4 15.4±14.3 7.0±4.4
5 9.2±2.4 28.9±21.1 3.9±0.9
10 18.2±8.3 39.1±17.8 6.8±4.3
对照组 9.3±5.5 10.2±5.4 3.2±1.4
表4．施用硬葡聚糖的日本对虾的淋巴器官的吞噬活性
   (每个血细胞吞噬的胶乳球珠的平均数的变化)
硬葡聚糖施用量(mg/kg) 施用硬葡聚糖后的天数(天)
1 3 7
2 5.8±3.8 20.6±10.2 10.8±4.4
5 11.2±5.2 24.8±8.5 13.3±3.0
10 14.5±4.1 30.1±11.9 20.5±8.6
对照组 8.7±2.5 10.1±6.7 11.2±4.3
实施例7
用与实施例3相同的方式，日本对虾被分成四组，每组20只，而第一组以10mg/kg体重的剂量接受硬葡聚糖的生理盐水溶液的肌内注射，第二组5mg/kg体重，第三组2mg/kg体重，而第四组(对照组)为生理盐水溶液，然后肌内注射108胶乳球珠/每只对虾。过1、3、7天后，淋巴器官被摘下，绞碎并涂布于载玻片上。计算每1mm2器官细胞吞噬的球珠数。
如表5所示，施用硬葡聚糖的组显示转高的被器官细胞所吞噬的球珠数，表明宿主防御机理的增强。
表5．施用硬葡聚糖的日本对虾的淋巴器官的吞噬活性(施用硬葡聚糖的日本对虾的每mm2淋巴器官吞噬的
  胶乳球珠平均数的变化)
硬葡聚糖施用量(mg/kg) 施用硬葡糖后的天数(天)
1 3 7
2 1035.0±240.6 1182.7±609.6 2235.6±1745.6
5 1214.7±864.0 3995.2±2408.5 2797.7±870.3
10 1056.1±665.4 1533.8±1065.5 1775.2±349.5
对照组 1016.0±388.8 998.8±749.6 1089.0±419.4
含能产生硬葡聚糖的真菌菌丝体的饲料的制备例子
将0.2到3g能产生硬葡聚糖的真菌的菌丝体加入至/kg起始物料，起始物料包括鱼肉、乌贼鱼肉、乌贼鱼肝油、啤酒酵母、多种矿物质、多种维生素、谷胶、酪蛋白和α-淀粉，并与它们充分混合。向所得混合物加入适量水以形成浆料。然后将浆料投入饲料挤出机，并由机器的内径为1.5到3.0mm的孔挤出。挤出温度为约85到95℃而挤出时间为10到20秒。这样通过机器的孔挤出的线状饲料被切成长5到12mm的适于作对虾饲料的长度，从而得到最终产品。
如此得到的营养组合物含40到60％蛋白质，2.0到10％脂肪、2到5％纤维和10到20％灰份。对比饲料的制备例子
用相同的方法制备对比饲料，只是不含能产生硬葡聚糖的直菌的菌丝体。实施例8
用与实施例4相同的方法，将日本对虾分成两组，每组20只。一组用上述普通食物喂养，而另一组用含有能产生硬葡聚糖的真菌的菌丝体的相同的食物喂养以对每只对虾每天施加10mg硬葡聚糖。
一个月后，对虾被试验肌内注射有毒力的Vibrio sp．使受到攻击。
试验后一个月，施用能产生硬葡聚糖的真菌的菌丝体的组显示65％的存活率，而对照组为30％的存活率。

Claims (3)

1．一种制备养殖甲壳纲的饲料的方法，其特征在于包括一步添加具有主要包含β-1，3-吡喃葡糖基残基主链的葡聚糖和能产生葡聚糖的真菌的菌丝体的步骤，其中葡聚糖和能产生葡聚糖的真菌的菌丝体在饲料中的加入浓度为从0.001到10％。
2．如权利要求1的方法，其特征在于葡聚糖是裂裥菌素和能产生葡聚糖的真菌的菌丝体是那些能产生裂裥菌素的真菌的。
3．如权利要求1的方法，其特征在于葡聚糖是硬葡聚糖和能产生葡聚糖的真菌的菌丝体是那些能产生硬葡聚糖的真菌的。
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