CN106198965A - 一种检测ssat含量的体外检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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CN106198965A CN201610782907.7A CN201610782907A CN106198965A CN 106198965 A CN106198965 A CN 106198965A CN 201610782907 A CN201610782907 A CN 201610782907A CN 106198965 A CN106198965 A CN 106198965A
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Abstract

本发明涉及一种用于检测亚精胺/精胺乙酰转移酶(spermidine/spermine N1‑actyltransferase，简称SSAT)含量的方法，特别是一种检测SSAT含量的体外检测试剂盒及其检测方法。包括R1、R2试剂、SSAT标准品和SSAT质控品；R1、R2试剂为纳米金标记物R1、R2试剂，其中，实际用量为R1试剂比R2试剂比为1:3至3:1。本发明体外检测试剂盒利用纳米金与抗体结合的生物特性，与传统生化检测方法相结合，将其用于SSAT含量的体外检测，开辟了SSAT含量的体外诊断学新方法。

Description

一种检测SSAT含量的体外检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测亚精胺/精胺乙酰转移酶(spermidine/spermine N1-actyltransferase，简称SSAT)含量的方法，特别是一种检测SSAT含量的体外检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
多胺是人体中一类重要的含高密度正电荷的小分子有机化合物，包括腐胺、亚精胺和精胺，参与细胞内众多重要的生物学过程，如基因转录、蛋白合成、细胞周期等。
SSAT是多胺代谢途径的速度限制酶，含171个氨基酸残基，其同源二聚体为SSAT的活性形式，表面含有两个酶活性位点。SSAT为胞质酶，半衰期非常短(20-40min)，能被泛素化和蛋白酶体快速降解。
研究表明，多胺水平的高低与癌症、炎症、中风、肾衰和糖尿病等多种疾病密切相关，其含量的增加能促进肿瘤的发生、发展。SSAT在维持体内多胺代谢平衡中起重要作用。SSAT催化亚精胺/精胺的乙酰化反应，分别将它们转化为N1-乙酰亚精胺和N1-乙酰精胺，还可继续将N1-乙酰精胺乙酰化，生成N1,N12-二乙酰精胺。反应所需的乙酰基由乙酰CoA提供。亚精胺和精胺被转化为乙酰多胺，从而有效降低了细胞内的多胺水平。在正常情况下，细胞内SSAT含量极低，但在高多胺水平、多胺类似物处理和多种病理性刺激下，SSAT表达水平迅速增加，因为多胺或多胺类似物与SSAT结合后，SSAT的半衰期大大延长。SSAT含量的高低还与胰腺炎、再生组织生长障碍、肥胖、糖尿病等相关。有研究指出，SSAT持续性高表达能促进肿瘤发生，而急性诱导性SSAT高表达则能抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡。有报道患有伴X染色体病——棘状秃发性毛囊炎的病人的SSAT基因片段重复，因此推断可能与SSAT过表达有关；此外，还有研究显示自杀倾向的精神病人的SSAT表达有所减少。
SSAT含量的高低与人类健康密切相关。因此，SSAT定量检测具有十分重要的意义。
如果通过测定乙酰多胺产物的量间接测定SSAT含量，测定结果往往偏高，因为无法将SSAT乙酰化产物与其他蛋白的乙酰化产物区分；也可以测定SSAT专一催化的亚精胺N1位乙酰化产物的量，但需要结合使用SSAT抗血清，测定过程比较繁杂；有报道用14C标记乙酰辅酶A，进而测定含有14C的乙酰多胺产物来测定细胞粗提物中SSAT的含量，但此方法不适用于检测大量样本，且成本较高。
目前用于直接测定SSAT含量的方法报道较少，本研究开发的利用全自动生化分析仪检测SSAT含量的纳米金检测试剂盒，是一种廉价、方便的检 测技术，能够一次对大量样本进行检测，并且其检测的含量范围广。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测SSAT含量的体外检测试剂盒及其检测方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种检测SSAT含量的体外检测试剂盒，包括R1、R2试剂、SSAT标准品和SSAT质控品；R1、R2试剂为纳米金标记物R1、R2试剂，其中，R1试剂与R2试剂为1:3至3:1。
所述纳米金标记物R1、R2试剂是针对重组人SSAT抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体经纳米金标记所得。
所述R1试剂为单偶联5F4的纳米金的保存液，R2试剂为单偶联2D6的纳米金的保存液；其中，R1试剂中5F4的添加量为5-40μg/mL，R2试剂中2D6的添加量为5-40μg/mL。
其中，纳米金标记物R1、R2试剂是针对重组人SSAT抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体经纳米金标记所得，鼠抗人单克隆抗体包含2D6和5F4。所述鼠抗人单克隆抗体2D6和5F4均与SSAT抗原特异性结合。
R1和R2试剂的具体制备方法为：取1mL纳米金加0-10.5μL的0.2M K2CO3，混匀后再加入10-25μg的5F4或2D6抗体，迅速混匀静置10-20min，加入10-20μL BSA，再次混匀静置10-20min，7000-9000r/min离心5-10min，弃上清，沉淀用1-2mL复溶液复溶即得R1、R2试剂。
所述R1、R2试剂中保存液按重量百分比计，均为Tris 0-0.6％、BSA 0.2-3％、PEG-20000 0.1-0.5％、海藻糖0.5-8％、PVP-40 0-1.5％、Tween-80 0-0.5％、叠氮钠0.02-0.1％，PEG 6000 1-5％，NaCl 0.6-1.6％，余量组分为水。
所述SSAT标准品为重组人SSAT抗原经纯化所得的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组酶；SSAT质控品为重组人SSAT抗原经纯化所得的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组酶或含有该酶的样本。
所述重组人SSAT抗原经纯化所得的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组酶为将产精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，而后将种子培养液按体积比3～10％的接种量接种至表达培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时，摇床转速150～200r/min；而后向表达培养基中添加诱导剂，于20～30℃振荡诱导培养14～22h，摇床转速150～200r/min，所得培养液离心后收集上清液，即为胞外粗提重组酶SSAT；沉淀离心收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗提重组酶SSAT；将获得胞外和胞内粗提重组酶经纯化，即可。
所述产精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组大肠杆菌BL21(DE3)为将经密码子优化的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)基因(SEQ ID No.1)两端进行修饰，而后与pET-39b(+)载体连接，连接后转化到大肠杆菌感受态细胞，得到重组大肠杆菌，待用。
所述表达培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，MgCl2 0～0.83g，KCl 0～0.186g，ZnCl2 0～0.186g，50％的甘油0～20％，50％的蔗糖0～20％，50％的葡萄糖0～20％，精氨酸0～10mM，半胱氨酸0～10mM，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl。
所述表达培养基中添加的诱导剂为每升所述表达培养基0～5g，其中诱导剂为IPTG或乳糖。
种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl 9～11g，其余成分为水。
一种利用检测SSAT含量的体外检测试剂盒检测的方法，利用抗原抗体反应产生凝集，再通过纳米金和乳胶颗粒经微粒放大信号的原理检测样本中SSAT的含量。
原理：本试剂盒采用双抗体夹心免疫比浊法原理，SSAT抗原与标记在纳米金上的抗SSAT单克隆抗体特异性结合，使纳米金聚集形成免疫复合物，通过生化分析仪可测定溶液浊度，浊度与复合物的含量成正比，可通过测定标准品，建立一条反应度对应浓度的标准曲线，即可测定SSAT含量。其中R1和R2分别标记可同SSAT特异性结合的抗体，试剂盒中的SSAT标准品用于检测过程中的标准曲线的建立，SSAT质控品用于的标准曲线及试剂盒进行质量控制。
本发明所具有的优点：本发明所采用的体外检测试剂盒的内容物中包括针对SSAT的特异性单克隆抗体和纳米金标记测定所需试剂，与新型纳米金免疫检测方法相结合，用于检测人体SSAT含量的体外检测，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响等优势。
附图说明
图1是SSAT生化检测产品标准曲线。
图2为SSAT酶SDS-PAGE图；其中，M为蛋白标准；1号泳道为SSAT酶表达沉淀、2号泳道为SSAT酶表达上清。
图3为诱导剂浓度图；其中，M为蛋白标准；1号泳道为加入0.1g/L乳糖诱导的SSAT酶表达沉淀、2号泳道为0.1g/L乳糖诱导的SSAT酶表达上清、3号泳道为加入0.7mM IPTG诱导的SSAT酶表达沉淀、4号泳道为0.7mM IPTG诱导的SSAT酶表达上清、5号泳道为未加入诱导剂的SSAT酶表达沉淀、6号泳道为未加入诱导剂的SSAT酶表达上清。
具体实施方式
下列实施例应被理解被仅仅是举例说明性的，而不是以任何方式限制本发明。
实施例1
试剂盒包括R1试剂，R2试剂，标准品和质控品；其中R1试剂与R2试剂体积比为＝150：150；
其中，R1试剂为2mL纳米金、20μg 5F4抗体和2mL R1保护液；
R2试剂为2mL纳米金、20μg 2D6抗体和2mL R1保护液；
R1、R2保护液按重量百分比计为：0.5％Tris、0.5％BSA、0.5％PEG-20000、5％海藻糖、1％PVP-40、0.01％Tween-80、4％PEG6000、1％NaCl、0.05％的叠氮钠，余量组分为水。
所述R1试剂的配制，取2mL纳米金加7μL的0.2M K2CO3；混合后加入20μg 5F4抗体，混匀静置10min；再加10μL封闭液(20％BSA)进行封闭，再次混匀静置10min；离心5min，转速为8000r/min，弃上清，沉淀用2mL R1保护液复溶。
所述R2试剂的配制，取2mL纳米金加7μL的0.2M K2CO3；混合后加入20μg2D6抗体，混匀静置10min；再加10μL封闭液(20％BSA)进行封闭，再次混匀静置10min；离心5min，转速为8000r/min，弃上清，沉淀用2mL R1保护液复溶。
精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)基因密码子的优化，根据大肠杆菌密码子的偏好性表和经验，对精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)基因密码子的优化。优化结果如序列所示。
精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)基因的克隆，优化的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)由生物技术有限公司合成。在该基因的两端设计酶切位点，分别为BamH I和XhoI，将该基因连接在pET-39b(+)载体上。将构建成功的重组表达载体pET39b-p.MD-SSAT转化到大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，在培养平板上筛选阳性克隆。
将上述鉴定正确的重组阳性克隆接种于种子培养基中，37℃振荡培养12h小时。将上述培养所得活化种子液按体积百分比6％的接种量接种至3瓶表达培养基，于30℃振荡培养，摇床转速180r/min；培养至1号瓶OD600＝0.639、2号瓶OD600＝0.667和3号瓶OD600＝0.633，再向2号瓶中添加0.7mM的诱导剂IPTG，3号瓶中添加0.1g/L的诱导剂乳糖，1号瓶中不添加任何诱导剂，于20℃振荡诱导培养18h，摇床转速160r/min表达完毕；8000r/min离心5min收集菌体，称重后加入湿菌种(g)×20倍的PBS缓冲液，进行超声破碎；12000r/min、4℃离心10min，收集上清。
将上述超声破碎后离心收集的发酵菌体，使用PBS缓冲液(pH7.4)重悬菌体，重悬后对菌体进行冰浴，同时进行超声破碎。收集破碎产物12000rpm，4℃离心20min，收集离心上清，0.45μm过滤。
使用PBS缓冲液平衡Ni-NTA色谱柱，将过滤后含有SSAT重组蛋白的样本上样，上样完成后使用PBS+25mM咪唑缓冲液(pH7.4)漂洗色谱柱，使用PBS+250mM咪唑缓冲液(pH7.4)洗脱目的蛋白，观察紫外吸收变化情况，收集蛋白。
使用PBS(pH7.4)缓冲液平衡Sephadex G25色谱柱，将目的蛋白上样，上样完成后使用PBS缓冲液冲洗色谱柱，观察紫外吸收变化情况，收集SSAT蛋白纯品，并使用蛋白浓度检测试剂盒对SSAT浓度进行确认。
上述，种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g， 其余成分为水。
表达培养基成分按克/升计为：蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，MgCl20.39g，KCl0.186g，50％的甘油2％，半胱氨酸80mM，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl。
5F4、2D6的获得：
1选择纯种Bal B/C小鼠，SSAT抗原加佐剂：
初次免疫，抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(0.4ml,0.1ml/点)；3周后第二次，免疫剂量同上，佐剂使用弗氏不完全佐剂；3周后第三次免疫，剂量及试剂同第二次免疫，(7天后采血测其效价)；3周后加强免疫，剂量50～100μg为宜，静脉内注射；3天后无菌取脾脏，使用RPMI1640无血清培养液洗一次，脾脏研碎，过细胞筛，离心，脾细胞用RPMI1640无血清培养液洗2次，计数，取1×108脾淋巴细胞悬液备用。(细胞融合前一天制备饲养细胞，使用Bal B/C鼠，向其腹腔注入10ml RPMI1640无血清培养液，按揉3分钟，吸出培养液洗一次，计数，按每孔2万个饲养细胞量铺96孔细胞培养板，备用)
2制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心，用RPMI1640无血清培养液洗2次，计数，取得1×107细胞备用。
3融合
①骨髓瘤细胞与脾细胞按细胞个数比1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用RPMI1640无血清培养液洗1次，离心，1200rpm,8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
②90s内加入37℃预温的1ml 45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
③加37℃预热的RPMI1640无血清培养液，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④离心，800rpm,6min。
⑤弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。
⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
⑦将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
4脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，在用HAT选择培养液培养1～2天内，将有大量骨髓瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交瘤细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
5使用ELISA方法对抗体活性进行鉴定。
6亚克隆
(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。
(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹吸成细胞悬液，计数。
(3)调整细胞浓度为10～40个细胞/ml。
(4)取前一天准备好饲养细胞的培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5％CO2培养箱中。
(5)在第7天换液，以后每2～3天换液1次。
(6)8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。
(7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
(8)再将细胞扩至175培养瓶中，备制备腹水用。
(9)向Bal B/C鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。
(10)腹水经纯化后可得单克隆SSAT抗体纯品。通过免疫层析方法筛选不同克隆的抗体，经筛选配对使用5F4、2D6作为本试剂盒使用配对抗体。
将纯化后的不同克隆的抗体分别标记在纳米金和包被NC膜上，所有抗体标记工艺均为1mL纳米金中加入7μL 0.2M K2CO3后加入20μg抗体，标记后离心加入100μL复溶液悬浮，复溶液成分为40mM tris、1g/L PEG20000、1g/L PVP40、40g/L海藻糖，悬浮后喷在玻璃纤维上，45℃烘干30min,所有包被工艺均使用10mM PBS PH＝7.2将抗体稀释至1mg/mL后包被在NC膜上，37℃烘干15min,将结合了不同抗体的纳米金-玻璃纤维和NC膜配对做成试纸条后加入浓度为10μg/mL SSAT样本和0.5％Casein-na，挑选0.5％Casein-na不显色，同时10μg/mL SSAT样本显色最深的配对抗体。按照该方法进行筛选得出5F4、2D6最佳配对。
所述SSAT标准品是使用含20％BSA、120mM壳聚糖溶液梯度稀释SSAT重组蛋白纯品浓度为0、5、10、15、20μg/mL 5个浓度。
所述质控品是使用小牛血清稀释SSAT重组蛋白至10μg/mL、15μg/mL两个浓度。
纳米金为按照现有柠檬酸三钠还原氯金酸法制备获得。
SEQ ID No.1
(a)序列特征：
*长度：513bp
*类型：核苷酸
*链型：单链
*拓扑结构：直链
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工设计
实施例2
采用上述实施例的体外检测试剂盒进行体外检测：
(1)采取人体静脉血4mL于EDTA或肝素钠抗凝管中，再加入4mL淋巴细胞分离液混合，4℃2500rpm离心10min，分离淋巴细胞，分离后用生理盐水洗涤3次，每次4℃、1500rpm离心10min，最后一次离心后的细胞用生理盐水重悬，细胞破碎仪破碎处理后4℃2500rpm离心10min，吸取上清备用。
(2)取出R1试剂、R2试剂放置室温下至温度平衡；
(3)将R1、R2试剂和SSAT标准品放在生化分析仪相应的位置，制定标准曲线(表1和参见图1)；
表1
浓度(μg/mL) 0 5 10 15 20
反应度(第一次) 0.0045 0.0119 0.0238 0.0411 0.0758
反应度(第二次) 0.0026 0.0110 0.0246 0.0426 0.0751
平均值 0.0036 0.0115 0.0242 0.0419 0.0755
(4)通过全自动生化分析仪检测SSAT质控品，设置加入R1试剂150μL，R2试剂150μL，加入样本5μL，第22点作为第一点检测，第45点为第二点检测，以两点差值为检测值，通过标准曲线回归，确定检测结果有效性(参见表2)；
表2
(5)用全自动生化分析仪检测SSAT样本，设置加入R1试剂150μL，R2试剂150μL，加入样本5μL，第22点作为第一点检测，第45点为第二点检测，以两点差值为检测值，通过标准曲线回归得出最终结果；
(6)检测SSAT样本检测结果如下表3所示
表3
从表3可以看出，本方法检测样本的SSAT含量于理论值的相差不大，相对偏差不超过±10％。
其它未举例的试剂盒成分的制备方法，在上述制备方法的指引下能很容易地实现，此处不再冗述。
应当理解的是，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明的权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换、简单组合等多种变行，本发明的权利保护范围应以所述权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：包括R1、R2试剂、SSAT标准品和SSAT质控品；R1、R2试剂为纳米金标记物R1、R2试剂，其中，R1试剂与R2试剂为1:3至3:1。
2.按权利要求1所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述纳米金标记物R1、R2试剂是针对重组人SSAT抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体经纳米金标记所得。
3.按权利要求2所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述R1试剂为单偶联5F4的纳米金的保存液，R2试剂为单偶联2D6的纳米金的保存液；其中，R1试剂中5F4的添加量为5-40μg/mL，R2试剂中2D6的添加量为5-40μg/mL。
4.按权利要求3所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述R1、R2试剂中保存液按重量百分比计，均为Tris0-0.6％、BSA0.2-3％、PEG-20000 0.1-0.5％、海藻糖0.5-8％、PVP-40 0-1.5％、Tween-80 0-0.5％、叠氮钠0.02-0.1％，PEG 6000 1-5％，NaCl0.6-1.6％，余量组分为水。
5.按权利要求1所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述SSAT标准品为重组人SSAT抗原经纯化所得的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组酶；SSAT质控品为重组人SSAT抗原经纯化所得的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组酶或含有该酶的样本。
6.按权利要求5所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述重组人SSAT抗原经纯化所得的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组酶为将产精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，而后将种子培养液按体积比3～10％的接种量接种至表达培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时；而后向表达培养基中添加诱导剂，于20～30℃振荡诱导培养14～22h，所得培养液离心后收集上清液，即为胞外粗提重组酶SSAT；沉淀离心收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗提重组酶SSAT；将获得胞外和胞内粗提重组酶经纯化，即可。
7.按权利要求6所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述产精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)的重组大肠杆菌BL21(DE3)为将经密码子优化的精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)基因(SEQ ID No.1)两端进行修饰，而后与pET-39b(+)载体连接，连接后转化到大肠杆菌感受态细胞，得到重组大肠杆菌，待用。
8.按权利要求6所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述表达培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，MgCl20～0.83g，KCl0～0.186g，ZnCl20～0.186g，50％的甘油0～20％，50％的蔗糖0～20％，50％的葡萄糖0～20％，精氨酸0～10mM，半胱氨酸0～10mM，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl。
9.按权利要求6所述的检测SSAT含量的体外检测试剂盒，其特征在于：所述表达培养基中添加的诱导剂为每升所述表达培养基0～5g，其中诱导剂为IPTG或乳糖。
10.一种权利要求1所述的利用检测SSAT含量的体外检测试剂盒检测的方法，其特征在于：利用抗原抗体反应产生凝集，再通过纳米金和乳胶颗粒经微粒放大信号的原理检测样本中SSAT的含量。
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