CN106244597A - 一种蛋白酶抑制剂编码基因及其表达与应用 - Google Patents

一种蛋白酶抑制剂编码基因及其表达与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种来源于菊芋的蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)及其表达和应用。HtCPI基因碱基序列如SEQ ID NO：1所示；或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。本发明提供的HtCPI基因及其表达载体能用于植物遗传转化，提高植物抗逆性。另外本发明提供的HtCPI基因能够用于体外表达，在生物源杀虫剂生产方面具有重要应用价值。

Description

一种蛋白酶抑制剂编码基因及其表达与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种来源于菊芋的蛋白酶抑制剂编码基因及其表达和应用。
背景技术
蛋白酶抑制剂基因广泛分布于植物体内，可以通过抑制昆虫肠中蛋白酶的活性而降低昆虫取食量，抑制昆虫生长甚至杀死昆虫，被作为理想的抗虫因子而广泛研究。它还是干旱、低温及高盐等恶劣环境胁迫下的一种重要的组织防御应激蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor，CPI)是一个由进化相关的蛋白所构成的巯基蛋白酶抑制剂亚族，这些蛋白能与半胱氨酸蛋白酶相互作用形成可逆地竞争性结合并抑制其活性。半胱氨酸蛋白酶抑制剂最早是在鸡蛋清中被分离得到，因其对半胱氨酸蛋白酶有抑制作用而被命名为“cystatin”。半胱氨酸蛋白酶抑制剂除了能够有效地调控内源半胱氨酸蛋白酶的水平，还能抑制外源半胱氨酸蛋白酶的活性，阻止宿主细胞受细菌或病毒等病原体的感染。Cystatin对以半胱氨酸类蛋白酶为主要消化酶的鞘翅目昆虫的防治具有重要作用。当半胱氨酸类蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内积累时，它与昆虫消化道中的蛋白酶作用形成酶‐抑制剂复合物，而显著降低昆虫肠道内蛋白酶的活性，影响食物中蛋白的正常消化和许多酶原的激活，同时刺激消化酶的过量合成和分泌，扰乱昆虫正常代谢，最终导致昆虫死亡。
除抗虫基因工程外，蛋白酶抑制剂在医药、食品领域也有应用价值：在医药领域，蛋白酶抑制剂可用于抗炎抗感染、抗病毒感染和抗肿瘤等临床治疗上，如在治疗胰腺炎和多功能衰竭、抗休克、减少心脏外科手术中失血等方面。在食品领域，蛋白酶抑制剂能够与鱼肉中的蛋白酶争夺活性位点或者非特异性的捕获蛋白酶，干扰蛋白酶的作用，提高鱼肉糜的贮藏性。
比较商业化的Bt抗虫基因，植物蛋白酶抑制剂基因应用于抗虫基因工程具有三大明显的优势：(1)它杀虫谱广；(2)昆虫不易对其产生耐受性，其作用位点在酶活性中心，而酶的活性中心在进化上是高度保守的，昆虫难以直接产生抗性；(3)由于作用机制不同，植物蛋白酶抑制剂不影响哺乳动物包括人类消化酶的活性，对人及哺乳动物无害。因此，它的分离、转化十分受到重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于菊芋的蛋白酶抑制剂基因及其表达和应用。
一种蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)，其特征在于：HtCPI基因碱基序列如SEQ IDNO：1所示；
或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。
HtCPI基因编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明HtCPI基因由427个核苷酸组成。
本发明HtCPI基因编码的蛋白质为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，由110个氨基酸残基组成，包括N-端19个氨基酸残基组成的信号肽区和C-端91个氨基酸组成的成熟肽区，其理论等电点为8.99，属于碱性蛋白质，与葡萄半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(GenBank accessionXP003635016)具有最高的序列相似性且仅为39％。
本发明HtCPI基因编码的蛋白质二级结构中多为α-螺旋，很少的β-折叠，经过比对分析，可归为半胱氨酸蛋白酶抑制剂I25家族B型。
菊芋HtCPI基因的制备方法，包括如下步骤：
菊芋cDNA文库的构建：选取菊芋块茎提取总RNA，以总RNA为模板，运用Clontech公司SMARTerTM cDNA建库试剂盒合成cDNA双链；
以上述cDNA为模板，运用引物进行PCR扩增，获得HtCPI基因片段；
上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得SEQ ID NO：1所示HtCPI基因。
所述引物为F:5’–ATGGCTCAGCCCCTTAGTCTCC-3’；R:5’–CGGGGTACGATGAGACACCA-3’。
本发明构建了HtCPI基因表达载体，能用于植物遗传转化，在制备抗逆的转基因植物中的应用。
植物表达载体为将所述HtCPI基因与pCAMBIA2301载体相连，获得植物表达载体。
基因的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：
以限制性内切酶XBa Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切JaSPI基因加酶切位点的PCR产物和pCAMBIA2301载体；
分别回收上述HtCPI基因片段和pCAMBIA2301载体，以5：1的比例连接；
通过PCR和酶切对上述重组质粒进行鉴定。
HtCPI基因的应用，所述HtCPI基因在制备抗逆的转基因植物中的应用。
HtCPI基因表达载体的应用，所述表达载体在制备抗逆的转基因植物中的应用。
本发明实现的有益效果：
蛋白酶抑制剂基因广泛分布于植物体内，可以通过抑制昆虫肠中蛋白酶的活性而降低昆虫取食量，抑制昆虫生长甚至杀死昆虫，被作为理想的抗虫因子而广泛研究。作为抗虫基因其具有三大明显的优势：(1)它杀虫谱广；(2)昆虫不易对其产生耐受性，其作用位点在酶活性中心，而酶的活性中心在进化上是高度保守的，昆虫难以直接产生抗性；(3)由于作用机制不同，植物蛋白酶抑制剂不影响哺乳动物包括人类消化酶的活性，对人及哺乳动物无害。蛋白酶抑制剂基因还是干旱、低温及高盐等恶劣环境胁迫下的一种重要的组织防御应激蛋白。本发明从菊芋中克隆了一种新型的蛋白酶抑制剂编码基因HtCPI，属I25家族B型半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，与葡萄序列相似性最高，但其序列相似性仅为39％。为了进一步分析该基因的作用与功能，采用本发明获得基因并构建植物表达载体可见，野生型拟南芥和本发明转HtCPI基因的拟南芥在抗虫性上有明显的差异，转HtCPI基因的拟南芥比野生型的植株有明显的抗虫能力，可见HtCPI基因的转入提高了拟南芥植株的抗虫能力。通过本发明菊芋HtCPI基因的获得，可以用于植物遗传转化，提高植物的抗虫性及抗逆性。另外本发明提供的HtCPI基因能够在体外表达，在生物源杀虫剂生产方面具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的琼脂糖电泳鉴定总RNA产物图谱。
图2为本发明实施例提供的琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物图谱。
图3为本发明实施例提供的表达载体构建酶切鉴定图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
菊芋HtCPI基因及其表达载体，是通过以下方法得到：
1.菊芋cDNA文库的构建
本发明取生长健壮的成熟期菊芋块茎，用天根生化科技有限公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，以总RNA为模板，参照Clontech公司cDNA文库构建试剂盒说明，在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。
2.引物的设计与合成
本发明设计正向特异性引物：5’-ATGGCTCAGCCCCTTAGTCTCC-3’，反向引物使用cDNA文库建库试剂盒提供的引物：5’–CGGGGTACGATGAGACACCA-3’。引物两端分别引入XBa Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点，引物由上海生物工程技术有限公司合成。
3.PCR方法获得HtCPI基因片段
本发明以合成的高质量cDNA双链为模板，利用步骤2设计的正反向引物扩增HtCPI基因序列。PCR条件为：①95℃，5min；②95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；30个循环；③72℃，10min。
4.克隆鉴定与序列测定
扩增片段采用北京百泰克公司DNA回收试剂盒回收纯化后，克隆连接到pMD19-T载体中，转化DH5α感受态细胞进行克隆鉴定和序列测定。
5.序列分析
本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得HtCPI基因，其核苷酸序列信息如SEQID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
6.载体构建
以限制性内切酶XBa Ⅰ和Sac Ⅰ分别双酶切HtCPI基因加酶切位点的PCR产物和pCAMBIA2301载体，回收HtCPI基因片段和pCAMBIA2301载体，以5：1的比例连接，通过PCR和酶切对重组质粒进行鉴定。
本发明所述HtCPI基因及其表达载体能用于植物遗传转化，在培育提高抗逆性植物中的应用。
实施例1
菊芋HtCPI基因克隆
1.菊芋cDNA文库构建
取50～100mg新鲜菊芋块茎组织，加入液氮后迅速充分研磨，匀浆后移至1.5mL EP管，选用天根公司RNA提取试剂盒，提取总RNA。
采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA，产物结果见图1，图中可见明显的RNA条带且28S和18S rRNA两条带清晰未出现弥散，表示提取到的总RNA未降解，质量较高。
以总RNA为模板，参照Clontech公司cDNA文库构建试剂盒说明，在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。
2.PCR方法获得HtCPI基因片段
根据NCBI数据库中相近物种已有基因数据，运用Primer Premier 5.0软件设计正向特异性引物：5’-ATGGCTCAGCCCCTTAGTCTCC-3’，结合cDNA文库建库试剂盒提供的反向引物5’-CGGGGTACGATGAGACACCA-3’扩增菊芋HtCPI基因。在灭菌的1.5mL EP管中依次混匀下列试剂：10×PCR buffer 5.0μL，dNTPs 4μL，cDNA模板1μL(20ng)，引物0.5μL，Taq 0.5μL，加无菌水定容至50μL。
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增30个循环，在72℃延伸10min。
经过1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约450bp大小的片段(图2)。
3.克隆鉴定、序列测定
1)基因片段的分离与回收
用北京百泰克生物技术公司的DNA回收试剂盒进行基因片段回收，具体操作如下：
在紫外仪下切取特异性条带称重，向胶块中加入3倍凝胶体积的融化液BufferGM，均匀混合后室温融化胶块。
凝胶完全融化后，观察融胶液颜色，若颜色由黄色变为橙色或粉色则向其中加入10μL 3M醋酸钠溶液(pH＝5.2)，混匀至颜色恢复黄色。
将融胶转移至核酸纯化柱(Spin Column)中，12000rpm离心1min，弃滤液。
向核酸纯化柱中加入700μL Buffer WB，室温12000rpm离心30s，弃滤液。而后再重复此步骤一次。
将核酸纯化柱放回收集管(Collection Tube)上，12000rpm离心1min。
将核酸纯化柱置于新离心管上，向膜中央加入30μL Elution Buffer，室温静置1min。
室温12000rpm离心1min洗脱DNA(为提高回收效率，可将洗脱液再次加入核酸纯化柱中，二次洗脱)。
2)回收产物与pMD19-T载体的连接及转化
将回收到的目的片段连接到pMD19-T载体中，体系如下：Solution Ⅰ 1μL，T载体5μL，目的片段DNA 4μL，16℃过夜连接。
取DH5α感受态细胞融化(置冰上)。
将上述10μL连接产物加入已融化的DH5α感受态细胞中，轻柔混匀。
冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰浴2min，加入800μL LB液体培养基(37℃提前温浴)，混匀。
37℃摇床(50rpm，15min；100rpm，15min；150rpm，15min)培养，5000rpm离心3min，弃去800μL上清，余200μL吸吹均匀，涂布于含有100μg/mL Amp的LB平板上，至菌液完全吸收，37℃倒置培养过夜。
3)目的片段序列测定
挑取单菌落于1mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养3-4h。
以培养好的菌液为模板，用M13通用引物进行PCR检测单菌落中是否插入目的片段。引物序列为：M13-F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTG-3’；M13-R:5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
挑选含有目的片段的阳性克隆送到上海生工进行测序。
本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得HtCPI基因，其碱基和氨基酸序列信息如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID No：1
序列特征：
长度：427个碱基
类型：DNA
链型：单链
拓扑结构：线型
来源：菊芋(Helianthus tuberosus Linn)
SEQ ID No：2
序列特征：
长度：110个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线型
来源：菊芋(Helianthus tuberosus Linn)
实施例2
植物表达载体pCAMBIA2301-HtCPI的构建
以限制性内切酶XBa Ⅰ和Sac Ⅰ分别双酶切HtCPI基因的加酶切位点的PCR产物和pCAMBIA2301载体，分别回收HtCPI基因片段和pCAMBIA2301载体，以5：1的比例(摩尔比)连接，通过PCR和酶切对重组质粒进行鉴定。
1.酶切体系为：
37℃，过夜。
2.按实施例1的方法胶回收HtCPI基因片段和pCAMBIA2301载体。
3.将回收的HtCPI片段与pCAMBIA2301表达载体在16℃下连接过夜，连接体系为：
4.将连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取单菌落，接种于20mL LB+Km的三角瓶中，37℃恒温振荡培养过夜，以菌液为模板做PCR检测。
将阳性菌落扩大培养，提取质粒并纯化，用XBa Ⅰ和Sac Ⅰ做双酶切，检测克隆是否正确。结果如图3所示，提取质粒DNA经XBa Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切，获得一条位于250-500bp之间大小的预期片段，说明目的基因已经成功地连接到表达载体上。
实施例3
转基因拟南芥植株的获得及抗虫性分析
1.植物表达载体转化农杆菌
以实施例2中获得的植物表达载体利用冻融法转化农杆菌EHA105，获得重组农杆菌，并经PCR鉴定得到阳性转化子(含有SEQ ID NO：1所示的HtCPI基因的转化子)，用于侵染拟南芥植株。
2.HtCPI转基因拟南芥的获得及鉴定
按照常规方式将上述重组农杆菌侵染待转化的拟南芥植株花序，收取其种子。将收取的种子种植在MS固体培养基的平板上(含Km 60μg/mL)筛选T0代阳性转基因植株。将绿色幼苗移入盆中生长，待T0代的绿色幼苗长大，结荚收取种子进行T1代阳性植株的筛选。将筛选得到的T1代阳性植株种植，收取不同T1代阳性株系的种子。将收取的T1代种子种植在含Km60μg/mL的MS固体培养基上，筛选T2代纯合株系。采用CTAB法提取纯合转基因株系基因组进行PCR验证，得到T2代转基因拟南芥纯合体株系。
3.含HtCPI基因的转基因拟南芥的抗性鉴定
用柳蓝叶甲成虫进行抗虫性鉴定。饲喂实验前，对每个参试植株的叶片先用网格法测量面积，取食后再测量剩余面积，然后计算出取食面积，到实验结束将所有饲喂的叶片取食面积进行累加，并利用ANOVA统计分析不同实验组之间叶片消耗量的差异。
实验结束计算出的取食面积如表1。可以看出：转基因植株取食面积明显低于对照，叶片受损面积较少，这证明HtCPI基因的抗虫功能，将可用于利用转基因技术改良作物抗虫性的研究和产业化生产中。
表1柳蓝叶甲生物胁迫试验结果
实验组 累计取食面积(cm2) 标准误
对照 46.56 ±6.51
转基因植株1 31.53 ±2.08
转基因植株2 28.01 ±1.25
转基因植株3 22.62 ±2.19

Claims (7)

1.一种蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)，其特征在于：HtCPI基因碱基序列如SEQ IDNO：1所示；
或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。
2.按权利要求1所述的HtCPI基因，其特征在于：所述HtCPI基因编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种权利要求1所述的HtCPI基因的制备方法，其特征在于：菊芋cDNA文库的构建：选取菊芋块茎提取总RNA，以总RNA为模板，运用Clontech公司SMARTerTM cDNA建库试剂盒合成cDNA双链；
以上述cDNA为模板，运用引物进行PCR扩增，获得HtCPI基因片段；
上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得SEQ ID NO：1所示HtCPI基因。
4.按权利要求3所述的HtCPI基因的制备方法，其特征在于：所述引物为F:5’–ATGGCTCAGCCCCTTAGTCTCC-3’；R:5’–CGGGGTACGATGAGACACCA-3’。
5.一种权利要求1所述的HtCPI基因的应用，其特征在于：所述HtCPI基因在制备抗逆的转基因植物中的应用。
6.按权利要求1所述的HtCPI基因编码的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体为将所述HtCPI基因与pCAMBIA2301载体相连，获得植物表达载体。
7.一种权利要求6所述的表达载体的应用，其特征在于：所述表达载体在制备抗逆的转基因植物中的应用。
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