CN106172140A - 一种黄颡鱼雄性化诱导生产xx♂伪雄鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于黄颡鱼育种技术领域，尤其涉及一种黄颡鱼雄性化诱导生产XX♂伪雄鱼的方法，包括如下步骤：1）人工繁殖黄颡仔鱼；2）雄性化诱导；3）获得XX♂伪雄鱼；4）批量生产XX♀仔鱼；5）扩群。本发明具有以下有益效果：利用遗传性别和生理性别早期鉴定技术，实现在性腺分化过程中适时检测转性效果，从而能够较精准地筛选出性腺分化人工调控参数。利用全雌性仔鱼转雄性，能快速高效地批量获得XX♂伪雄鱼，可实现全雌鱼快速扩繁。采用芳香化酶抑制剂LZ和雄性激素MT联合处理方法，更高效地诱导XX雌鱼雄性化。
Description
技术领域
本发明属于黄颡鱼育种技术领域，尤其涉及一种黄颡鱼雄性化诱导生产XX♂伪雄鱼的方法。
背景技术
黄颡鱼的性别决定是雌性配子同型，雄性配子异型，性腺分化时间卵巢要比精巢早。组织学观察表明，卵巢分化的最早形态学标志和细胞学标志分别出现于13 DAH（Daysafter hatching，距孵化出膜的天数）和34 DAH，精巢分化的最早形态形态学和细胞学标志分别出现于55 DAH和64 DAH。鱼类的性别分化具有可塑性，采用激素人工诱导，可以将遗传性别为雄性的仔鱼诱导生理性雌鱼，也可以将遗传性别为雌性的仔鱼诱导为生理性雄鱼（伪雄鱼）。人工诱导XX伪雄鱼（基因型为XX的生理雄鱼）在鲤鱼、泥鳅等全雌鱼的生产中有成功报道。一般方法是在鱼苗性别分化的敏感期，通过雄性激素、芳香化酶抑制剂等药物处理，诱导性腺发育为精巢。不同的鱼类在药物种类、剂量，以及药物处理开始时间和持续时间等方面不同。
黄颡鱼的雄性化可通过雄性激素诱导或者芳香化酶抑制剂处理，17α甲基睾丸酮（MT）和来曲唑（LZ，Letrozole）是常用的雄性化诱导药物。由于黄颡鱼精巢分化晚于卵巢分化，雄性化诱导较雌性化诱导困难。掌握黄颡鱼性腺发育特征和性别分化的关键期鉴定技术，筛选出有效的雄性化药物种类、药物浓度、药物处理开始时间和持续时间，是黄颡鱼雄性化诱导技术的关键。目前，有少量关于黄颡鱼雄性化诱导的报道，但没有获得成功繁殖的XX伪雄鱼，也没有针对不同遗传性别黄颡鱼性腺人工诱导效果鉴定的技术。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种黄颡鱼雄性化诱导生产XX♂伪雄鱼的方法，包括如下步骤：
步骤1）人工繁殖黄颡仔鱼：利用挑选性成熟的野生黄颡鱼亲本XX♀与XY♂，利用常规人工繁殖和孵化技术，获得XX♀和XY♂的仔鱼；
步骤2）雄性化诱导：用17α甲基睾丸酮和来曲唑溶液处理轮虫、卤虫和水蚯蚓投喂步骤1）得到的XX♀和XY♂的仔鱼，轮虫的投放为每天投喂4次，每次相隔6小时，投喂1-2天后，再用卤虫投喂15天后，再用水蚯蚓投喂，投喂量约为鱼体重的3-5%，每天上午、下午和晚上各投喂一次，以半个小时吃完为准，一直喂到76天，养至性成熟，通过外形判定雌雄：雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无；剔除XX ♀，剩XX ♂伪雄鱼和ＸＹ♂；
步骤3）获得XX♂伪雄鱼：利用分子标记，淘汰XY♂，筛选获得XX♂伪雄鱼，同时，采用测交验证，筛选性腺为精巢且具有繁殖能力的XX♂伪雄鱼。
进一步的，还包括4）批量生产XX♀仔鱼：将步骤3）得到的XX♂伪雄鱼与XX♀雌鱼交配，产生XX♀仔鱼；5）扩群：将步骤4）批量生产XX♀仔鱼重复步骤2）和步骤3），批量得到XX♂伪雄鱼。
进一步的，步骤2)所述17α甲基睾丸酮溶液的浓度为30 ugL-1，来曲唑溶液的浓度为50 ugL-1。
进一步的，浓度为30 ugL-1的17α甲基睾丸酮溶液和浓度为50 ugL-1为来曲唑溶液的比例为1:1。
进一步的，步骤3）所述分子标记为
XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；
XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG。
进一步的，步骤3）所述测交验证用成熟的XX♀作为母本。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、利用遗传性别和生理性别早期鉴定技术，实现在性腺分化过程中适时检测转性效果，从而能够较精准地筛选出性腺分化人工调控参数。
2、利用全雌性仔鱼转雄性，可以快速高效地批量获得XX♂伪雄鱼，可实现全雌鱼快速扩繁。
3、采用芳香化酶抑制剂LZ和雄性激素MT联合处理方法，更高效地诱导XX雌鱼雄性化。
附图说明
图1 黄颡鱼雄性化诱导技术原理图；
图2为本发明所述方法的工艺流程图；
图3为利用分子标记检测黄颡鱼基因型的电泳图谱。
如图所示，1-24均代表电泳泳道。
具体实施方式
为了本领域技术人员更好理解和实施本发明，下面结合实施实例对本发明做进一步说明，但所举实例不作为本发明的限定。
实施例1
本发明所述一种黄颡鱼雄性化诱导生产XX♂伪雄鱼的方法，如图2所示，包括如下步骤，
步骤1）人工繁殖黄颡仔鱼：利用挑选性成熟的野生黄颡鱼亲本XX♀与XY♂，利用常规人工繁殖和孵化技术，获得XX♀和XY♂的仔鱼；仔鱼利用活饵培育，首先用轮虫开口，再用卤虫培育至稚鱼期后，投喂剪碎的水蚯蚓。
步骤2）转性参数筛选：选择17α甲基睾丸酮和/或来曲唑作为雄性化诱导药物。每种药物设置高低范围较大的两个浓度梯度进行预实验，估计药物有效浓度范围，再根据预实验结果，设置两个范围较小的浓度梯度，筛选最佳药物浓度。首先，MT药物设置高低范围较大（10ugL-1、60ugL-1）的两个浓度梯度、LZ药物设置高低范围较大（20ugL-1、70ugL-1）的两个浓度梯度进行预实验，估计MT药物有效浓度范围（20-50ugL-1），MT药物有效浓度范围（30-70ugL-1），再根据预实验结果，设置两个范围较小的浓度梯度（MT药物30ugL-1、40ugL-1，LZ药物40ugL-1、50ugL-1）。每次处理设置5个试验组，即对照组、MT低浓度组、MT高浓度组、LZ低浓度组、LZ高浓度组。每个试验组设置3个重复，每组约200尾仔鱼。
采用活饵作为药物载体进行性别调控处理，用17α甲基睾丸酮和来曲唑溶液处理轮虫、卤虫和水蚯蚓投喂步骤1）得到的XX♀和XY♂的仔鱼，轮虫的投放为每天投喂4次，每次相隔6小时，投喂1-2天后，再用卤虫投喂15天后，再用水蚯蚓投喂，投喂量约为鱼体重的3-5%，每天上午、下午和晚上各投喂一次，以半个小时吃完为准，一直喂到76天，养至性成熟，通过外形判定雌雄：雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无；剔除XX ♀，剩XX ♂伪雄鱼和ＸＹ♂。
转性效果鉴定：试验鱼在仔鱼时期利用5L鱼缸试验，进入稚鱼时期后利用60L鱼缸饲养，转性处理结束后的幼鱼转入池塘网箱或者水泥池，饲养至性成熟。在转性过程中以及转性结束后，对各组试验鱼性腺发育情况进行适时取样检测，取样时间根据黄颡鱼性腺发育特征设置，例如，如图1所示，在第7，14，35，56，70DAH时取样。每次取样每组取6尾试验鱼。每尾试验鱼用MS222麻醉后，取尾鳍作为DNA样本，取躯干作为性腺组织样本。鳍条用无水乙醇固定，躯干用5%多聚甲醛固定24h后，转入70%乙醇中保存。采用性别连锁分子标记鉴定仔鱼的遗传性别，筛选区分出XX基因型和XY基因型试验鱼性腺样本，制作石蜡切片。
分子标记的引物为：XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG；通过PCR扩增，得到的X片段大小826bp，Y片段大小955bp。
首先观察描述对照组XX♀基因型和XY♂基因型试验鱼性腺发育特征，再将各试验组XX♀基因型试验鱼性腺组织学特征与对照比较。在XX♀基因型试验鱼的转性过程中，依据是否成功诱导精巢分化、抑制卵巢发育、促进精巢发育、维持精巢发育，判断转性效果，进而，筛选出最佳药物及处理浓度。结合性别连锁标记和石蜡切片，初步推断最佳药物及处理浓度转性为MT药物30ugL-1、LZ药物50ugL-1。将用MT药物30ugL-1、LZ药物50ugL-1处理的鱼种培育至性成熟。利用外形观察淘汰XX♀，养至性成熟，通过外形判定雌雄：雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无。用药物对XX♀仔鱼雄性转化率结果存在三种：1、真正转成功的，即精巢发育和普通精巢发育一样，精子有活力，与雌鱼交配可以繁殖鱼苗；2、转成功了，精巢发育看上去可普通精巢一样，但精子没活力，不能进行繁殖；3、兼性性腺，即同时存在精巢和卵巢情况。本发明计算的转化率为第一种情况。
表1不同浓度的MT和LZ对XX♀仔鱼雄性转化率和成活率的影响
| MT | MT | LZ | LZ | MT30：LZ50=1:1 | 空白对照 | |
| 浓度 | 30ugL-1 | 40ugL-1 | 40ugL-1 | 50ugL-1 | 0ugL-1 | |
| 转化率(%) | 50.1 | 38.5 | 52.6 | 71.2 | 68.4 | 0 |
| 成活率(%) | 56.7 | 45.5 | 43.9 | 37.7 | 51.1 | 61.1 |
步骤3）利用分子标记淘汰XY♂，如图3所示，利用分子标记的引物为：XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG；扩增DNA， 如1-8泳道所示扩增片段长为826bp，为YY基因型，如9-16泳道所示扩增片段为826bp和955bp，为XY基因型，如17-24泳道所示扩增片段955bp，为XX基因型。淘汰XY♂，留XX♂伪雄鱼。采用测交验证，XX♂伪雄鱼与正常XX雌鱼交配，检验其繁殖力，进一步验证转性效果，筛选性腺为精巢且具有繁殖能力的XX♂伪雄鱼。
转性方法优化：经过步骤2和步骤3筛选出的最佳MT和LZ的剂量后，将两种药物按照1:1剂量进行配组，按照步骤2和步骤3的方法，确定MT和LZ混合处理的效果更佳，筛选出XX雌鱼最佳雄性化方法。
规模化应用：获得XX♂伪雄鱼后，采用步骤1批量获得XX♀仔鱼，利用筛选的最佳雄性化方法批量获得XX♂伪雄鱼。XX♂伪雄鱼培育至性成熟后，供应XX♀全雌鱼的规模化生产。为全雌鱼生产提供来源清晰、质量稳定的母父本。
序列表
<110> 武汉百瑞生物技术有限公司
<120> 一种黄颡鱼雄性化诱导生产XX♂伪雄鱼的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattgtagaa gccatctcct tagcgta 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catgtagatc actgtacaat ccctg 25
Claims (6)
1.一种黄颡鱼雄性化诱导生产XX♂伪雄鱼的方法，其包括如下步骤：
步骤1）人工繁殖黄颡仔鱼：利用挑选性成熟的野生黄颡鱼亲本XX♀与XY♂，利用常规人工繁殖和孵化技术，获得XX♀和XY♂的仔鱼；
步骤2）雄性化诱导：用17α甲基睾丸酮和/或来曲唑溶液处理轮虫、卤虫和水蚯蚓投喂步骤1）得到的XX♀和XY♂的仔鱼，轮虫的投放为每天投喂4次，每次相隔6小时，投喂1-2天后，再用卤虫投喂15天后，再用水蚯蚓投喂，投喂量约为鱼体重的3-5%，每天上午、下午和晚上各投喂一次，以半个小时吃完为准，一直喂到76天，养至性成熟，通过外形判定雌雄：雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无；剔除XX ♀，剩XX ♂伪雄鱼和ＸＹ♂；
步骤3）获得XX♂伪雄鱼：利用分子标记，淘汰XY♂，筛选获得XX♂伪雄鱼，同时，采用测交验证，筛选性腺为精巢且具有繁殖能力的XX♂伪雄鱼。
2.根据权利要求1 所述方法，其特征在于，还包括步骤4）批量生产XX♀仔鱼：将步骤3）得到的XX♂伪雄鱼与XX♀雌鱼交配，产生XX♀仔鱼；步骤5）扩群：将步骤4）批量生产XX♀仔鱼重复步骤2）和步骤3），批量得到XX♂伪雄鱼。
3.根据权利要求1 所述方法，其特征在于，步骤2)所述17α甲基睾丸酮溶液的浓度为30ugL-1，来曲唑溶液的浓度为50 ugL-1。
4.根据权利要求3 所述方法，其特征在于，浓度为30 ugL-1的17α甲基睾丸酮溶液和浓度为50 ugL-1为来曲唑溶液的比例为1:1。
5.根据权利要求1 所述方法，其特征在于，步骤3）所述分子标记为 XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；
XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG。
6.根据权利要求1 所述方法，其特征在于，步骤3）所述测交验证用成熟的XX♀作为母本。
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