CN106237321A - 一种坏死梭杆菌抗原及其制备方法和制得的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及坏死梭杆菌疫苗领域，特别涉及一种坏死梭杆菌抗原及其制备方法和制得的疫苗。一种坏死梭杆菌抗原，将坏死梭杆菌采用胰酶进行酶解，离心得到的上清液经灭活处理后即得。本发明经多次试验，采用胰酶裂解菌体的方式，得到的裂解产物进行分离，去除内毒素以及其他无效的成分，保留其有效抗原成分，灭活得到的坏死梭杆菌抗原制成的疫苗克服了现有的疫苗接种后在注射部位容易形成硬结，会出现局部肿痛或发热等的副反应，制得的疫苗免疫性能稳定可靠。

Description

一种坏死梭杆菌抗原及其制备方法和制得的疫苗

技术领域

本发明涉及坏死梭杆菌疫苗领域，具体而言，涉及一种坏死梭杆菌抗原及其制备方法和制得的疫苗。

背景技术

腐蹄病是牛、羊、鹿等偶蹄动物常见的一种亚急性高度接触性传染病，临床症状包括起卧困难、站立时负重不实、食欲下降或废绝、产奶量急剧下降；严重者蹄角质分离，甚至造成死亡。腐蹄病每年都给我国乃至全世界的牛、羊、鹿的养殖业造成巨大经济损失。

目前，腐蹄病临床防治无商品化疫苗可用，主要以临床处置和抗生素治疗为主，但控制效果不佳却造成抗生素被滥用于动物养殖业；上个世纪末，中国农业科学院特产研究所历经多年研究成功研制出适用于牛和鹿的坏死梭杆菌灭活全菌疫苗，虽然疫苗免疫保护率达90％以上，免疫期6个月以上，但该疫苗接种后在注射部位容易形成硬结，会出现局部肿痛或发热等副反应，影响疫苗的推广应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种坏死梭杆菌抗原的制备方法，该方法将坏死梭杆菌菌体采用胰酶进行裂解，然后分离，得到的上清液灭活，上清液中不再含有内毒素，解决了现有技术中坏死梭杆菌灭活全菌疫苗含有内毒素的缺陷。

本发明的第二目的在于提供一种坏死梭杆菌抗原，该抗原不再含有内毒素，并且能很好的满足制备疫苗的需求。

本发明的第三目的在于提供由上述抗原制得的疫苗。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种坏死梭杆菌抗原的制备方法，将坏死梭杆菌采用胰酶进行酶解，离心得到的上清液经灭活处理后即得。

本发明人对现有技术的坏死梭杆菌灭活全菌疫苗研究发现，该疫苗接种后在注射部位容易形成硬结，会出现局部肿痛或发热等副反应是由于该全菌疫苗不仅含有高浓度的抗原物质，而且含有高浓度内毒素。本发明经多次试验，采用胰酶裂解菌体的方式，使其内容物释放出来，裂解产物进行分离，去除内毒素以及其他无效的成分，保留其有效抗原成分，然后将其灭活得到坏死梭杆菌抗原。制备方法简便易行，得到的坏死梭杆菌抗原制成的疫苗克服了现有的疫苗接种后在注射部位容易形成硬结，会出现局部肿痛或发热等的副反应。

进一步地，所述坏死梭杆菌来源于牛、鹿以及羊中的任一种或多种。

进一步地，所述酶解的悬浮液的pH值为8.0-8.2，所述悬浮液是将收集的坏死梭杆菌菌体用水悬浮制得，所述悬浮液的pH用碱溶液进行调节。通过调节菌体悬浮液的pH为枯草杆菌素提供良好的酶解条件。

优选地，所述菌体与所述水的重量比为1:3-5。以达到适当的菌体浓度，便于胰酶更充分的酶解。

优选地，所述碱溶液为强碱性溶液，所述强碱性溶液的质量浓度为8％-15％。

进一步地，所述强碱包括氢氧化钠和氢氧化钾中的任一种或两种。

经试验，在特定的温度下，酶解更完全，酶解产物更易于去除含有的内毒素，进一步地，所述胰酶的添加量为菌体重量的0.3％-0.5％，酶解的温度为42-45℃，酶解的时间为28-32min。

为了达到更好的酶解效果，且利于后续的分离，优选地，胰酶酶解菌体的过程中，保持菌体悬浮液的pH为8.0-8.2。

进一步地，所述灭活采用福尔马林进行。

进一步地，所述灭活是在所述上清液中添加福尔马林，然后于36-38℃处理4.5-5.5天，期间不时摇动。

优选地，所述上清液的蛋白浓度为8-12mg/mL，添加的福尔马林占所述上清液的体积百分数为0.45％-0.55％。

进一步地，酶解的坏死梭杆菌为：将坏死梭杆菌接种于厌氧培养基，培养至对数生长期得到的菌体。对数生长期的菌体生长旺盛，也易于裂解，且其中积累的有害成分少。

优选地，所述厌氧培养基为脑心浸出液肉汤培养基或硫乙醇酸盐培养基。这两种培养基是现有的，可通过市售购买，或者是按照市售的配方进行配制。

优选地，所述离心采用的转速为12000-13000rpm。裂解的菌体通过该转速离心，得到的上清液中去除了内毒素以及其他无效的成分，保留了有效抗原成分。

进一步地，所述坏死梭杆菌接种量为5％-10％，培养的温度为35-39℃，培养的时间为8-24h。通过该接种量以及培养温度和时间，得到的菌体处于对数生长期。

本发明还提供了由上述的坏死梭杆菌抗原的制备方法制得的坏死梭杆菌抗原。

本发明还提供了由上述的坏死梭杆菌抗原制得的坏死梭杆菌疫苗。该疫苗可采用常规的方法制备。

进一步地，所述疫苗为白油佐剂疫苗、铝胶佐剂疫苗、弗氏完全佐剂疫苗中的任一种。

具体地，白油佐剂疫苗通过以下方法制备：制得的灭活的上清液中加入Tween80，然后与佐剂用胶体磨乳化制得白油佐剂疫苗，定批号1；

其中，Tween80的质量浓度为3.5-4.5％；佐剂为：10号白油、司班80和硬脂酸铝以质量比为90：8：2的混合物。

铝胶佐剂疫苗通过以下方法制备：制得的灭活的上清液按重量比例为3：6-8加入铝佐剂，然后加入质量浓度为0.01％硫柳汞充分振荡，在2～10℃冷暗处放置24h，期间不时摇动，使充分吸附，制备得到铝胶佐剂疫苗，定批号2。

弗氏完全佐剂疫苗通过以下方法制备：制得的灭活的上清液按质量浓度为1％加入Tween80，然后按重量比为5：6-4：5加入弗氏完全佐剂，用胶体磨乳化，制备得疫苗，定批号3。

三种疫苗在无菌、安全检验合格后均移入2～10℃冷暗处保存。

最后得到的产物中，甲醛一方面是自己挥发；另一方面在后续配置疫苗过程中会添加其他液体，对甲醛起到一个稀释的作用，最终保证甲醛终浓度不超过1％。

另外，需要说明的是，本发明人还对坏死梭杆菌进行碱裂解、蛋白酶K裂解、超声波裂解以及冻融裂解等等，裂解后分离得到的上清液中均残留较多的内毒素，制成的疫苗的副反应与现有的全菌疫苗效果基本一致，均不能解决现有的疫苗接种后在注射部位容易形成硬结、出现局部肿痛或发热等的副反应的问题。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明采用胰酶裂解坏死梭杆菌的方式，将裂解产物进行分离，得到的上清液灭活，制得的坏死梭杆菌抗原制成的疫苗克服了现有的疫苗接种后在注射部位容易形成硬结，会出现局部肿痛或发热等的副反应的缺陷。

(2)本发明还提供了具体的裂解坏死梭杆菌的步骤，通过分离，尽量多的去除含有的内毒素以及其他无效的成分，保留其有效抗原成分，得到的坏死梭杆菌抗原制成的疫苗克服了现有的疫苗接种后的副反应，并且免疫性能稳定。

(3)本发明还提供了不同类型的疫苗，免疫效果稳定可靠。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种坏死梭杆菌抗原，通过以下方法制备：

将牛源坏死梭杆菌接种于厌氧培养基硫乙醇酸盐培养基，坏死梭杆菌接种量为5％，培养的温度为39℃，培养的时间为24h，培养得到处于对数生长期的坏死梭杆菌；

将培养得到的坏死梭杆菌菌液离心，离心采用连续流离心机，使用连续流离心机离心坏死梭杆菌培养物时，离心机转子、输液管需要煮沸灭菌或高压灭菌，无菌条件下安装转子和输液管；

菌液进入连续流离心机的流速约为100mL/min，离心的转速为12000rpm，离心5min，得到菌体沉淀；

菌体沉淀用灭菌蒸馏水重悬，菌体沉淀与蒸馏水的重量比例为1:3，得到菌体悬浮液；

菌体悬浮液用10％NaOH溶液调整其pH值为8.0，升高温度至42℃，加入胰酶的水溶液，胰酶的添加量为菌体沉淀物重量的0.3％；

每隔5min检查一下菌体悬浮液的pH值，使其保持在8.0-8.2，酶解时间为32min；

酶解完成后，冷却至室温，12000rpm离心5min，收集上清液；

取样按照Lowry法测定菌体蛋白含量，利用灭菌蒸馏水稀释至蛋白浓度为8mg/mL，备用；

按照终浓度0.45％向制备的水解产物中添加福尔马林，置于36℃温箱中灭活5.5天，期间不时摇动确保灭活均匀，得到坏死梭杆菌抗原。

实施例2

一种坏死梭杆菌抗原，通过以下方法制备：

将牛源坏死梭杆菌接种于厌氧培养基脑心浸出液肉汤培养基，坏死梭杆菌接种量为8％，培养的温度为37℃，培养的时间为12h，培养得到处于对数生长期的坏死梭杆菌；

将培养得到的坏死梭杆菌菌液离心，离心采用连续流离心机，使用连续流离心机离心坏死梭杆菌培养物时，离心机转子、输液管需要煮沸灭菌或高压灭菌，无菌条件下安装转子和输液管；

菌液进入连续流离心机的流速约为110mL/min，离心的转速为12000rpm，离心5min，得到菌体沉淀；

菌体沉淀用灭菌蒸馏水重悬，菌体沉淀与蒸馏水的重量比例为1:4，得到菌体悬浮液；

菌体悬浮液用10％NaOH溶液调整其pH值为8.1，升高温度至44℃，加入胰酶的水溶液，胰酶的添加量为菌体沉淀物重量的0.4％；

每隔5min检查一下菌体悬浮液的pH值，使其保持在8.0-8.2，酶解时间为30min；

酶解完成后，冷却至室温，12000rpm离心5min，收集上清液；

取样按照Lowry法测定菌体蛋白含量，利用灭菌蒸馏水稀释至蛋白浓度为10mg/mL，备用；

按照终浓度0.5％向制备的水解产物中添加福尔马林，置于37℃温箱中灭活5天，期间不时摇动确保灭活均匀，得到坏死梭杆菌抗原。

实施例3

一种坏死梭杆菌抗原，通过以下方法制备：

将牛源坏死梭杆菌接种于厌氧培养基脑心浸出液肉汤培养基，坏死梭杆菌接种量为10％，培养的温度为35℃，培养的时间为8h，培养得到处于对数生长期的坏死梭杆菌；

将培养得到的坏死梭杆菌菌液离心，离心采用连续流离心机，使用连续流离心机离心坏死梭杆菌培养物时，离心机转子、输液管需要煮沸灭菌或高压灭菌，无菌条件下安装转子和输液管；

菌液进入连续流离心机的流速约为120mL/min，离心的转速为13000rpm，离心3min，得到菌体沉淀；

菌体沉淀用灭菌蒸馏水重悬，菌体沉淀与蒸馏水的重量比例为1:5，得到菌体悬浮液；

菌体悬浮液用10％NaOH溶液调整其pH值为8.2，升高温度至45℃，加入胰酶的水溶液，胰酶的添加量为菌体沉淀物重量的0.5％；

每隔5min检查一下菌体悬浮液的pH值，使其保持在8.0-8.2，酶解时间为28min；

酶解完成后，冷却至室温，13000rpm离心3min，收集上清液；

取样按照Lowry法测定菌体蛋白含量，利用灭菌蒸馏水稀释至蛋白浓度为12mg/mL，备用；

按照终浓度0.5％向制备的水解产物中添加福尔马林，置于38℃温箱中灭活4.5天，期间不时摇动确保灭活均匀，得到坏死梭杆菌抗原。

试验例

实施例2制得的坏死梭杆菌抗原分别制备成疫苗，疫苗的种类为白油佐剂疫苗、铝胶佐剂疫苗、弗氏完全佐剂疫苗；

白油佐剂疫苗通过以下方法制备：制得的灭活的上清液中加入Tween80，然后与佐剂用胶体磨乳化制得白油佐剂疫苗，为1号疫苗；

其中，Tween80的质量浓度为4％；佐剂为：10号白油、司班80和硬脂酸铝以质量比为90：8：2的混合物；

铝胶佐剂疫苗通过以下方法制备：制得的灭活的上清液按重量比例为3：7加入铝佐剂，然后加入质量浓度为0.01％硫柳汞充分振荡，在2～10℃冷暗处放置24h，期间不时摇动，使充分吸附，制备得到铝胶佐剂疫苗，为2号疫苗；

弗氏完全佐剂疫苗通过以下方法制备：制得的灭活的上清液按质量浓度为1％加入Tween80，然后按重量比为1：1加入弗氏完全佐剂，用胶体磨乳化，制备得疫苗，为3号疫苗；

三种疫苗在无菌、安全检验合格后均移入2～10℃冷暗处保存。

制得的不同种类的疫苗进行免疫试验。

1、兔免疫试验

20只试验兔、随机分为4组，每组5只，分笼常规饲养。第一组皮下注射1号疫苗0.5mL，第二组皮下注射2号疫苗0.5mL，第三组皮下注射3号疫苗0.5mL，注射部位耳根皮下，第4组为空白对照组。在注射疫苗前和注射疫苗后采血，并在注射疫苗后28d对各组试验兔耳根皮下注射2个致死剂量的坏死梭杆菌(10⁸cells/mL，2mL)，观察精神、食欲等变化，详细记录。结果如表1和表2所示。

表1兔攻毒试验结果

表2接种3种疫苗兔血清中的抗体变化

注：“X/Y”表示“Y”中有“X”只检测出抗体，如“3/4”表示四只兔有三只检测出抗体。

从表1可以看出，本发明提供的疫苗只有轻微的不良反应，疫苗接种后在注射部位不会形成硬结，也不会出现局部肿痛或发热等副反应。并且免疫效果较好。

表2结果表明，接种三种疫苗兔在14d前，被免兔血清对流免疫电泳呈阴性，3周后逐渐产生抗体，追踪检测至22周，被检兔血清对流免疫电泳仍然呈阳性。

表2中，由于试验兔在免疫后4周开始接种2个致死剂量的坏死梭杆菌菌液进行攻毒，考察疫苗的攻毒保护；所以会有实验兔死亡现象发生；即使没有死亡，由于选取试验兔进行解剖实验，观察试验兔的实质脏器的变化情况，与对照组进行比较分析，所以会有试验兔数量减少情况发生。

2、三种疫苗对奶牛的免疫试验

2.1奶牛的分组540只奶牛随机分为3组，1组170只，2组230只，3组144只，每组再随机分为2组，为注射疫苗组和对照组，具体分组情况如表3所示。

表3免疫奶牛分组方式

分组序号	总数	注射疫苗组	对照组
				1	170	90	80
2	230	125	105
				3	140	90	50

组1、2、3注射疫苗组分别对应注射1、2、3号疫苗，每头奶牛耳根皮下注射疫苗4mL；对照组不注射疫苗；统计发病数，具体结果如表4所示。

表4免疫试验结果

1号疫苗和2号疫苗对牛免疫后，有个别牛出现精神、食欲不振，3d后症状消失；3号疫苗对牛免疫后，有10余只牛出现局部非细菌性化脓，一个月后破溃，一直迁延不愈，驻场兽医切开部分牛的创口，处理后痊愈，未处理牛半年后化脓逐渐消失。怀疑3号疫苗是由于除抗原外的添加物造成免疫动物牛出现更加不适的现象。

另外，改变白油佐剂疫苗、铝胶佐剂疫苗以及弗氏完全佐剂疫苗中各成分的添加量，以得到更加优越的免疫效果也在本发明的保护范围内。

应用SPSS软件对表4进行双因素分析，不同佐剂间的免疫效果无明显差异；应用疫苗前后效果显著。

利用制备的疫苗在本动物奶牛上进行了田间试验，用SPSS软件对表4的田间试验结果分析，应用配对T检验，疫苗免疫前后差异显著，说明疫苗效果良好。

另外，本发明还将实施例1和实施例3制得的坏死梭杆菌抗原采用与实施例2制得的坏死梭杆菌抗原相同的方法分别制得白油佐剂疫苗、铝胶佐剂疫苗、弗氏完全佐剂疫苗，并对其进行性能的验证，结果均同实施例2制得的疫苗效果一致。

本发明提供的牛源坏死梭杆菌具有良好的免疫原性，本发明首次在国内制备出无细胞牛坏死杆菌病疫苗，动物试验证明，疫苗安全有效。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种坏死梭杆菌抗原的制备方法，其特征在于，将坏死梭杆菌采用胰酶进行酶解，离心得到的上清液经灭活处理后即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述坏死梭杆菌来源于牛、鹿以及羊中的任一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的悬浮液的pH值为8.0-8.2，所述悬浮液是将收集的坏死梭杆菌菌体用水悬浮制得，所述菌体与所述水的重量比优选为1:3-5，所述悬浮液的pH用碱溶液进行调节。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱溶液为强碱性溶液，所述强碱性溶液的质量浓度为8％-15％。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胰酶的添加量为菌体重量的0.3％-0.5％，酶解的温度为42-45℃，酶解的时间为28-32min；

优选地，胰酶酶解菌体的过程中，保持菌体悬浮液的pH为8.0-8.2。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活采用福尔马林进行；

进一步地，所述灭活是在所述上清液中添加福尔马林，然后于36-38℃处理4.5-5.5天，期间不时摇动；

优选地，所述上清液的蛋白浓度为8-12mg/mL，添加的福尔马林占所述上清液的体积百分数为0.45％-0.55％。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，酶解的坏死梭杆菌为：将坏死梭杆菌接种于厌氧培养基，培养至对数生长期得到的菌体；

所述厌氧培养基优选为脑心浸出液肉汤培养基或硫乙醇酸盐培养基；

优选地，所述离心采用的转速为12000-13000rpm。

8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述坏死梭杆菌接种量为5％-10％，培养的温度为35-39℃，培养的时间为8-24h。

9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的坏死梭杆菌抗原。

10.由权利要求9所述的坏死梭杆菌抗原制得的坏死梭杆菌疫苗。