CN106212442B - 一种脱细胞角膜制备用保护液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脱细胞角膜制备保护液，是添加有5‑12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子量右旋糖酐的PBS或HBSS缓冲液。本发明在基础缓冲液中添加保护性成分，通过组分与配比的选择使制备的保护液能维持脱细胞角膜制备液体的胶体渗透压，与传统的脱细胞角膜制备液体相比，可以显著降低胶原等细胞外基质成分在后期脱细胞处理过程中过度溶胀、丢失导致的角膜透明度下降；而且添加妥布霉素等抗生素成分，抑制易感染角膜的细菌滋生，如绿脓杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌等，避免处理过程中的污染几率。
Description
技术领域
本发明属于医疗材料技术领域，具体涉及一种脱细胞角膜制备用保护液。
背景技术
角膜病是我国第二大致盲性眼病，我国现有约400万角膜盲患者，每年角膜盲病人新增约10万余人，但目前国内每年仅能实现大约5000-8000例角膜移植手术。角膜供体严重不足的现实国情导致绝大多数患者在黑暗中排队等候，有的甚至错过最佳治疗机会，导致永久失明。角膜移植分为穿透性角膜移植、板层角膜移植和角膜内皮移植。其中板层角膜移植对供体材料的要求较低，特别适合于角膜缘干细胞和角膜内皮无明显病变的患者，同时，角膜位于眼球表面，处于免疫豁免区域，移植后容易观察和处理，也是组织工程最容易突破的热点领域。近年来，随着组织工程学的广泛和深入研究，经脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的异种角膜基质材料在动物水平或临床应用中也取得了较好的治疗效果，部分解决了我国角膜供体材料严重匮乏的问题，为角膜盲患者重见光明带来希望。
以往报道的角膜脱细胞液体多单独使用基础缓冲液(如PBS、HBSS、细胞培养液等)对角膜进行溶胀，再通过物理、化学或生物学方法破碎细胞进行洗脱，一般需要24-72小时的脱细胞过程。长时间溶胀往往会导致角膜有序胶原结构的破坏，伴随着角膜透明性丧失，光学效果差，移植后会逐渐变薄或长期不透明，不能达到长期复明的目的。
针对上述问题，研发新型的脱细胞角膜制备用保护液，避免溶胀引起角膜胶原纤维结构的破坏，保持角膜透明度，是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了避免现有技术存在的缺点，提供一种始终保持角膜透明特性的脱细胞角膜制备用保护液，通过该保护液，适用于脱细胞角膜制备过程中保持角膜胶原结构和透明度，避免现有方法对角膜胶原结构和透明性的影响。
本发明的脱细胞角膜制备用保护液，是添加有5-12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子量右旋糖酐的PBS或HBSS缓冲液；
上述的脱细胞角膜保护液，其pH值调至7.2～7.4；
上述的脱细胞角膜保护液，其渗透压为300-400mOsm
作为优选，本发明的脱细胞角膜保护液中还添加有妥布霉素，其添加量优选为1-3ml/L。
本发明在基础缓冲液中添加保护性成分，通过组分与配比的选择使制备的保护液能维持脱细胞角膜制备液体的胶体渗透压，与传统的脱细胞角膜制备液体相比，可以显著降低胶原等细胞外基质成分在后期脱细胞处理过程中过度溶胀、丢失导致的角膜透明度下降；而且添加妥布霉素等抗生素成分，抑制易感染角膜的细菌滋生，如绿脓杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌等，避免处理过程中的污染几率。
具体实施方式
我国及其他东南亚国家都面临着角膜供体匮乏的难题，严重影响了角膜盲患者的复明，角膜供体的来源也成为目前角膜病治疗过程中最为棘手的问题，寻找适合于人体的角膜替代物已成为当前眼科和组织工程领域研究的热点。猪角膜来源广泛，角膜厚度和屈光方面与人角膜最为接近，经脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的猪角膜基质材料在动物水平或临床应用中也取得了较好的治疗效果，部分解决了我国角膜供体材料严重匮乏的问题，为角膜盲患者重见光明带来希望。
申请人对已有的角膜保存液进行了组合和配比的优化，从而再使用尽可能少组分的情况下取得了更好的效果，从而促成了本发明。
下面通过实例对本发明进行具体的描述。
实施例1：
保护液成分为PBS缓冲液中添加8g/L透明质酸、10g/L硫酸软骨素、5g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为320mOsm。
实施例2：
保护液成分为PBS缓冲液中添加5g/L透明质酸、15g/L硫酸软骨素、3g/L右旋糖苷，3ml/L妥布霉素；调整pH值为7.2，渗透压为320mOsm。
实施例3：
保护液成分为PBS缓冲液中添加5g/L透明质酸、13g/L硫酸软骨素、10g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为340mOsm。
实施例4：
保护液成分为PBS缓冲液中添加7g/L透明质酸、15g/L硫酸软骨素和10g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为350mOsm。
实施例5：
保护液成分为HBSS缓冲液中添加6g/L透明质酸、12g/L硫酸软骨素和10g/L右旋糖苷、3ml/L妥布霉素，调整pH值为7.2，渗透压为350mOsm。
实施例6：保护液的使用效果
将新鲜猪角膜使用板层角膜刀或飞秒激光切削出600μm板层，使用上述实例2配方保护液；
制备脱细胞角膜的具体步骤如下：
1)使用实施例2的保护液，添加0.5％SDS作为脱细胞使用液体，用；
2)将切削好的角膜板层置于步骤1)配制的使用液体中；
3)室温100rpm/min震荡脱细胞处理4-8h；
4)将脱细胞后的角膜置于使用液体中漂洗4小时以上。
脱细胞角膜分别采用直观观察脱细胞角膜的透明度和柔软度，使用微量测厚仪测量脱细胞角膜厚度。
经试验，使用上述保护液制备的脱细胞角膜保持与正常未脱细胞角膜相似的厚度(650±50μm VS 600±20μm)，而未使用上述保护液制备的脱细胞角膜厚度达到1000-2000μm。
使用上述保护液制备的脱细胞角膜保持与正常未脱细胞角膜相似的柔软度，用显微镊夹持边缘，未见明显弯曲，而未使用上述保护液制备的脱细胞角膜明显变软，明显弯曲。
此外，使用上述保护液制备的脱细胞角膜保持与正常未脱细胞角膜相似的透明度，置于打印有黑色A字纸上可见明显字母，而未使用上述保护液制备的脱细胞角膜明显变白，黑色A字不可见。
上述其它实施例制备的保护液的使用效果与实施例2的类似。
实施例7
申请人将上述实施例2中的透明质酸或硫酸软骨素替换为甘油，含量不变；制成的保护液使用在脱细胞角膜的制备中，结果发现，含甘油的保护液处理后角膜内的DNA成分未完全去除干净，有一定的残留；同时角膜硬度明显增加，失去角膜原有的柔软特性；角膜的透明度下降明显。同样，使用低分子海藻多糖替换透明质酸或硫酸软骨素制成的保护液的效果也不如本发明的保护液。
Claims (6)
1.一种脱细胞角膜制备用保护液，其特征在于，所述的保护液是添加有5-12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子量右旋糖酐的PBS或HBSS缓冲液，所述的脱细胞角膜制备用保护液渗透压为300-400mOsm。
2.如权利要求1所述的脱细胞角膜制备用保护液，其特征在于，所述的保护液pH值为7.2～7.4.
3.如权利要求1所述的脱细胞角膜制备用保护液，其特征在于，所述的脱细胞角膜制备用保护液中添加有妥布霉素。
4.如权利要求3所述的脱细胞角膜制备用保护液，其特征在于，所述的妥布霉素的添加量为1-3ml/L。
5.如权利要求1所述的脱细胞角膜制备用保护液，其特征在于，所述的透明质酸的添加量为5g/L、硫酸软骨素的添加量为15g/L、低分子量右旋糖酐的添加量为3g/L，pH值为7.2，渗透压为320mOsm。
6.权利要求1-5任一项所述的脱细胞角膜制备用保护液在制备脱细胞角膜中的应用。
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