CN106198802A - 一种苦豆子生物总碱的质量控制方法 - Google Patents
一种苦豆子生物总碱的质量控制方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药材的质量检测技术领域,具体涉及一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,该方法利用一测多评法,以苦豆子生物总碱中的槐定碱作为内参物,计算槐定碱与其他7种具有中药活性的生物碱的相对校正因子,进而测定出苦豆子生物总碱中的其他7种生物碱的含量。与现有技术相比,本发明的方法检测灵敏度高,稳定性好,可以客观、全面、准确地评价苦豆子总生物碱的质量,可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制中药材及其制剂质量的问题,对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及中药材的质量检测技术领域,具体涉及一种苦豆子生物总碱的质量控制方法。
背景技术
中药质量控制和评价的难题在于中药多成分的复杂性,由于单一成分或指标评价难以表征中药的质量,而多成分质量控制的方法需要较多的对照品。由于中药化学对照品分离难度大或单体不稳定、难以供应、成本高等因素,使得多成分质量控制的实施存在诸多困难。
为此,研究者提出了适应中药特点的多指标质量评价的新模式——一测多评法(quantitative assay of mμlti-components by single marker,QAMS)用以解决中药质量评价过程中所存在的对照品使用较多的问题。QAMS通过借鉴内标法、校正因子法、主成分自身对照法、以及紫外百分吸收系数法等研究方法,依据一定范围(线性范围)内成分的量(如质量、浓度)与检测器响应成正比的原理,即W=f×A,选用样品中某一典型成分的对照品,借助该成分与供试品中另一成分或其他多成分间的关系,引入相对校正因子(relativecorrection factor,RCF)的概念(其中,As、Ai分别为内参物、待测物峰面积或峰高,Cs、Ci分别为内参物、待测物的浓度),对供试品中其他成分进行测定的方法。研究多采用相对保留时间作为评价的指标。
苦豆子总生物碱(TASA)是中药苦豆子的主要活性成分,主要包括槐定碱、槐果碱、氧化苦参碱、苦参碱、莱曼碱、苦豆碱、金花雀碱、氧化槐果碱等。这些生物碱具有广泛的药理作用,如抗炎、抗癌、免疫调节、抗恶质等。现有技术中,苦豆子总生物碱的质量评价主要是以单一的槐定碱作为指标,但是,由于其他活性成分如苦参碱、莱曼碱、氧化槐果碱也具有一定的含量,因此,现有技术以槐定碱的单一成分作为苦豆子总生物碱的评价指标,难以准确地表征苦豆子总生物碱的所有活性成分。目前,国内外尚未有将“一测多评法”应用于苦豆子总生物碱以及建立相关的质量控制方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,该方法能够准确地评价苦豆子总生物碱的质量,可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制中药材及其制剂质量的问题。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
提供一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,采用一测多评法,以苦豆子生物总碱中的槐定碱作为内参物,检测苦豆子生物总碱中的苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的质量,具体包括以下步骤:
(1)对照品溶液的配制:
分别精密称定槐定碱、苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱,置于容量瓶内,用KH2PO4溶液溶解并定容,然后过滤,分别获得槐定碱、苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的对照品溶液,备用;
(2)供试品溶液的配制:
精密称定一定量的苦豆子总生物碱样品,置于容量瓶内,用KH2PO4溶液溶解并定容,然后过滤,获得苦豆子总生物碱的供试品溶液,备用;
(3)校正因子RCF的计算:
取步骤(1)制备得到的混合对照品溶液,进样2,4,8,12,16,20μl,用高效液相色谱测定色谱图并计算峰面积,选取槐定碱作为内参物,分别计算苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的校正因子RCFkm。
(4)样品中活性成分的测定
取步骤(2)制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱进行测定,获得色谱图,按以下公式分别计算出苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的质量;
所述公式为:Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),式中Ak为槐定碱内参物的峰面积,Wk为槐定碱内参物的质量;Am为被测组分的峰面积,Wm为被测组的质量,RCFkm为苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的校正因子。。
优选的,所述步骤(2)和步骤(4)中,高效液相色谱的测定条件是:以乙腈为流动相A和KH2PO4溶液为流动相B所组成的梯度洗脱液按照下表的洗脱程序进行梯度洗脱:
时间/min | 0 | 25 | 60 | 65 |
流动相A/% | 5 | 5 | 12 | 5 |
流动相B/% | 95 | 95 | 88 | 95 |
其中,柱温为30℃,流速为1ml/min,进样量为20μl,检测波长为205nm。
优选的,所述步骤(1)和步骤(2)中,所述过滤是采用0.2~0.25um的滤膜过滤。
优选的,所述过滤是采用0.22um的滤膜过滤。
优选的,所述KH2PO4溶液为含有2ml/L三乙胺的浓度为0.05mol/L的KH2PO4溶液,其中三乙胺在流动相B中作为扫尾剂,苦豆子总生物碱属于一种生物总碱,用高效液相色谱仪检测时,峰形会出现拖尾现象,而三乙胺能有效改善拖尾现象,对色谱峰的积分计算更准确。
本发明以槐定碱为内参物,计算苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱不同进样量下所得的相对校正因子RCF,并在三台不同的色谱仪及三根不同的色谱柱上考察相对校正因子的重现性。
以Pearson相关系数评价本发明的检测结果是否与外标法所得结果具有相关性。
本发明的原理如下:
本发明利用一测多评方法,即通过测定苦豆子总生物碱中的一个成分,实现对其他7个生物碱成分定量的方法。依据一定的线性范围内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即:W=RCF×A。以苦豆子总生物碱中某一典型组分(如槐定碱)作为内参物,建立该组分与其他组分之间的相对校正因子,通过校正因子计算其他组分的含量。
如苦豆子总生物碱中含有i个组分,则存在:
Wi/Ai=RCFi(i=1,2,…,k,…,m)
式中Ai为组分i的峰面积;Wi为i组分的量。
选取其中槐定碱k为内标,建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子,有相对校正因子RCFkm=RCFk/RCFm=(Wk×Am)/(Wm×Ak),由此可导出定量计算公式:
Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),
式中Ak为内参物峰面积,Wk为内参物量;Am为组分m的峰面积,Wm为组分m的量,RCFkm为相对校正因子。
本发明的有益效果是:
本发明利用一测多评法,以苦豆子生物总碱中的槐定碱作为内参物,计算槐定碱与其他7种具有中药活性的生物碱(金花雀碱、苦豆碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱及莱曼碱)的相对校正因子,进而测定出苦豆子生物总碱中的其他7种生物碱的含量。与现有技术以槐定碱单一成分作为苦豆子总生物碱的评价指标的方法相比,本发明的方法检测灵敏度高,稳定性好,可以客观、全面、准确地评价苦豆子总生物碱的质量,可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制中药材及其制剂质量的问题,对控制质量和保证临床疗效具有重要意义;本发明的方法具有简便、快捷、易于普及和掌握的优点。
附图说明
图1是本发明的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法的空白溶剂(流动相B)的高效液相色谱图。
图2是本发明的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法的对照品溶液的高效液相色谱图。
图3是本发明的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法的供试品溶液的高效液相色谱图。
图2和图3中:
色谱峰归属:1——金花雀碱;2——苦豆碱;3——槐定碱;4——氧化苦参碱;5——氧化槐果碱;6——苦参碱;7——槐果碱;8——莱曼碱
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
本发明的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,采用一测多评法,以苦豆子生物总碱中的槐定碱作为内参物,检测苦豆子生物总碱中的苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的质量,具体包括以下步骤:
(1)对照品溶液的配制:
分别精密称定对照品槐定碱、苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱,置于5ml容量瓶内,分别用0.05mol/LKH2PO4(含2ml/L三乙胺)溶解并定容至刻度,然后分别过0.22um滤膜,获得浓度为0.2914mg/ml的槐定碱对照品溶液、0.4714mg/ml的苦参碱对照品溶液、0.2700mg/ml的金花雀碱对照品溶液、0.2586mg/ml的槐果碱对照品溶液、0.2500mg/ml的氧化槐果碱对照品溶液、0.4171mg/ml的苦豆碱对照品溶液、0.5171mg/ml的氧化苦参碱对照品溶液以及0.3943mg/ml的莱曼碱对照品溶液,备用。
(2)供试品溶液的配制:
精密称定16.4mg的苦豆子总生物碱样品,用0.05mol/LKH2PO4(含2ml/L三乙胺)溶解并定容至5ml容量瓶内,过0.22um滤膜,获得供试品溶液,备用。
(3)液相色谱图的获取:
以流动相B作为空白溶剂,取步骤(1)和步骤(2)制备得到的对照品溶液、供试品溶液分别进行高效液相色谱检测,获得色谱图(如图1、图2和图3所示),所用高效液相色谱参数设置如下:
仪器:安捷伦1200高效液相色谱仪;
色谱柱:DIKMA 5C18色谱柱(250*4.6mm)色谱柱;
流动相:乙腈(流动相A)-0.0 5mol/L KH2PO4(含2ml/L三乙胺)(流动相B);
流速:1.0mL/min;
进样量:10μl;
检测器:二极管阵列检测器(PDA),扫描范围190-400nm;
检测波长:205nm;
流动相的梯度洗脱程序如表1所示:
表1.HPLC梯度洗脱表
停止时间:65min,后运行时间15min。
(4)校正因子RCFkm的计算
取步骤(1)制备得到的对照品溶液,进样2,4,8,12,16,20μl,用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积计算,选取槐定碱作为内参物,分别计算金花雀碱、苦豆碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱、莱曼碱的校正因子RCFkm(见表2)。
(5)校正因子重现性考察:
考察各对照品溶液在三台不同色谱仪及三根不同色谱柱中的相对校正因子RCF,所得RCF的RSD%小于5%,表明色谱仪及色谱柱对相对校正因子的测定没有明显影响(见表3和表4)。
(6)色谱峰的定位:
考察各对照品溶液在三台不同色谱仪及三根不同色谱柱中的相对保留时间tR,所得tR的RSD%小于5%(见表5)。
(7)样品中生物碱活性成分的测定:
制备6份供试品溶液注入高效液相色谱进行测定,获得色谱图,按以下公式计算有效成分含量:
Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),式中Ak为槐定碱内参物峰面积,Wk为槐定碱内参物质量;Am为被测组分m的峰面积,Wm为被测组分m的质量,RCFkm为苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的校正因子。
(8)对测定结果进行比较:
以Pearson相关系数表征本发明的方法与外标法所得结果的相关性(见表6),根据表6的Pearson相关系数可知,本发明的方法与外标法所得结果无显著差异。
表2.苦豆子总生物碱的校正因子
表3.不同色谱仪对校正因子的影响
表4.不同色谱柱对校正因子的影响
表5不同仪器和色谱柱测得的相对保留时间
表6.一测多评法与外标法测定结果比较(mg/g)
本发明的方法检测灵敏度高,稳定性好,可以客观、全面、准确地评价苦豆子总生物碱的质量,可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制中药材及其制剂质量的问题,对控制质量和保证临床疗效具有重要意义,而且具有简便、快捷、易于普及和掌握的优点。
最后应当说明的是,以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,其特征在于:采用一测多评法,以苦豆子生物总碱中的槐定碱作为内参物,检测苦豆子生物总碱中的苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的质量,具体包括以下步骤:
(1)对照品溶液的配制:
分别精密称定槐定碱、苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱,置于容量瓶内,用KH2PO4溶液溶解并定容,然后过滤,分别获得槐定碱、苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的对照品溶液,备用;
(2)供试品溶液的配制:
精密称定一定量的苦豆子总生物碱样品,置于容量瓶内,用KH2PO4溶液溶解并定容,然后过滤,获得苦豆子总生物碱的供试品溶液,备用;
(3)校正因子RCF的计算:
取步骤(1)制备得到的混合对照品溶液,进样2,4,8,12,16,20μL,用高效液相色谱测定色谱图并计算峰面积,选取槐定碱作为内参物,分别计算苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的校正因子RCFkm。
(4)样品中活性成分的测定
取步骤(2)制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱进行测定,获得色谱图,按以下公式分别计算出苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的质量;
所述公式为:Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),式中Ak为槐定碱内参物的峰面积,Wk为槐定碱内参物的质量;Am为被测组分的峰面积,Wm为被测组的质量,RCFkm为苦参碱、金花雀碱、槐果碱、氧化槐果碱、苦豆碱、氧化苦参碱、莱曼碱的校正因子。
2.根据权利要求1所述的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,其特征在于:所述步骤(2)和步骤(4)中,高效液相色谱的测定条件是:以乙腈为流动相A和KH2PO4溶液为流动相B所组成的梯度洗脱液按照下表的洗脱程序进行梯度洗脱:
其中,柱温为30℃,流速为1ml/min,进样量为20μl,检测波长为205nm。
3.根据权利要求1所述的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,其特征在于:所述步骤(1)和步骤(2)中,所述过滤是采用0.2~0.25um的滤膜过滤。
4.根据权利要求3所述的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,其特征在于:所述过滤是采用0.22um的滤膜过滤。
5.根据权利要求1或2所述的一种苦豆子生物总碱的质量控制方法,其特征在于:所述KH2PO4溶液为含有2ml/L三乙胺的浓度为0.05mol/L的KH2PO4溶液。
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