CN106191234A - 一种microRNA‑208b的快速检测方法 - Google Patents

一种microRNA‑208b的快速检测方法 Download PDF

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黄红宇
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Abstract

本发明涉及一种microRNA‑208b的快速检测方法，属于生物检测技术领域，该microRNA‑208b的快速检测方法根据待测靶标microRNA‑208b的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，从而获得与待测靶标microRNA‑208b相对应的Taqman探针，而后将患者血清、RNase‑free水、DSN酶、Taqman探针和RNA酶抑制剂按照一定的比例在特定的条件下进行反应，在激光的激发作用下，检测出反应液的荧光强度，即得到待测靶标microRNA‑208b的检测结果，该检测方法大大缩短了心肌损伤标志物microRNA‑208b的检测时间，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。

Description

一种microRNA-208b的快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种microRNA-208b的快速检测方法。
背景技术
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。该病在欧美最为常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。
由此可见，急性心肌梗死的早期检测是尤为重要的，在现有的研究中，急性心肌梗死的早期检测包括对microRNA-499的检测、microRNA-208b的检测、microRNA-1的检测以及microRNA-133a的检测。
现有技术中，对上述四个心肌损伤标志物的检测通常需要采用1小时的microRNA的抽提、1.5小时的逆转录以及1.5小时的Real-time PCR(荧光定量聚合酶链反应)，一个心肌损伤标志物的检测时间至少要4个小时，从检测开始到得到检测结果的时间很长，众所周知的，对人体疾病的检测，时间的长短尤为重要；另外，现有技术中，对上述的四个心肌损伤标志物的检测步骤也较为繁琐，工作量非常大；漫长的检测过程不仅仅会让病人等待的更为烦躁，也让检测的医护人员感到身心俱疲。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供一种microRNA-208b的快速检测方法，应用于急性心肌梗死的心肌损伤标志物的检测中，以克服采用现有技术中的检测方法检测microRNA-208b这个心肌损伤标志物导致检测时间很长、工作量较大的问题，从而大大缩短了microRNA-208b这个心肌损伤标志物的检测时间，并且简化了上述microRNA-208b这个心肌损伤标志物的检测方法，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种microRNA-208b的快速检测方法，其中，包括：
备料：准备好患者血清、RNase-free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；
设计探针：根据待测靶标microRNA-208b的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在所述单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，获得浓度为200nmol/uL的Taqman探针；
反应：将所述患者血清、所述RNase-free水、所述DSN酶、所述Taqman探针和所述RNA酶抑制剂按照100:278:2:20:1的配比进行混合，在85℃的反应温度下反应25分钟；
检测：根据相应Taqman探针设置反应所需的激发波长和发射波长，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到所述患者血清中的microRNA-208b的检测结果；
其中，与所述microRNA-208b完全互补的单链DNA序列为：ACAAAC CTT TTG TTCGTC TTAT。
上述的microRNA-208b的快速检测方法，其中，所述患者血清的收集包括：获取患者的静脉血5mL，以3000rpm离心10min，分离血清用于检测。
上述的microRNA-208b的快速检测方法，其中，所述荧光基团为：5'-TAMRA。
上述的microRNA-208b的快速检测方法，其中，所述荧光淬灭基团：Eclipse-3'。
上述的microRNA-208b的快速检测方法，其中，所述Taqman探针为：5'-TAMRA-ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT-Eclipse-3'；
其中，TAMRA染料的激发波长为542nM，发射波长为568nM，且检测步骤中的激发波长和发射波长与所述TAMRA染料的激发波长和发射波长相同。
上述技术方案具有如下优点或者有益效果：
本发明提供的microRNA-208b的快速检测方法，根据待测靶标microRNA-208b的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，从而获得与待测靶标microRNA-208b相对应的Taqman探针，而后将患者血清、RNase-free水、DSN酶、Taqman探针和RNA酶抑制剂按照一定的比例在特定的条件下进行反应，在激光的激发作用下，检测出反应液的荧光强度，即得到待测靶标microRNA-208b的检测结果，该检测方法极为简单，且用时较少，从而克服了采用现有技术中的检测方法检测microRNA-208b这个心肌损伤标志物导致检测时间很长、工作量较大的问题，大大缩短了上述microRNA-208b这个心肌损伤标志物的检测时间，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明及其特征、外形和优点将会变得更加明显。在全部附图中相同的标记指示相同的部分。并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本发明的主旨。
图1是本发明实施例2提供的microRNA-208b的快速检测方法中不同浓度的microRNA-208b标准品荧光强度的变化示意图；
图2是本发明实施例2提供的microRNA-208b的快速检测方法中microRNA-208b标准品浓度与荧光强度的相关性示意图；
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但是不作为本发明的限定。
实施例1：
本发明实施例1提供的microRNA-208b的快速检测方法包括：
备料：准备好患者血清、RNase-free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；
设计探针：根据待测靶标microRNA——microRNA-208b的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列(ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT)，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团(5'-TAMRA)和荧光淬灭基团(Eclipse-3')，获得浓度为200nmol/ul的Taqman探针——Probe microRNA-208b：5'-TAMRA-ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT-Eclipse-3'；
反应：将50ul的患者血清、139ul的RNase-free水、1ul的DSN酶、10ul的Taqman探针Probe microRNA-208b和0.5ul的RNA酶抑制剂进行混合配置成反应体积，在85℃的反应温度下反应25分钟；
检测：由于Taqman探针Probe microRNA-208b中的TAMRA染料的激发波长为542nM、发射波长为568nM，故设置反应所需的激发波长为542nM、发射波长568nM，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到患者血清中的microRNA-208b的检测结果。
在本发明实施例1提供的的microRNA-208b的快速检测方法中，患者血清的收集包括：获取患者的静脉血5mL，将静脉血放置于4℃冰箱中静置30min，以3000rpm离心10min，而后收集上清液于无菌RNA-free的EP管中，存储于-80℃的冰箱中备用，用于检测。
图1是本发明实施例1提供的microRNA-208b的快速检测方法中不同浓度的microRNA-208b标准品荧光强度的变化示意图；由图可知，发射波长在568nM左右时，不同浓度的microRNA-208b标准品荧光强度均处于峰值，因此，在发射波长为568nM时，可以很好的检测到反应液中的荧光强度。
图2是本发明实施例1提供的microRNA-208b的快速检测方法中
microRNA-208b标准品浓度与荧光强度的相关性示意图；由图可知，浓度范围在1E-12Mol～1E-6Mol的microRNA-208b标准品，荧光强度的变化是呈线性变化的。
综上所述，本发明实施例1提供的microRNA-208b的快速检测方法，根据待测靶标microRNA-208b的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，从而获得与待测靶标microRNA-208b相对应的Taqman探针，而后将患者血清、RNase-free水、DSN酶、Taqman探针和RNA酶抑制剂按照一定的比例在特定的条件下进行反应，在激光的激发作用下，检测出反应液的荧光强度，即得到待测靶标microRNA-208b的检测结果，该检测方法极为简单，且用时较少，从而克服了采用现有技术中的检测方法检测microRNA-208b这个心肌损伤标志物导致检测时间很长、工作量较大的问题，大大缩短了上述microRNA-208b这个心肌损伤标志物的检测时间，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。
本领域技术人员应该理解，本领域技术人员结合现有技术以及上述实施例可以实现所述变化例，在此不予赘述。这样的变化例并不影响本发明的实质内容，在此不予赘述。
以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (5)

1.一种microRNA-208b的快速检测方法，其特征在于，包括：
备料：准备好患者血清、RNase-free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；
设计探针：根据待测靶标microRNA-208b的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在所述单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，获得浓度为200nmol/uL的Taqman探针；
反应：将所述患者血清、所述RNase-free水、所述DSN酶、所述Taqman探针和所述RNA酶抑制剂按照100:278:2:20:1的配比进行混合，在85℃的反应温度下反应25分钟；
检测：根据相应Taqman探针设置反应所需的激发波长和发射波长，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到所述患者血清中的microRNA-208b的检测结果；
其中，与所述microRNA-208b完全互补的单链DNA序列为：ACA AAC CTT TTG TTC GTCTTA T。
2.如权利要求1所述的microRNA-208b的快速检测方法，其特征在于，所述患者血清的收集包括：获取患者的静脉血5mL，以3000rpm离心10min，分离血清用于检测。
3.如权利要求1所述的microRNA-208b的快速检测方法，其特征在于，所述荧光基团为：5'-TAMRA。
4.如权利要求1所述的microRNA-208b的快速检测方法，其特征在于，所述荧光淬灭基团：Eclipse-3'。
5.如权利要求1所述的microRNA-208b的快速检测方法，其特征在于，所述Taqman探针为：5'-TAMRA-ACA AAC CTT TTG TTC GTC TTA T-Eclipse-3'；
其中，TAMRA染料的激发波长为542nM，发射波长为568nM，且检测步骤中的激发波长和发射波长与所述TAMRA染料的激发波长和发射波长相同。
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