CN106199008A - 一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异结合sICAM‑1的核酸适体及试剂盒。本发明提供的核酸适体，与sICAM‑1具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的sICAM‑1，将其制备成为相应的试剂盒，将用于眼病的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的特点，适合大规模的筛查。

Description

一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法。

背景技术

甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是内分泌科常见疾病之一，也是目前世界上治疗最为困难的疾病之一。TAO病程较长，各年龄段均可发生，以女性多发。轻者可影响生活、工作质量，损伤外貌，重者可导致视力下降，甚至失明，给患者带来了沉重的经济及心理负担。近年来，由于生活方式的改变，工作压力的增加，社会环境状况的变化，食用加碘盐的普及，以及不正规用药等因素，TAO的发病率明显上升，住院率高。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。

近年来的研究表明，细胞间粘附分子-1的表达与自身免疫甲状腺病免疫病理过程密切相关。甲状腺炎患者的甲状腺组织内浸润淋巴细胞、内皮细胞的sICAM-1和sICAM-1表达异常活跃。另外，发现伴有突眼的患者血清sICAM-1水平异常增高，这是因为患者眼球后组织强烈表达sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多与眶周炎症浸润程度密切相关。此外，研究还发现，在药物的治疗过程中，甲状腺功能和临床症状的好转与血清sICAM-1水平的下降并不同步，往往甲状腺功能的恢复在很大程度上要早于sICAM-1的恢复。综上所述，可溶性细胞间粘附分子-1的浓度变化可能对于判断GD的自身免疫紊乱水平、停药与否和是否复发等具有重要意义。细胞间粘附分子-1的表达与甲状腺相关眼病有直接关联，因此，检测细胞间粘附分子-1的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测细胞间粘附分子-1的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。

核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合sICAM-1的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。

所述核酸适体与sICAM-1蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测sICAM-1的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的sICAM-1，从而用于甲状腺相关眼病筛查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获sICAM-1进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：

5’-ACGACTAACGTGTAACAG(N39)CAGTGCATGATGCTACGAA-3’；N39代表39个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug sICAM-1蛋白(通过陈志鸿等，人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定中公开的方法，表达得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：

sICAM-1-1：

ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:1)

sICAM-1-2：

ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:2)

sICAM-1-3：

ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:3)

sICAM-1-4：

ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:4)

sICAM-1-5：

ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:5)

sICAM-1-6：

ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:6)

sICAM-1-7：

ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:7)

sICAM-1-8：

ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:8)

sICAM-1-9：

ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:9)

sICAM-1-10：

ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:10)

sICAM-1-11：

ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:11)

sICAM-1-12：

ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:12)

sICAM-1-13：

ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:13)

sICAM-1-14：

ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:14)

sICAM-1-15：

ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQ ID NO:15)

实施例2sICAM-1蛋白结合适配子的性能测定

将RNA适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的sICAM-1 37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与sICAM-1的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		sICAM-1-1	8.8
sICAM-1-2	8.9
		sICAM-1-3	9.0
sICAM-1-4	7.9
		sICAM-1-5	8.3
sICAM-1-6	8.2
		sICAM-1-7	8.9
sICAM-1-8	9.3
		sICAM-1-9	8.7
sICAM-1-10	8.1
		sICAM-1-11	8.0
sICAM-1-12	9.4
		sICAM-1-13	7.8
sICAM-1-14	8.6
		sICAM-1-15	8.9
PBS空白对照	无结合能力

实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，Lp-PLA2蛋白,与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与sICAM-1结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例4所述适配子疾病的诊断

将15个适配子分别与10个甲状腺相关眼病患者以及正常人的血液混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的sICAM-1蛋白的含量，通过分析发现，10个甲状腺相关眼病患者中sICAM-1蛋白的含量相对于正常人显著增加。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉李倩

〈120〉一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法

〈160〉14

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-1：

ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-2：

ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-3：

ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-4：

ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-5：

ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-6：

ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-7：

ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-8：

ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-9：

ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-10：

ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-11：

ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-12：

ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-13：

ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-14：

ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉sICAM-1-15：

ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA

Claims (5)

1.一种用于眼病检测的试剂盒，其特征在于：包含核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体为SEQ ID No：2所述。

3. SEQ ID No：2所述的适体在制备检测眼病的试剂盒中的应用。

4.如权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于：所述眼病为甲状腺相关眼病。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述眼病为甲状腺相关眼病。